Name: high-resolution episcopic microscopy (hrem) - simple and robust protocols for processing and visualizing organic materials
Uploaded: 2017-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials at JoVE.com

המחברים מודים טים מוהון על תרומות שלו invalubale בפיתוח HREM ו פטרה חפר למתן דוגמאות.

כל ההליכים בוצעו על פי הנחיות אתיות באוניברסיטה הרפואית של וינה. 1. הכנה לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת עוברי ורקמות העובר (עד 5 x 5 x 5 מ&quot;מ 3 ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העוברים או חלקים של העוברים 4% PFA / PBS או מקבע של בואי ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 16 - 24 שעות תחת נדנדה מתמדת. הערה: עוברים של כמה מינים ושלבים התפתחותיים שונים ניתן להשתמש, כגון דג הזברה 48 שעות, 19 ח &#39;חומוס שליו, וגם עוברי עכבר טרום לידתי, אשר שימשו כאן (ראה נציג תוצאות ). הדגימות נקצרו והועברו לתוך PBS בטמפרטורת החדר עבור הזמני, לפני שהם הוכנסו למקבע. במידת הצורך, לקצץ את הדגימות עם מיקרו מספריים או אזמלים לפני קיבוע כדי להשתלב תבניות embedding. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מקבע ולשטוף את רקמת העובר PBS ב 4 מעלות צלזיוס תחת סלע מתמידG עבור 24 שעות (2-3 שינויים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים את דגימות 70%, 80%, 90%, אתנול 96% ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 - 3 שעות כל אחד. מקום צינורות המכילים את דגימות על rotator. הערה: עבור דוגמאות קטנות (&lt;2 x 2 x 2 מ&quot;מ 3 ), הזמן מדגם מוטלת בכל אתנול עשוי להיות מופחת ל 60 דקות. עבור דגימות גדולות (&gt; 5 x 5 x 5 מ&quot;מ 3 ), זה יכול להיות מורחבת עד 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים חדירה מתחת למכסה המנוע קטר מגן כפפות מגן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון חדירת ידי הוספת 1.25 גרם benzoyl חמצן (זרז מפלסטיק) ו 0.4 גרם eosin ל 100 מ&quot;ל של פתרון A (לפרטים נוספים, ראה טבלה של חומרים ). מערבבים את זה בכוס על צלחת מגש מגנטי על 4 מעלות צלזיוס עד eosin ו זרז נמסים לחלוטין (2 - 3 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את דגימות עבור 12-24 שעות בפתרון חדירה. שמור את זה על 4 מעלות צלזיוס תחת נדנדה או סיבוב רציף. החלף פתרון חדירה עם פתרון טרי לאחר 3 ו -12ח. הערה: הארך את זמן ההסתננות ל -48 שעות לעוברים גדולים (אורך 1 ס&quot;מ לכתר / אורך). </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת דגימות רקמות למבוגרים (עד 5 x 5 x 7 מ&quot;מ 3 ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הרקמות 2% PFA / PBS המכיל 4% חומצה carbolic ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים לפחות. הערה: מדגם רקמות הנובע מעור, כבד, לבלב, כליה, בלוטת התריס, לב, שרירים מופשטים, מוח, עצבים ודגמי גידול של כמה בני אדם, מכרסמים, חזירים, זבובי פירות ודגי זברה. ולאחר מכן מעובד עבור הדמיה HREM (אנו מדגימים את תיקון הדגימות, ראה נציג תוצאות ). הבלו את דגימות רקמות עם אזמלים, מספריים או אגרופים ביופסיה ישירות להעביר אותם מקבע. עבור קיבעון של רקמות עצבים להשתמש 4% PFA / PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מקבע ולשטוף את הרקמה תחת מי ברז זורמת עבור 3-6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש את הדגימות על ידי לאחר מכן placIng אותם 70%, 80%, 90%, 96% אתנול, מעורבב עם 0.4 גרם eosin לכל 100 מ&quot;ל (2 - 3 שעות כל). שמור את הפתרונות עם דגימות על 4 מעלות צלזיוס תחת נדנדה מתמדת או על rotator. הערה: עבור דוגמאות קטנות (&lt;2 x 2 x 2 מ&quot;מ 3 ), הזמן מדגם מוטלת בכל אתנול עשוי להיות מופחת ל 60 דקות. עבור דוגמאות גדולות (&gt; 5 x 5 x 5 מ&quot;מ 3 ), זה יכול להיות המורחבת ל 4-8 ח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את כל השלבים חדירה מתחת למכסה המנוע