Name: homogeneous time-resolved förster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion
Uploaded: 2018-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Time-resolved FÃ¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion at JoVE.com

המחברים אין לחשוף.

1. INS-1E תאים: תחזוקה, ציפוי
<ol><li>לשמור על תוספות-1E תאים של humidified 37 ˚C/5% CO2 מגשים, בתרבית בינונית RPMI 1640 בתוספת 5% (v/v) לא פעיל חום העובר שור סרום, 2 מ מגלוטמין, 10 מ מ HEPES, 1 מ מ נתרן פירובט, פניצילין U/mL 100/סטרפטומיצין... פתרון, 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol. התרבות התאים במדיום RPMI 1640 להשלים 10 מ"ל (לכל צלחת), עד שיגיעו למפגש 80-90%, כאשר ניתן trypsinized, passaged או משמש וזמינותו הפרשת אינסולין.</li>
	<li>
יום 1: תשאף מדיה ותרחץ תאים פעם אחת עם 5 מ של PBS ומחוממת מראש. להוסיף 0.5 מ של טריפסין (0.025%) מדולל 1:1 ב- 0.5 מ"ל PBS trypsinize את התאים ואת תקופת דגירה של 3-4 דקות ב 37 הלעפה תרוטרפמט. לבטל טריפסין על-ידי הוספת מדיה מלאה 9 מ ל העברת תאים שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל על-ידי pipetting.</li>
	<li>גלולה תאים על ידי צנטריפוגה, מחדש להשעות בגדר תא בתקשורת כ מ ל טריים.</li>
	<li>לקחת 10 µL של התאים מחדש על תנאי ומערבבים עם 10 µL Trypan Blue צבע חיוני לבדיקת הכדאיות של התא. לספור תאים מתים וחיים µL 10 של תערובת זו באמצעות hemocytometer. רמת הכדאיות צריכה להיות מעל 90%. לדלל את התאים מחדש על תנאי בתקשורת טרי 1 מיליון תאים לכל mL.</li>
	<li>זרע 0.5 mL הארצי-1E תאים לכל טוב בפולי-L-ליזין מצופים מראש צלחת 24-. ובכן, על צפיפות של תאים 500,000/טוב.</li>
	<li>
יום 2: להסיר מדיה 18-24 שעות אחרי ציפוי ולהוסיף 500 µL טוב של מדיה RPMI 1640 טריים. דגירה את התאים עבור עוד 24 שעות לאפשר תאים להחלים לגמרי מהשלב passaging מוקדמת. הפעם נוספים מאפשרת את התאים לפזר בצלחת תרביות רקמה.</li>
</ol>2. אינסולין הפרשת Assay (יום 3)
<ol><li>הכנת מאגר KRB: 132.2 מ מ NaCl, 3.6 מ מ אשלגן כלורי, 5 מ מ NaHCO3, 0.5 מ מ- NaH-2PO-4, MgCl 0.5 מ מ2, 1.5 מ מ CaCl2ו- 0.001 g/mL אלבומין שור (BSA), pH 7.4.</li>
	<li>האחות מדיה מתאי ולשטוף פעמיים עם PBS ומחוממת מראש.</li>
	<li>השלב הרעבה גלוקוז, הוסיפו 450 µL/טוב KRB (המכיל BSA) ללא גלוקוז עבור 1 h-37 ˚C/5% CO2.</li>
	<li>במהלך השלב הרעבה גלוקוז, להכין דילולים טורי של drug(s) ב KRB המכיל 200 מ"מ גלוקוז (10 x ריכוז).<ol>
<li>להכין תרופות 10 x הריכוז הסופי של KRB בתוספת 200 מ"מ גלוקוז (גם 10 x ריכוז הגלוקוז הסופית assay). אם המניה סמים (בנוסף הוסיף 10 x גלוקוז) הוא דימתיל סולפוקסיד, ודא כי אחוז דימתיל סולפוקסיד נשמרת לאורך וזמינותו (אידיאלי הסופי אחוז של פחות מ- 0.1% דימתיל סולפוקסיד).</li>
		<li>עבור טיפולים דופמין quinpirole, להשתמש בטווח ריכוז סמים הסופית assay מיקרומטר 100 100 pM (מהגבוה הריכוז הנמוך ביותר), עם הנקודה האחרונה של התגובה מנה המכילה אין תרופה. ברומוקריפטין, לשימוש מגוון ריכוז הסופית assay 10 מיקרומטר עד השעה 22:00, עם הנקודה האחרונה של התגובה מנה להיות הפקד מסמים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר הרעבה גלוקוז, להוסיף דילולים טורי סמים וזמינותו לייצר תגובה מינון.</li>
	<li>להוסיף µL 50/טוב של דילול טורי כל הבארות המתאים (assay סה כ נפח 500 µL).</li>
	<li>עבור השלב גירוי גלוקוז, תקופת דגירה תאים עם דילולים סדרתי התרופה המתאימה (בנוכחות גלוקוז 20 מ מ) של 90 דקות ב 37 ˚C/5% CO2- כולל קבוצת בקרה בארות: (1) גירוי עם לבד בהיעדר גלוקוז 20 מ מ של כל תרופה נוספת, תאים (2) הם גם גירוי עם סמים ולא גלוקוז (המספק קצב הבסיס של הפרשה).</li>
	<li>לאחר השלב גירוי, הסר בזהירות את supernatants (שימוש ישירות או בחנות הלעפה תרוטרפמט 4). הערה: שלב צנטריפוגה עדין 5 דקות נוספות (x 600 גרם, 1 דקות) עשוי להיות מוצג בשלב זה כדי להסיר כל התאים הנותרים supernatants assay.</li>
</ol>3. HTRF את הפרשת האינסולין מידה
<ol><li>לדלל assay supernatants 1:10 KRB (ללא BSA), רצוי ב- 96-ובכן ברור צלחות.</li>
	<li>להכין את עקומת סטנדרטי של אינסולין וזמינותו אינסולין HTRF (טבלה 1).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פתרון מניות 500 ננוגרם למ"ל</td>
			<td>דילולים טורי</td>
			<td>לעבוד [אינסולין] ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>סטיית תקן 7</td>
			<td>30 מניות µl + 140 µl KRB</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>סטיית תקן 6</td>
			<td>30 µl STD 7 + 45 µl KRB</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>סטיית תקן 5</td>
			<td>30 µl STD 6 + 45 µl KRB</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>מחלת מין 4</td>
			<td>30 µl STD 5 + 45 µl KRB</td>
			<td>9.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 3</td>
			<td>30 µl STD 4 + 45 µl KRB</td>
			<td>3.84</td>
		</tr>
<tr>
<td>סטיית תקן 2</td>
			<td>30 µl STD 3 + 45 µl KRB</td>
			<td>1.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>סטיית תקן 1</td>
			<td>30 µl STD 2 + 45 µl KRB</td>
			<td>0.61</td>
		</tr>
<tr>
<td>סטיית תקן 0</td>
			<td>KRB 45 µl</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">הערה: STD שהמניה 500 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. דילולים טורי כדי להפוך את עקומת סטנדרטי של אינסולין.
<ol start="3"><li>הוסף את הדגימות עיקול רגיל את supernatants assay מדולל לצלחת HTRF. המדד של אינסולין המופרש על-ידי HTRF יכול להתבצע ב 96-ובכן או תבנית צלחת 384-. טוב, במחשבה שיש האחסון assay יותאם מחדש. שימוש 10 µL/טוב דוגמה 96-ובכן לבן חצי-אזור צלחות או 5 µL טוב בצלחת מצומצמות, סיבוב המדרגה 384-ובכן לבן (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להכין נוגדן מיקס במאגר זיהוי (ראה טבלה של חומרים) בתורם 1:2 (cryptate) / יחס מקבל (XL-665). הערה: עוד פרטים ספציפיים לגבי וזמינותו HTRF זמינים מהיצרן.</li>
	<li>מוסיפים נוגדן מיקס וזמינותו 30 µL היטב (עבור תבנית 96 assay טוב-plate) או 15 µL היטב (עבור תבנית assay 384-ובכן צלחת).</li>
	<li>לאטום את הצלחת, דגירה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לקרוא צלחת לאחר 2 h, 4 שעות, ו/או הדגירה לילה עם נוגדנים באמצעות צלחת הקורא את המודול המתאים אופטיים HTRF (337 665 620 ננומטר) (ראה טבלה של חומרים , הוראות היצרן). להגדיר את ההתחלה אינטגרציה 60 µs ויראה אינטגרציה בזמן 400 µs. שימוש 200 לכל טוב. הערה: פרמטרים אלה התבססו על השימוש שלנו קורא מסוים. המדידה-620 ננומטר ולאחר 665 ננומטר עשויים להשתנות בין מכשירים שונים. זה אחד הסיבות שאנו ממליצים להשתמש היחס 665/620. לחישוב היחס הזה, כל ההבדלים הפוטנציאליים מקורא לקורא אפשרות לנרמל ומספקים ערכים עקביים ללא קשר הכלי המשמש למדידת HTRF.</li>
</ol>4. נתוני ניתוח ונורמליזציה
<ol><li>לחשב את ריכוזי אינסולין הבארות assay באמצעות אקסטרפולציה של רציומטרי קריאות קרינה פלואורסצנטית (665 ננומטר/620 ננומטר) לעקומה שניה סדר ריבועית פולינום (איור 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig2.jpg"> איור 2 : עיקול רגיל אינסולין. מלאי אינסולין אנושי של ריכוזים ידועים נעשה שימוש כדי ליצור את עקומת סטנדרטי של אינסולין. היחס HTRF וכתוצאה מכך (665 ננומטר / 620 ננומטר) שורטטו כנגד ריכוז האינסולין. הנתונים היה מיטבית לעקומה שניה סדר ריבועית פולינום (R2 = 0.99996). . זה עיקול רגיל נציג. קווי שגיאה = ב- SEM <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="2"><li>עם נתונים משוערים כמו ng/mL של אינסולין מופרש, לנרמל (אינסולין מופרש בתגובה הגדלת ריכוזים ליגנד) לערך הממוצע של הבארות assay הפרשת אינסולין המרבי (20 מ מ גלוקוז לבד תנאי) %.</li>