קטר מגן כפפות מגן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון חדירת ידי הוספת 1.25 גרם benzoyl חמצן (זרז מפלסטיק) ו 0.4 גרם eosin ל 100 מ&quot;ל של פתרון A (לפרטים נוספים, ראה טבלה של חומרים ). מערבבים בכוס על צלחת מגש מגנטי ב 4 ° C עד eosin ו זרז נמסים לחלוטין (2 - 3 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום דגימות בפתרון חדירה עבור 24 - 36 ח. שמור את זה על 4 מעלות צלזיוס תחת נדנדה או סיבוב רציף. החלף פתרון חדירה עם פתרון טרי לאחר 3 ו -12 ח. הערה: עבור דוגמאות גדולות (&gt; 5 x 5 x 5 מ&quot;מ 3 ) להאריך את זמן ההסתננות ל 48 h. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חומר אורגני אחר הערה: חתוך את תחליפי העור ואת הנייר לגודל הרצוי במספריים רגילים. לא נדרשת קיבוע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלג על קיבוע, כביסה וייבוש צעדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את כל השלבים חדירה מתחת למכסה המנוע קטר מגן כפפות מגן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון חדירת ידי הוספת 1.25 גרם benzoyl חמצן (זרז מפלסטיק) ו 0.4 גרם eosin ל 100 מ&quot;ל של פתרון A (לפרטים נוספים, ראה טבלה של חומרים ). מערבבים בכוס על 4 מעלות צלזיוס על צלחת מגנטית מגנטי עד eosin ו זרז נמסים לחלוטין (2 - 3 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות המקום פתרון חדירה עבור 3-12 שעות. שמור את זה על 4 מעלות צלזיוס תחת נדנדה או סיבוב רציף. החלף פתרון הסתננות עם פתרון טרי לאחר 1 ו - 2 ח. </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 2. הטבעה הערה: בצע את כל השלבים תחת מכסה המנוע קטר מגן כפפות מגן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון חדירת טריים כמתואר לעיל (שלב 1.1.4.1). הוסף 4 מ&quot;ל פתרון B (לפרטים, ראה טבלה של חומרים ) ל 100 פתרון חדירה מ&quot;ל כדי להכין את הפתרון הטבעת. הערה: אם הכיוון המדויק של הדגימה בתבניות הטבעה נדרש כדי לאפשר הטבעה של מספר דגימות במקביל, להאט את פילמור של פתרון המניות על ידי הצבת את הכוס לתוך הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במגשי ספירלה (לפרטים, ראה טבלה של חומרים ) עם תבניות שיש נפח שגרתי של 6 x 8 x 5 מ&quot;מ 3 או 13 x 19 x 5 מ&quot;מ 3 , או תבניות מותאמות אישית עם כרכים של עד 8 x 10 x 15 מ&quot;מ 3 ( איור 2 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את התבניות עם פתרון embedding ולהעביר את המדגם לתוך עובש באמצעותכף. במהלך ההעברה להבטיח כי המדגם מכוסה במלואו עם פתרון הטבעה כדי למנוע השמנה האוויר. הערה: ניתן לעשות זאת בטמפרטורת החדר, אם החל מיד לאחר איסוף הדגימות ופתרון הטבעת מהמקרר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט המדגם בתוך עובש באמצעות מחטים או מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע פתרון הטבעה מתחיל להיות צמיג, במקום מחזיק בלוק (ראה טבלה של חומרים ) על גבי עובש ולהוסיף פתרון הטבעה דרך החור המרכזי של בעל הבלוק עד הבסיס של בעל בלוק מכוסה 1 - 2 מ&quot;מ של פתרון הטבעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את מגש כוס דפוס על ידי כיסוי זה עם שעווה פרפין נוזלי לחכות עד זה התקשה. לחלופין במקום השני דפוס דפוס מגש הפוך על מגש כוס דפוס עם דגימות חותם אותו עם סרט דביק כדי הוכחה אוויר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר בלוקים כדי לסיים את פילמור על ידי אחסון מגשים כוסות דפוס אטום עבור 1 -2 ימים בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעיבוד לאחר פילמור, במקום מגשים כוס דפוס עם בלוקים ממוחזרים בתנור במעבדה רגילה ואופים ב 70 - 80 מעלות צלזיוס למשך מינימום של 1 - 2 ימים עד שהם הופכים אדום כהה. לאסוף את המגשים מהתנור ולהסיר את אבני מן התבנית. הערה: אפייה יכולה להיעשות בתנאים סביבתיים רגילים. מגש כוס כיסוי דפוס, אשר מבטיח איטום אטום בשלב הראשון לאחר הטבעה, ניתן להסיר כדי לאפשר בדיקת