	<li>להשתמש את התאמת עקומה (R2) מניסוי יחיד לחישוב וריאציית intraplate. במסגרת הניסוי, נגזר את הערכים הבודדים של2 R הכפילויות התוך ניסיוני, המאפשר חישוב השגיאה הסטנדרטית של הממוצע של העקומה מתאימה.</li>
	<li>לקביעת וריאציית interplate, להשתמש בנתונים לפחות שלושה ניסויים בודדים לחישוב שגיאת התקן של הממוצע עבור הערך2 R של העקומה קולקטיבית.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+Insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+pancreatic+beta-cell+to+treat+diabetes.">Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).</li><li>Despres, J. P., Lemieux, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+obesity+and+metabolic+syndrome.">Abdominal obesity and metabolic syndrome.</a> Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li><li>Barg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+exocytosis+in+insulin-secreting+B-cells+and+glucagon-secreting+A-cells.">Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells.</a> Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).</li><li>Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+regulation+of+insulin+secretion.">Autocrine regulation of insulin secretion.</a> Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).</li><li>Farino, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+insulin+assay+by+homogenous+time-resolved+fluorescence.">Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence.</a> PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).</li><li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-mediated+autocrine+inhibitory+circuit+regulating+human+insulin+secretion+in+vitro.">Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro.</a> Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).</li><li>Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+insulin+and+C-Peptide+sensors+for+rapid+assessment+of+insulin+and+C-peptide+secretion+by+the+islets.">Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets.</a> Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).</li><li>Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+conformational+changes+by+FRET/LRET.">Measuring protein conformational changes by FRET/LRET.</a> Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).</li><li>Degorce, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF((R)):+Pioneering+technology+for+high-throughput+screening.">HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening.</a> Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).</li><li>Degorce, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF:+A+technology+tailored+for+drug+discovery+-+a+review+of+theoretical+aspects+and+recent+applications.">HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications.</a> Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).</li><li>Mathis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF(R)+Technology.">HTRF(R) Technology.</a> J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).</li><li>Daijo, J. E., Sportsman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+for+insulin+in+rodent+plasma.">A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).</li><li>Merglen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensitivity+and+metabolism-secretion+coupling+studied+during+two-year+continuous+culture+in+INS-1E+insulinoma+cells.">Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells.</a> Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+synthesis+and+D3+receptor+activation+in+pancreatic+beta-cells+regulates+insulin+secretion+and+intracellular+[Ca(2+)]+oscillations.">Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations.</a> Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy.">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Dopaminergic+regulation+of+insulin+secretion+from+the+pancreatic+islet.">Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet.</a> Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).</li><li>Rubi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D2-like+receptors+are+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+mediate+inhibition+of+insulin+secretion.">Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion.</a> J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+dopamine+d2+receptor+impairs+insulin+secretion+and+causes+glucose+intolerance.">Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance.</a> Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+endocrine+and+metabolic+roles+of+dopamine+D2+receptors+gained+from+the+Drd2+mouse.">New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse.</a> Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).</li><li>Lopez Vicchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+drugs+in+type+2+diabetes+and+glucose+homeostasis.">Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis.</a> Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).</li><li>Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine:+The+forgotten+felon+in+type+2+diabetes.">Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes.</a> Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).</li><li>Mahajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromocriptine+mesylate:+FDA-approved+novel+treatment+for+type-2+diabetes.">Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes.</a> Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).</li><li>Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+and+autocrine+interactions+in+the+human+islet:+more+than+meets+the+eye.">Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).</li><li>Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathophysiology+of+metabolic+effects+of+antipsychotic+medications.">Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications.</a> Trends Endocrinol Metab. , (2014).</li><li>Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+antipsychotic+drug-induced+metabolic+dysfunction+in+schizophrenia.">Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia.</a> Front Neurosci. 11, 432 (2017).</li><li>de Leeuw van Weenen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+receptor+D2+agonist+bromocriptine+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+by+direct+activation+of+the+alpha2-adrenergic+receptors+in+beta+cells.">The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).</li></ol>