צבע של שרף לאחר 10 שעות. מיד לאחר האפייה, שרף רך בלוקים ניתן להסיר בקלות מגש כוס דפוס. בתוך 2 - 3 שעות הם קשים ויכולים להיות מאוחסנים בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים. </li></ol> 3. יצירת נתונים הערה: אב טיפוס HRM 18 , 25 המשמש כאן כולל את הפריטים הבאים: (i) microtome סיבובית עם בעל בלוקזה מפסיק אחרי כל חתך בנקודת המפנה העליונה שלה. (2) סכין מיקרוטומה לא סטנדרטית, מתכת קשה, פרופיל D (לפרטים ראה טבלת חומרים ). (Iii) ראש מיקרוסקופ פלואורסצנטי התרכובת עם אקדח מטרה קוביית GFP-Filter (עירור 470/40, מסנן פליטה 525/50) בציר האופטי שלה. הציר האופטי מסודר בניצב למשטח החתוך טרי של בלוק מותקן על המיקרוטום והוא מוחזק על ידי מכשיר המאפשר תנועה מעלה ומטה. (Iv) לוח צולב ממונע הנושא את המיקרוטום. ניתן להעביר את הטבלה לכיוון הציר האופטי ולרוחב. (V) מצלמת וידאו דיגיטלית המצורפת מיקרוסקופ פלורסנט המתחם. (Vi) מקור אור מונוכרום (470 ננומטר). (Vii) מחשב המחובר למצלמה, עם תוכנת יצירת נתונים (לפרטים ראה טבלת חומרים ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציין את אזור העניין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Li רגיל במעבדהGHT מקור (ראה טבלה של חומרים ) עבור הפניית אור לבן בעקיפין על פני השטח לחסום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות את קווי המתאר של החומר מוטבע כפי שהוא פרויקטים על פני השטח לחסום. ציין את האזור של עניין שדה מאוחר יותר של נוף על משטח לחסום באמצעות עט או סכין גילוח. הערה: שלב זה הוא חובה להגדיר את היקף שדה הראייה לפני החתך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את שדה התצוגה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר גוש שרף עם מדגם על microtome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את בעל הבלוק למצב העוצר שלו (נקודת המפנה העליונה של טיול בעל הבלוק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המצלמה הדיגיטלית ואת תוכנת הדור נתונים, ולרכוש תמונה חיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עדשה אובייקטיבית, עם הגדלה מתאימה כדי לכסות את האזור של עניין המצוין על פני השטח לחסום. הערה: מטרות עם הגדלות 2.5X, 5X, 10X, 20X ו פתחים מספריים בין 0.07 ו 0.40 נפוץ. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזיז את האופטיקה מעלה ומטה ואת microtome רוחבית באמצעות שולחן הצלב ממונע עד אזור העניין תואם עם שדה התצוגה המוצגת על מסך המחשב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוֹקֵד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע צעד אחר צעד ידני חתך עד המבנים הראשונים של המדגם להיות גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדרים את משטח החסימה במישור המיקוד של האופטיקה, על ידי הזזת המיקרוטום לכיוון הציר האופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עובי סעיף; עובי סעיף 0.5-0 מיקרומטר מומלץ. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצור ועיבוד נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את שגרת התוכנה כי תזמור חתך ותמונה לכידת. בצע את ההוראה המתועדת של תוכנת לכידת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור שגרת תוכנה והכניס שקופית קנה מידה מול משטח לחסום ברגע המדגם מחולק לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונה באופן אינטראקטיבי עבור קליברה מאוחרת יותרTion. הערה: זה חייב להיעשות בכל פעם אובייקט משמש להגדיר מסודרים החדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המר את סדרת התמונות ל 8 ביט אפור בקנה מידה תמונות בפורמט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען סדרת תמונות לתוך תוכנת הדמיה 3D ולהתאים ניגודים. הערה: ניתן לבצע המרת תמונות והדמיה תלת-ממדית עם חבילות תוכנה סטנדרטיות שונות או זמינות באופן חופשי, בהתאם להוראות התוכנה המתאימה. </li></ol></li></ol>

למחברים אין מה לגלות.