אנו מודים ניקולס פייר (Cisbio Bioassays) לקבלת עצות מועילות, ד ר פייר Maechler (אוניברסיטת ז'נבה) בנדיבות מתן תוספות-1E תאים. עבודה זו נתמכה על ידי מימון של משרד ההגנה (גרנט PR141292 כדי Z.F.), ואת John F. ננסי א Emmerling קרן של קרן פיטסבורג (ל Z.F.).

וזמינותו אינסולין HTRF המתוארים כאן מציע מערכת מהירה, יעילה כדי למדוד את הפרשת האינסולין ממערכת מבוססי תאים בתרבית. בין היתרונות החשובים ביותר שלה, זו assay מציע אות רקע נמוך בשל יחס אות לרעש גבוה. בנוסף, יש לנו אישר כי האות HTRF הוא יציב במשך פרקי זמן ארוכים (> 24 שעות ביממה)7. עם זאת, מאז נוגדנים חד-שבטיים אינסולין מחייב להגיע במהירות איגוד רוויה לאחר תוספת וזמינותו, קינטיקה של הנוגדן מחייב עשוי להיות מושפע טמפרטורת הסביבה או וריאציות על ידי רמות האינסולין. לפיכך, אנו קוראים את הצלחת assay בנקודות זמן מרובים (2 h 4 h, לילה) כדי לזהות במדויק כאשר הנוגדנים הגיעו לרוויה מלאה, HTRF אות היא החזקה ביותר7. אנחנו גם לאחרונה הראו שהנוגדנים אינסולין לא cross-react באופן משמעותי עם פרואינסולין או c-פפטיד, רומז וזמינותו הוא מאוד ספציפיות עבור אינסולין בוגרים7.
צעד חשוב באופטימיזציה של וזמינותו מעורב בהקמת טווח דינמי רחב של הפרשת האינסולין. טווח דינמי זה מוגדר ההבדל שזוהו אינסולין במהלך הבזליים (unstimulated) לעומת הפרשת האינסולין מגורה. אנו מוצאים צעד הרעבה גלוקוז קצר הראשונית (גלוקוז מ מ 0, 1 h) שקדמו גלוקוז גבוהות גירוי מרחיב את טווח דינמי על-ידי הטרמה התאים הארצי-1E להפריש יותר אינסולין במהלך GSIS. עבודה קודמת, הראנו טווח דינמי של וזמינותו להיות 0.17 ng/mL (גבול של זיהוי) עד גבוה כמו אינסולין ng/mL ~ 110 עם אות לרעש יחס של 10.027. בנוסף, כמות האינסולין המופרש היא תלויה מספר הטלפון הראשונית מצופה לכל טוב. אנחנו עוד יותר אופטימיזציה וזמינותו על ידי האחדת את passaging וטיפול של התאים הארצי-1E. שמירה על עקביות passaging בלוח הזמנים, ציפוי בסוג צלחת ספציפיים (למשל, מנות 10 ס מ) חיוני להשגת רמות האינסולין המופרש עקבית.
בין מקורות פוטנציאליים של assay השתנות מבעבע בפתרונות assay אשר משבשת המדידה HTRF. מקור חשוב של הבועות האלה היא הנוכחות של שור אלבומין (BSA) בפתרונות מבוססי KRB assay שונים. כדי לפתור בעיה פוטנציאלית זו, צמצום או אפילו ביטול BSA באופן משמעותי ממזער את בועות בפתרון ומשפר לכן אמינות האות HTRF. הדבר חשוב במיוחד בעת יצירת אינסולין עיקול רגיל של דילולים סמים. תא המעבר תלויי-מספר הבדלים הפרשת האינסולין הבזליים הם מקור אחר ההשתנות assay פוטנציאליים (נתונים לא מוצג). . זה עקבי עם עבודה קודמת על ידי Merglen ועמיתיו שהציע גם את הפרשת האינסולין אופטימלית נמצא בין תוספות-1E תא המעבר מספרים ~ 60-10015. לכן, כדי למזער את השתנות אפשרית של הפרשת האינסולין הקשורים תא המעבר מס, אנו ממליצים הגבלת הפרשת מבחני לטווח המעבר הזה תא מוגדרים היטב.
המגבלה העיקרית של וזמינותו הפרשת אינסולין מבוססת תא הוא ההשתנות של הפרשה הבזליים מהותי התאים הארצי-1E. זו עשויה להיות קשורה התאים הורמון האינסולין גדל מחוץ להקשר פיזיולוגיים של הלבלב איון. ואכן, סוגי תאים אחרים בתוך איון כולל אלפא ודלתא תאים מפרישים גורמים רבים יכולים לווסת את הפרשת האינסולין הבזליים ו מאולצת של תאי ביתא באופן מקומי, paracrine25. בהיעדר אלה סוגי תאים אחרים של איון עשויים להפריע ברגולציה הדוקה של הפרשת אינסולין, שמוביל השתנות גדולה יותר מאשר אחרת נצפתה פיזיולוגית. הגבלה פוטנציאלי נוסף הוא קטן יחסית לינארית טווח וזמינותו, מאז אינסולין מופרש בתגובה גלוקוז 20 מ מ היה קולח כמעט במקרים מסוימים. כתוצאה מכך, supernatants תא מדולל, ההשפעות של אינסולין secretagogues על הפרשת האינסולין מגורה עשוי להיות מתוך החלק הליניארי של עקומת כיול. זה הוא, עם זאת, obviated על ידי דילול את תגובת שיקוע המכילות אינסולין מספיק כדי לאפשר האינסולין ליפול לתוך הטווח ליניארי של עקומת כיול.
אנחנו אומת assay שלנו על-ידי מציג את agonism של דופמין D2-כמו רצפטורים באמצעות דופמין, ברומוקריפטין וטיפולי quinpirole עכבות GSIS באופן תלוי-ריכוז. נתונים אלה אפשרה לנו לקבוע תכונות פרמקולוגיות של תרופות אלו (קרי, IC50 והיעילות) מבחינת השפעתם על GSIS. התוצאות שלנו עקביים עם גוף גדל והולך של הראיות המצביע תפקיד חשוב דופמין, דופאמין איתות מחוץ מערכת העצבים המרכזית20,21,22,26, 27. ראוי לציין, הממצאים שלנו להראות את זה. את הדופמין D2-קולטן אגוניסט ברומוקריפטין מנע בעוצמה מעכב GSIS, ובכל זאת אושרה על ידי ה-FDA לטיפול בסוכרת סוג 224לאחרונה, מעלה את השאלה החשובה: כיצד לטפל סמים זה באפשרותך להקליד 2 סוכרת (T2D) אם זה מוריד הפרשת אינסולין, לפחות בחריפות? הסבר אפשרי אחד עשויה להיות קשורה הקיבולת של ברומוקריפטין סף "תאי בטא לנוח." על פי השערה זו, שכן הוא אחת התכונות קרדינל של T2D oversecretion הכוללת של אינסולין, כי בסופו של דבר עשוי לתרום כשל תאי בטא28. יתר על כן, אנו מציעים האינסולין oversecretion במהלך T2D עשוי להחריף גם תנגודת לאינסולין על ידי צמצום הרגישות לאינסולין של איברים לרבות שרירי השלד, הכבד, רקמת שומן. לפיכך, חסימה או הולכת ופוחתת GSIS עלול לגרום resensitization הדרגתית של רקמות אלה היעד, שהופך אותם קשובים יותר אינסולין, ובכך שיפור הרגישות לאינסולין. יש מערכת assay נוטה תפוקה גבוהה ההקרנה פותח הדלת לעבודה עתידית לשניהם לנתח את איתות המסלולים תאיים מתווכת על-ידי דופאמין D2-כמו רצפטורים בתאי בטא בלבלב, אשר אחראים על paracrine / autocrine GSIS עיכוב גם לגבי נוסף להסבר מנגנון שבאמצעותו עשוי תרופות כמו ברומוקריפטין לשפר את הסימפטומים של סוכרת.
התפתחות assay הפרשת אינסולין מבוססת-תא זה מנצל טכנולוגיה HTRF הפרשת האינסולין ומייצגת את התקדמות משמעותית בזיהוי מהיר ויעיל של אינסולין-באופן משמעותי מופחתת עלות יחסית ו/או גדול יותר בטיחות לעומת בוגרים מבחני זיהוי של אינסולין, להסתמך על ריאה גישות מבוססות-אליסה. ואכן, על פי מבחני אינסולין ELISA ו- RIA הן וזהובה רגיש וספציפי וזמינותו אינסולין HTRF, הטבע הומוגנית של הזיהוי, מבטל צעדים כביסה נוספים רבים נוכח אלה אחרים assay מערכות7. יתר על כן, היציבות היחסית של האות HTRF מספק יתרון מפתח נוסף למדידה אינסולין אמין.
יחדיו, את HTRF assay הפרשת אינסולין יש את היכולת של האפליה במהירות בין המאפיינים תרופתי בתרופות מרובות בהקשר של הפרשת האינסולין הסלולר. יתר על כן, של assay הזה יחסית קלות השימוש ואת אותות חזקים להגיע לשכנוע ההקרנה תפוקה גבוהה