HRM היא שיטה מיקרוסקופית חזקה ביותר, אשר אידיאלית לחזות מגוון רחב של חומרים אורגניים המשמשים ביו-רפואה ותעשייה 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 . זה יכול להיות מועסק כמודל הדמיה בלעדי, כפי המשמש כיום על ידי מנגנוני הפרעות התפתחותיות (DMDD) תוכנית 41 , 42 <suP, 43 , 44 , או כחלק אינטגרטיבי של צינורות הדמיה multimodal 45 . ניתן לתפקד במנגנון מלא של ייצור נתוני ה- HREM, המרכיבים את רכיבי המעבדה הקונבנציונאליים, וכולל מיקרו-טום ממונע, מיקרוסקופ, טבלת צלב ממונע, מחשב עם תוכנה מתאימה 25 . זה קריטי להשתמש microtome מצויד בעל בלוק כי reproducibly מפסיק לאחר כל קטע במיקום מוגדר קוביות GFP מסנן בתוך המסלול האופטי. עם זאת, מלא תפקוד כלול פתרונות ניתן לרכוש מחברות כגון אינדיגו מדעי. HREM פונה למגבלות כמו כל טכניקות היסטולוגית, אלא כי אין חפצים מוצגים במהלך חתך או הרכבה החלק. עם זאת, ישנן מגבלות, הנובעות מן הצורך דגימות כתם לפני חתך ומן המאפיינים של חומר הטבעה. חדירה של eosin דרך הדגימה כולה נדרש לקבלת ניגודים רקמות מספיק; חומר צפוף מאוד, רקמות שומן וחומרים אנאורגניים מעכבים ביעילות חדירת חנקן, וכתוצאה מכך ברקמות לא מוכתמות במרכז האובייקטים. שימוש מיוחד fixatives מסייע כתמי העור הכתם, אבל עדיין אין שיטה נכונה להתגבר באופן מלא על הבעיה. מגבלה נוספת היא שרפים שחוסמים יותר מ -2 ס&quot;מ נוטים לשבור במהלך החתך. זה יכול להיות נמנע בחלקו על ידי חיתוך דגימות ועיבוד חלקים בנפרד. מיקום נכון של דגימות קטנות או דגימות עם משטחים לא סדירים בתבניות במהלך הטבעה הוא לעתים קרובות בעייתי. כיסוי דגימות עם agarose ועיבוד בלוקים agarose כמתואר בפרוטוקול בדרך כלל פותר בעיה זו 19 . גישה חלופית, אשר גם עוזר אם בלוקים לשבור במהלך כתותOning, היא להסיר את בלוק מוקשה כבר מן המחזיק שלה להטביע אותו מחדש, בעקבות הליך הטבעה המתואר. מערך נתונים טיפוסי של HREM כולל 500 עד 3,000 תמונות בודדות. הרזולוציה המספרי שלה נקבעת על ידי המרחק בין הדימויים הרצופים ( כלומר , לפי עובי העומק), המאפיין של יעד המצלמה, ומאפייני האופטיקה המנוצלת. השתמשנו בסעיף עובי בין 1 מיקרומטר ו 5 מיקרומטר והשיג תוצאות טובות, למרות הפרוטוקולים המוצגים לא לגמרי לחסל נוצץ מן חפצים 20 , 46 . ממצאים אלה נגרמים על ידי רקמות מוכתמת עמוק הממוקם עמוק בתוך הבלוק, וכתוצאה מכך טשטוש של מידע רקמות על משטחים לחסום על ידי. המצלמות היו מימדים היעד של 2,560 x 1,920 פיקסלים 2 , 2,048 x 2,048 פיקסלים 2 , ו 4,096 x 4,096 פיקסלים 2 ו היו combiעם עדשות 1.25X, 2.5X, 5X, 10X ו 20X. זה הביא גדלים פיקסלים מספריים בין 0.18 x 0.18 מיקרומטר 2 ו 5.92 x 5.92 מיקרומטר 2 , אשר הוכיח להיות מספיק לניתוח 3D של ארכיטקטורת רקמות וצורות התא, ואפילו עבור חזותי גרעינים. בהתחשב ברזולוציה נומרית גבוהה, אחרים organelles התא צריך להיות גלוי גם כן. בניגוד מספיק בשל מכתים eosin פשוט, ואת התכונות האופטיות של מטרות להפחית באופן דרמטי את האפשרות להפלות מבנים. רזולוציה מרחבית אמיתית מקסימלית של נתוני HREM, אשר לוקח בחשבון את הצמצם המספרי, הוא כ 1 x 1 x 1 מיקרומטר 3 , ולכן רק מאפשר אפליה יעילה של מבנים גדולים יותר מאשר על 3 x 3 x 3 מיקרומטר 3 . בעיה נפוצה לכל טכניקות