ויסות חילוף החומרים האנרגיה יסודי על ידי הורמון אנאבולי הגדולות, אינסולין. אינסולין מסונתז והוא שוחרר על ידי בתאי בטא בלבלב כתגובה רמות גלוקוז מוגברת חוץ-תאית. האינסולין שפורסמו מפעיל את קליטת הגלוקוז על ידי רקמות הרגישים אינסולין1,2. מבחינה פיזיולוגית, זה מקושר את העלאת ריכוז הגלוקוז לאחר ארוחה, ואחריו הפרשת אינסולין כדי לווסת את ספיגת הגלוקוז. הפרעות גלוקוז הומאוסטזיס להוביל ליקויי מטבולית לשיאה תנגודת לאינסולין, ובסופו של דבר בתחילתה של סוג 2 סוכרת2,3,4.
למרות הפרשת האינסולין נחקרה בהרחבה, את מנגנוני הרגולציה נותרים ממעטים להבין. אזור קריטי של החקירה היה זיהוי של הרומן מאפננים הפרשת האינסולין על ידי בתאי בטא5,6,7,8. מחקרים אלו דורשות הבנה טובה יותר של הקשר צימוד בין גלוקוז גירוי הפרשת האינסולין. לכן, היכולת לפקח במדויק ולכמת את רמות הפרשת האינסולין מגורה-גלוקוז (GSIS) היה חיוני. עם זאת, עד כה, רק מספר מצומצם של שיטות היו זמינות לאפשר כימות של GSIS באמצעות הורמון האינסולין שורות תאים ו/או לנגרהנס. אחד הוא רדיו אימונולוגי (RIA), אשר מנצל אינסולין מתויג radioisotope, נוגדנים. המגבלות העיקריות של גישה זו כוללות בעיות בטיחות עקב טיפול לסילוק חומרים רדיואקטיביים. בנוסף, שיטה זו היא מהגידולים, מעורבים מרובים כביסה ארוך והשלבים הדגירה. מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) הוא גישה יקר, עתירי עבודה אחרת אשר מנצל נוגדנים לגילוי אינסולין. וריאציה נוגדן הזיקות, היעילות של זיהוי אינסולין המגבילים את הגורמים של שיטה זו, והוא יכול להשפיע על הפארמצבטית את התוצאות. אליסה וגם ריאה תוכנן עבור ניסויים תפוקה גבוהה. AlphaScreen הוא assay הומוגנית המשמש עבור איתור של מדידת רמות של הפרשת האינסולין. AlphaScreen הטכנולוגיה מבוססת על ההמרה של תאורת הסביבה חמצן לתוך מצב גופיה חמצן נרגש זה יכול להגיב עם מינים chemiluminescent, וכתוצאה מכך הדור של chemiluminescence. מכיוון וזמינותו היא הומוגנית, רבים מן השלבים כביסה המשויך ריאה ואליסה נמחקות. אולם, חוסר היציבות של האות בשל אופיו של התגובה היא גורם מגביל שעשויים להשפיע על המדידה של וזמינותו. (TR-מלקחיים, שפותחה על ידי Heyduk ועמיתיו9, היא גישה הומוגנית נוספת למדידה אינסולין בהתבסס על הכריכה של שני נוגדנים נפרד epitopes שונים על מולקולת האינסולין. הנוגדנים הם כל הדנ א תקועים מבחינה כימית מקושר כפול עם קצר משלימים יחיד נטושים DNA המסוכך. איגוד של הנוגדנים לאינסולין מפגיש ביניהם ומוביל דופלקס DNA כפול נטושים. כל נוגדן קשורה גם fluorophore בהתאמה תורם או מקבל, איגוד דופלקס ה-DNA מפגיש את אלה fluorophores כדי ליצור העברת האנרגיה של תהודה פורסטר (סריג). מגבלה אפשרית אחת של TR-מלקחיים, עם זאת, מוטלת סריג עצמה. חוסר היכולת להפיג במהירות רקע זריחה במהלך התגובה סריג עשוי להוביל רמות גבוהות יחסית של קרינה פלואורסצנטית רקע אות חלש ליחס רעש בתוך וזמינותו. לכן, צריך עדיין קיימת עבור וזמינותו אמין, חזקה וחסכונית לכימות תנועת GSIS באופן תפוקה גבוהה.
התפתחויות אחרונות ביופיזיקה יש לשיאה התפתחות assay העברה (HTRF) המבוסס על תהודה זריחה זמן לפתור הומוגנית אנרגיה. באופן ספציפי, בזמן העברת האנרגיה בתוך וזמינותו ייתכן שתואר מבוסס סריג, ליתר דיוק, ש-HTRF מסתמך על הפריה חוץ גופית אנרגיה תהודה העברה (LRET)10 אשר ההעברה הלא-קרינה של אנרגיה בין התורם מקבל מינים11,12,13. ההבחנה זו חשובה, מאז העיתוי של פלורסצנטיות או להרוות מבוסס סריג אינטראקציה היא שונה בהרבה מאשר LRET, למרות אותם סוגים של gating יכול לשמש עבור סריג ו- LRET. יתר על כן, השימוש נדיר earth לנתניד cryptate תרכובות כגון אירופיום או טרביום cryptate ב HTRF מייצר קרינה פלואורסצנטית זמן מחצית החיים12,14. זה מציע את היתרון הייחודי של המבוא של השהיית זמן (µsec) בין התורם עירור מדידת פליטת מ מקבל (קרי, זמן לפתור assay). השהיית הזמן מאפשר זמן מספיק רקע זריחה להתפוגג לפני המדידה של מקבל פליטת קרינה פלואורסצנטית. כתוצאה מכך, המדידה היא ללא קרינה פלואורסצנטית שאינם ספציפיים, לפיכך, יחס אות לרעש גבוה מושגת (איור 1). יתר על כן, הטבע הומוגנית של HTRF מבטל את הצורך לכביסת צעדים לשטוף את המין לא מאוגד, ביצוע וזמינותו הרבה מהירה יותר מאשר אליסה או שיטות מבוססות-ריאה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig1.jpg"> איור 1: סכימטי של המנגנון לגילוי אינסולין HTRF. שני נוגדנים חד-שבטיים באופן עצמאי שנוצר במיוחד מזהה, לאגד אינסולין באתרים נפרדים. נוגדנים אלה הם מצומדת התורם cryptate אירופיום או מקבל את XL665. עירור של התורם 337 תוצאות nm בפליטה-620 ננומטר. העברת אנרגיה וכתוצאה מכך גורמת XL665 לפלוט על אורך גל ארוך יותר, 665 ננומטר. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור משתמש בגישה מבוססת-HTRF כדי לקבוע את הרמות של GSIS מתאי הארצי-1E, ומבוססת הורמון האינסולין תאי בטא-derived עכברוש אינסולינומה תא קו15. בנוסף, וזמינותו הזה עשוי לשמש לזיהוי לפרופיל תרופתי של ווסתי מולקולרית של הפרשת האינסולין. אנו מיישמים את זה אינסולין מבוססי HTRF assay לבחון דופמין D2-כמו ויסות הקולטן GSIS. הגדלת מחקרים גילו כי הנוירוטרנסמיטר דופמין היא הרגולטור חשוב של GSIS8,16,17,18,19,20, 21 , 22. דופמין משפיע על GSIS בצורה autocrine/paracrine נגטיבית באמצעות פעולות על דופמין D2-כמו רצפטורים (D2, D3, קולטנים4 D) בא לידי ביטוי על פני השטח של תאי הלבלב בטא8 , 16 , 19. אנו שימוש assay זו, לאשר את תפקידו של הדופמין כרגולטור שלילי של GSIS, ידגים את השיטה דופמין D2-כמו ברומוקריפטין אגוניסטים לקולטן, quinpirole גם להפחית GSIS.