הדמיה דיגיטליות היא הפער בין גודל שדה הראייה, המגדיר את החלק של הדגימה שניתן להציגD על היעד המצלמה, ואת הרזולוציה המספרי של התמונה. ככל ששדה הראייה גדול יותר, כך הרזולוציה המרבית האפשרית המרבית 46 . הגדרת HRM המשמשת כאן מאפשרת את יצירת נתוני HREM עם שדה תצוגה בין 0.74 x 0.74 מ&quot;מ 2 (המטרה 20X) המוצגים ברזולוציה נומרית של 0.18 x 0.18 מיקרומטר 2 ו 12.12 x 12.12 מ&quot;מ 2 (1.25X אובייקטיבי) המוצגים ב רזולוציה נומרית של 2.96 x 2.96 מיקרומטר 2 . חלופות מסחריות חלופיות יכולות לספק שדות גדולים יותר של תצוגות, אך במחיר של רזולוציה אמיתית. עם זאת, הם מספקים תוצאות מצוינות, כפי שניתן לראות מן הנתונים המוצגים בדף הבית של תוכנית DMDD 47 .

ניתוח מבני של חומרים אורגניים ואנאורגניים הוא הצעד הראשון בהבנת התכונות הפיזיות שלהם ותפקודם. הבסיס לאנליזה כזו הוא מידע דו מימדי (2D) שנרכש על ידי התבוננות זהירה בקטעים היסטולוגיים, עם מגוון שיטות דימות פשוטות ומתוחכמות המפיקות פרטים על ארכיטקטורת רקמות, מורפולוגיה של תאים וטופולוגיה, הרכב מולקולרי ותכונות ביומכניות 1 , 2 , 3 . עם זאת, מידע דו-ממדי אינו מתאים לחקר הסדרים מורכבים מרחביים. לפיכך מספר גדל והולך של vivo ו vivo שיטות לשעבר המאפשרים את הדור של נפח נתונים דיגיטליים הוקמו בעשורים האחרונים 4 ועוד רבים נמצאים בפיתוח. העיקרון השיטתי של רוב שיטות הדור נתונים הוא הדור של ערימות וירטואליותשל תמונות דיגיטליות המציגות קטעים שנרכשו על ידי חתך וירטואלי או פיזי של אובייקט. אם תמונות הקטעים מיושרות כהלכה, הדבר יוצר אמצעי אחסון, וניתן לחלק אותו מחדש במטוסי מקטע וירטואלי, או להשתמש בו ליצירת מודלים תלת-ממדיים של שטח ונפח. טכניקות פופולריות לדמיין בני אדם ודגימות ביולוגיות גדולות יותר הם טומוגרפיית תהודה מגנטית (MRT), טומוגרפיה ממוחשבת (CT), טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET) וטומוגרפיה ממוחשבת של פוטון בודד (SPECT). הדגימות הקטנות מדמיינות בדרך כלל באמצעות הדמיית תהודה מיקרו-מגנטית (μMRI), טומוגרפיה של הקרנת אופטי (OPT), טומוגרפיית קוהרנטיות אופטית (OCT), טומוגרפיה פוטוקוסטית (PAT), שיטות היסטולוגיות המבוססות על חתכים היסטוריים, מיקרוסקופיה קונפוקלית וטומוגרפיה אלקטרונית 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 <sUp&gt;, 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . טכניקה חדשה יחסית ליצירת נתונים, המייצרת נתונים דיגיטליים של דגימות קטנות ודגימות רקמות היסטולוגיות, היא שיטת ה- HREM, שפותחה בשיתוף פעולה הדוק עם טים מוהון 18 , 19 . זוהי טכניקה פשוטה המבוססת מיקרוסקופ, אשר מייצר נתונים נפח דיגיטלי של חומר מוטבע שרף כי הוא מחולק על microtome. הנתונים מאפשרים ניתוח מפורט של ארכיטקטורת רקמות והפצות התא, כמו גם ניתוח מטרי של תכונות קטנות על רמת מיקרוסקופית אור ביניים. HREM מייצרת ערימות של תמונות דיגיטליות מיושרות מטבען המופיעות כאילו נלכדו מ- eאוסטין חלקים היסטולוגיים מוכתמים. ניגודיות רקמות ונתונים ברזולוציה ביחס שדה הראייה עולה על הנתונים של מיוצר עם μCT, μMRI, ו OPT, אבל הם נמוכים יותר מאשר זה אפשרי עם confocal, גיליון אור מיקרוסקופית אלקטרונים 20 . עם זאת, בניגוד האחרון, HREM מסוגל לדמיין