<table><tbody><tr><td>96-well white half area plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-042</td><td></td></tr><tr><td>384-well white low-volume, round-bottom plate</td><td>Corning</td><td>15100157</td><td></td></tr><tr><td>Insulin High Range Kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62IN1PEH&amp;nbsp;</td><td>10,000 test HTRF-based insulin assay kit</td></tr><tr><td>PHERAstar FSX plate reader</td><td>BMG Labtech</td><td>FSX</td><td>Plate reader adapted for HTRF-based assay readings</td></tr><tr><td>Plate sealers</td><td>Fisher Scientific</td><td>DY992</td><td>To seal plate while antibodies incubate</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1x)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11875-093</td><td>[+] L-glutamine</td></tr><tr><td>Trypsin 0.05%&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td>0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Without calcium and magnesium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>156-30-080</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin solution 100x</td><td>Corning</td><td>30-002 CT</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M1348</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Dopamine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>8502</td><td></td></tr><tr><td>Bromocriptine mesylate</td><td>Tocris</td><td>427</td><td></td></tr><tr><td>(-)-Quinpirole hydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr></tbody></table>

homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion

הגילוי של הפרשת האינסולין הוא קריטי עבור שחקרתי מנגנוני הפרשת מוסדרים גם כמו מחקרים של חילוף החומרים. על פי מבחני אינסולין רבות קיימות כבר עשרות שנים, התפתחות הטכנולוגיה פורסטר תהודה אנרגיה העברה (HTRF) זמן לפתור הומוגנית האחרונות פישטה משמעותית מדידות אלה. זהו מהיר, חסכוני, הדירים חזקים אופטי assay על נוגדנים מצומדת כדי fluorophores בהיר עם פליטה לאורך זמן המאפשרת זמן לפתור פורסטר תהודה אנרגיה העברה. יתר על כן, גילוי האינסולין HTRF הוא לשכנוע הפיתוח של מבחני המיון תפוקה גבוהה. כאן אנו משתמשים HTRF כדי לזהות את הפרשת האינסולין בתאים הארצי-1E, קו תא אינסולינומה-derived חולדה. זה מאפשר לנו להעריך את רמות הבסיס של אינסולין בתגובה לגירוי הגלוקוז שלהם לשינויים. בנוסף, אנו משתמשים זו מערכת איתור של אינסולין כדי לאשר את התפקיד של דופמין כרגולטור שלילי של הפרשת האינסולין מגורה-גלוקוז (GSIS). באופן דומה, אחרים דופמין D2-כמו אגוניסטים לקולטן, quinpirole ו ברומוקריפטין, להפחית GSIS באופן תלוי-ריכוז. התוצאות שלנו להאיר את התועלת של התבנית HTRF assay אינסולין בקביעת את התפקיד של תרופות רבות GSIS ופרופילים תרופתי שלהם.

אנחנו לאמת שלנו assay HTRF האינסולין על ידי יצירת מעגל אינסולין רגיל באמצעות אינסולין אנושי מטוהרים סטנדרטים של ריכוזים מוגדרים מראש (איור 2). הדור של העקומה רגיל מותר לנו להסיק שהקריאות זריחה רציומטרי ובכך לקבוע את רמות האינסולין המופרש כתגובה הטיפולים סמים (איור 2). Intraplate וריאציה על פריסטלטיות הייתה מינימלית (R2 = ± 0.99996 5.0 x 10-5) היה וריאציית interplate (R2 = ± 0.947 5.5 x 10-5; n = 3 צלחות).
אנחנו הבא נקבע את רמות הבסיס של הפרשת האינסולין מתאי הארצי-1E. באמצעות צפיפות זריעה של 5 x 105 תאים לכל טוב בתבנית צלחת 24-. ובכן, מצאנו כי תאים מופרש 54.53 ± 2.2 ng/mL של אינסולין בהיעדר גלוקוז על משך הדגירה 90 דקות באמבט סטטי. תוספת של גלוקוז 20 מ מ כדי לעורר GSIS הביא שיפור משמעותי ב- GSIS (112.4 ± 5.2 ng/mL אינסולין; p < 0.0001) (איור 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig3.jpg"> איור 3 : הערכה של הבסיס לעומת הפרשת האינסולין מאולצת. תוספות-1E תאים טופלו העדר או הנוכחות של גלוקוז גבוהות (20 מ מ) גירוי במשך 90 דקות. הכפלת ברמות הפרשת אינסולין זוהה בתגובה גירוי גלוקוז גבוהות יחסית תאי unstimulated (הפרשת הבזליים תנאי; * * * p < 0.0001, דו-זנבית אינטראקצית t-מבחן). N = 5; כל מבחני בוצעו ב- triplicates. קווי שגיאה = ב- SEM <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
כדי לחקור את התפקיד של דופאמין D2-כמו קולטן לגירוי ב GSIS בתוך המערכת שלנו תא תוספות-1E, אנחנו מודגרות תאים בנוכחות D2-כמו סמים אגוניסט קולטן (דופמין, quinpirole ו ברומוקריפטין) במהלך 90-מין תקופת גירוי עם גלוקוז 20 מ מ (איור 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig4.jpg"> איור 4 : HTRF זיהוי של דופמין D2 -אוהב את קולטן עיכוב אגוניסט של GSIS. תוספות-1E תאים שטופלו הגדלת ריכוזים של דופמין D2-כמו אגוניסטים לקולטן במשך 90 דקות בנוכחות גלוקוז גבוהות (20 מ מ; הלעפה תרוטרפמט 37). (א) דופמין עכבות GSIS IC50= מיקרומטר ± 3.9 1.78 (R2 = 0.4355). (B) ברומוקריפטין היה יותר חזק מאשר דופמין בהפחתת GSIS (IC50 = 13.9 ± 2.4 nM, R2 = 0.7501). (ג) העוצמה של Quinpirole היה דומה דופמין (IC50 = 3.3 ± 3 מיקרומטר, R2 = 0.3617). כל הנתונים היו מיטבית לעקומה בכושר sigmoidal 3-פרמטר. ' 0 מ"מ גלוקוז ' נקודת ציון הפרשת האינסולין הבזליים על ידי תאים הארצי-1E בהיעדרו של גירוי גלוקוז גבוהות (20 מ מ). N > 3; כל מבחני בוצעו ב- triplicates בימים נפרדים ניסיוני. קווי שגיאה = ב- SEM <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
היעילות ואת העוצמה של תרופות אלו אגוניסט נקבע על-ידי יצירת גרפים העקומות הפרשת אינסולין. . מצאנו את זה בהיעדר גירוי עם גלוקוז גבוהות, התאים הארצי-1E המשיכה להפריש אינסולין, אם כי במידה ניכרת התחתון (שצוין על-ידי מצב 0 מ מ), בקנה אחד עם מוקדם יותר דוחות15. התוצאות שלנו הוכיחה את הדופמין, אגוניסט אנדוגני של D2-כמו רצפטורים, עכבות GSIS באופן תלוי-concertation (DA IC50 = מיקרומטר 1.78 ± 3.9; איור 4A). לעומת זאת, ברומוקריפטין, תרופה שאושרה לטיפול סוג 2 סוכרת23,24, הייתה ניכרת יותר חזק מאשר דופמין לייצר עכבות GSIS (IC50 = ± 2.4 13.9 ננומטר; איור 4B). לבסוף, אם כי פחות יעיל מאשר ברומוקריפטין, quinpirole הציג את עוצמת האנרגיה דומה דופמין ב GSIS עיכוב (IC50 = מיקרומטר 3.3 ± 3; איור 4C).

Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Time-resolved FÃ¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion at JoVE.com

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

כאן, אנו מציגים הומוגנית זמן נפתרה תדאג (HTRF) בתור שיטה יעילה לגילוי מהיר של אינסולין מופרש מתאי.

פורסטר זמן לפתור הומוגנית תהודה אנרגיה מבוססת על העברת Assay גילוי של הפרשת האינסולין

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

homogeneous-time-resolved-frster-resonance-energy-transfer-based

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

9.1K Views.  University of Pittsburgh. כאן, אנו מציגים הומוגנית זמן נפתרה תדאג (HTRF) בתור שיטה יעילה לגילוי מהיר של אינסולין מופרש מתאי.

Video: Homogeneous Time-resolved Förster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and amino acids. However, the innate weak signal intensity of FRET sensors is a major challenge that prevents their application in various fields and makes the use of expensive, high-end fluorometers necessary. Previously, we built a cost-effective, high-performance FRET analyzer that can specifically measure the ratio of two emission wavelength bands (530 and 480 nm) to achieve high detection sensitivity. More recently, it was discovered that FRET sensors with bacterial periplasmic binding proteins detect ligands with maximum sensitivity in the critical temperature range of 50 - 55 &#176;C. This report describes a protocol for assessing sugar content in commercially-available beverage samples using our portable FRET analyzer with a temperature-specific FRET sensor. Our results showed that the additional preheating process of the FRET sensor significantly increases the FRET ratio signal, to enable more accurate measurement of sugar content. The custom-made FRET analyzer and sensor were successfully applied to quantify the sugar content in three types of commercial beverages. We anticipate that further size reduction and performance enhancement of the equipment will facilitate the use of hand-held analyzers in environments where high-end equipment is not available.

This protocol describes the rapid and highly sensitive quantification of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensor data using a custom-made portable FRET analyzer. The device was used to detect maltose within a critical temperature range that maximizes detection sensitivity, enabling practical and efficient assessment of sugar content.

רגיש מאוד מהיר קרינת איתור עם Analyzer Portable סריג

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. Screening peptides affords an additional layer of complexity as conventional tip-based sample handling methods expose peptides to a large surface area of plasticware, providing an increased opportunity for peptide loss via adsorption. Preventing excessive exposure to plasticware reduces peptide loss via adherence to plastics and thus minimizes inaccuracies in potency prediction, and we have previously described the benefits of non-contact acoustic dispensing for in vitro high-throughput screening of peptide agonists1. Here we discuss a fully integrated automation solution for non-contact acoustic preparation of peptide serial dilutions in microtiter plates utilizing the example of screening for peptide agonists at the mouse glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). Our methods allow for high-throughput cell-based assays to screen for agonists and are easily scalable to support increased sample throughput, or to allow for increased numbers of assay plate copies (e.g., for a panel of more target cell lines).

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

FIBS מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Bioengineering

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to cytokines and growth factors. STAT proteins are activated by tyrosine phosphorylation mediated mainly by JAKs. The abnormal activation of STAT signaling pathways is implicated in many human diseases, especially cancer and immune-related conditions. Therefore, the ability to monitor STAT protein phosphorylation within the native cell signaling environment is important for both academic and drug discovery research. The traditional assay formats available to quantify phosphorylated STAT proteins include western blotting and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). These heterogeneous methods are labor-intensive, low-throughput, and often not reliable (specific) in the case of western blotting. Homogeneous (no-wash) methods are available but remain expensive. 
Here, detailed protocols are provided for the sensitive, robust, and cost-effective measurement in a 384-well format of endogenous levels of phosphorylated STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699), and STAT6 (Y641) in cell lysates from adherent or suspension cells using the novel THUNDER time-resolved F&#246;rster resonance energy transfer (TR-FRET) platform. The workflow for the cellular assay is simple, fast, and designed for high-throughput screening (HTS). The assay protocol is flexible, uses a low-volume sample (15 &#181;L), requires only one reagent addition step, and can be adapted to low-throughput and high-throughput applications. Each phospho-STAT sandwich immunoassay is validated under optimized conditions with known agonists and inhibitors and generates the expected pharmacology and Z'-factor values. As TR-FRET assays are ratiometric and require no washing steps, they provide much better reproducibility than traditional approaches. Together, this suite of assays provides new cost-effective tools for a more comprehensive analysis of specific phosphorylated STAT proteins following cell treatment and the screening and characterization of specific and selective modulators of the JAK/STAT signaling pathway.

Time-resolved F&#246;rster resonance energy transfer cell-based assay protocols are described for the simple, specific, sensitive, and robust quantification of endogenous phosphorylated signal transducer and activator of transcription (STAT) 1/3/4/5/6 proteins in cell lysates in a 384-well format.

בדיקות העברת אנרגיה תהודה Förster נפתר זמן למדידה של חלבונים STAT זרחן אנדוגני בתאים אנושיים

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and diabetes treatment. However, challenges remain in obtaining stem cell-derived beta cells that adequately mimic native human beta cells. Building upon previous studies, hPSC-derived islet cells have been generated to create a protocol with improved differentiation outcomes and consistency. The protocol described here utilizes a pancreatic progenitor kit during Stages 1-4, followed by a protocol modified from a paper previously published in 2014 (termed "R-protocol" hereafter) during Stages 5-7. Detailed procedures for using the pancreatic progenitor kit and 400 &#181;m diameter microwell plates to generate pancreatic progenitor clusters, R-protocol for endocrine differentiation in a 96-well static suspension format, and in vitro characterization and functional evaluation of hPSC-derived islets, are included. The complete protocol takes 1 week for initial hPSC expansion followed by ~5 weeks to obtain insulin-producing hPSC islets. Personnel with basic stem cell culture techniques and training in biological assays can reproduce this protocol.

The differentiation of stem cells into islet cells provides an alternative solution to conventional diabetes treatment and disease modeling. We describe a detailed stem cell culture protocol that combines a commercial differentiation kit with a previously validated method to aid in producing insulin-secreting, stem cell-derived islets in a dish.

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לצברי איים מייצרי אינסולין

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

Developmental Biology

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

מבחני Electrochemiluminescence עבור האדם איון עצמיים

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Immunology and Infection

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

Assay כמותי עבור אינסולין להביע המושבה יוצרי אבות

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Biology

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, depending on the specific assay. Secreted luciferase assays expedite results and lower the assay cost per sample substantially. Here we present a relatively underused approach to gauge insulin secretory activity from pancreatic &#946; cells by using Gaussia luciferase genetically inserted within the C-peptide. During proteolytic processing of proinsulin, the C-peptide is excised releasing the luciferase within the insulin secretory vesicle where it is co-secreted with insulin. Results can be obtained within minutes after sample collection because of the speed of luciferase assays. A limitation of the assay is that it is a relative measurement of insulin secretion and not an absolute quantitation. However, this protocol is economical, scalable, and can be performed using most standard luminescence plate readers. Analog and digital multichannel pipettes facilitate multiple steps of the assay. Many different experimental variations can be tested simultaneously. Once a focused set of conditions are decided upon, insulin concentrations should be measured directly using antibody-based assays with standard curves to confirm the luciferase assay results.

This protocol describes how to perform rapid low-cost luciferase assays at medium-throughput using an insulin-linked Gaussia luciferase as a proxy for insulin secretion from beta cells. The assay can be performed with most luminescence plate readers and multichannel pipettes.

מדידת הפרשת אינסולין יחסית באמצעות מחליף שכונתיות לוציפראז

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

אירועי איתות תוך-תאי והפרשת הורמונים בפסאודואיסטים אנושיים

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, have a central role in the control of glucose homeostasis through the secretion of insulin by beta cells, which lowers blood glucose, and glucagon by alpha cells, which raises blood glucose. Intracellular signaling pathways, including those mediated by cAMP, are key for regulated alpha and beta cell hormone secretion. The 3D islet structure, while essential for coordinated islet function, presents experimental challenges for mechanistic studies of the intracellular signaling pathways in primary human islet cells. To overcome these challenges and limitations, this protocol describes an integrated live-cell imaging and microfluidic platform using primary human pseudoislets generated from donors without diabetes that resemble native islets in their morphology, composition, and function. These pseudoislets are size-controlled through the dispersion and reaggregation process of primary human islet cells. In the dispersed state, islet cell gene expression can be manipulated; for example, biosensors such as the genetically encoded cAMP biosensor, cADDis, can be introduced. Once formed, pseudoislets expressing a genetically encoded biosensor, in combination with confocal microscopy and a microperifusion platform, allow for the synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and alpha and beta cell hormone secretory profiles to provide more insight into cellular processes and function.

Author Spotlight: Investiting Islet Abnormalities and Function with a Pseudoislet Protocol 

This protocol describes a method for the synchronous acquisition and co-registration of intracellular signaling events and the secretion of insulin and glucagon by primary human pseudoislets using the adenoviral delivery of a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor, a cAMP difference detector in situ (cADDis), and a microperifusion system.

מערכת פסאודואיסלט אנושית להערכה סינכרונית של דינמיקה ביו-חיישנית פלואורסצנטית ופרופילי הפרשת הורמונים

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

פורסטר זמן לפתור הומוגנית תהודה אנרגיה מבוססת על העברת Assay גילוי של הפרשת האינסולין

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

רגיש מאוד מהיר קרינת איתור עם Analyzer Portable סריג

אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און

FIBS מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל

בדיקות העברת אנרגיה תהודה Förster נפתר זמן למדידה של חלבונים STAT זרחן אנדוגני בתאים אנושיים

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לצברי איים מייצרי אינסולין

מבחני Electrochemiluminescence עבור האדם איון עצמיים

Assay כמותי עבור אינסולין להביע המושבה יוצרי אבות

מדידת הפרשת אינסולין יחסית באמצעות מחליף שכונתיות לוציפראז

מערכת פסאודואיסלט אנושית להערכה סינכרונית של דינמיקה ביו-חיישנית פלואורסצנטית ופרופילי הפרשת הורמונים

מערכת פסאודואיסלט אנושית להערכה סינכרונית של דינמיקה ביו-חיישנית פלואורסצנטית ופרופילי הפרשת הורמונים