דגימות עם נפח גדול יחסית של עד 5 x 5 x 7 מ&quot;מ 3 באיכות היסטולוגית. מספר מחקרים שנעשו לאחרונה מספקים אפיונים מפורטים והשוואות בין היתרונות והחסרונות של טכניקות ההדמיה הבודדות, ולשם האובייקטיביות אנו מתייחסים לאלו הנוגעים למידע נוסף על מגבלותיהם ותחומי היישומים האפשריים 4 , 21 , 22 , 23 , 24 מחקר זה מתמקד בשיטת הדמיה של HREM ומטרתו לספקפרוטוקולים פשוטים מאוד להפקת נתונים HREM של קשת רחבה של חומרים אורגניים, כמו גם דוגמאות של היישום שלהם. זרימת העבודה ליצירת נתונים HREM הוא פשוט חל על כל החומרים שיכולים להטביע שרף methacrylate ( איור 1 ). עם זאת, ישנם הבדלים ספציפיים רקמות בהכנת המדגם, כי צריך להיחשב. לכן אנו מספקים שלושה פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת דוגמאות שונות. הטמעה והפקת נתונים פרוטוקול השלבים זהים עבור כולם.

<table><tbody><tr><td>JB-4 Plus Embedding Kit</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>18570-1</td><td>includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B</td></tr><tr><td>Polyethylene Molding Cup Trays, 6 x 8 x 5 mm hexagon (9 cavities)</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>17177A-3</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Molding Cup Trays, 13 x 19 x 5 mm (9 cavities)</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 Plastic Block Holders</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>15899-50</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Waldeck GmbH &amp;amp; Co. KG, Division Chroma</td><td>1A-196</td><td></td></tr><tr><td>Microtec CUT 4060E</td><td></td><td></td><td>rotary microtome</td></tr><tr><td>Leica DM LM, fluorescence compound microscope</td><td>Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP filter set</td><td>Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td><td>11090937180000</td><td></td></tr><tr><td>Motorised cross table</td><td>Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH &amp;amp; CO. KG</td><td>KT5-LSMA</td><td></td></tr><tr><td>Digital video camera SPOT-FLEX</td><td>Visitron Systems GmbH.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>precisExcite High-Power LED</td><td>Visitron Systems GmbH.</td><td></td><td>light source</td></tr><tr><td>VisiView 2.1.4</td><td>Visitron Systems GmbH.</td><td></td><td>Image capturing software</td></tr><tr><td>Hard metal knife (tungsten carbide), profile D</td><td>Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KL 2500 LCD</td><td>Schott AG</td><td></td><td>light source</td></tr></tbody></table>

high-resolution episcopic microscopy (hrem) - simple and robust protocols for processing and visualizing organic materials

אנו מספקים פרוטוקולים פשוטים להפקת נתונים נפח דיגיטלי עם ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית האפיסקופית (HREM) שיטה. HREM מסוגל הדמיה חומרים אורגניים עם כרכים עד 5 x 5 x 7 מ&quot;מ 3 ברזולוציות מספריים טיפוסי בין 1 x 1 x 1 ו 5 x 5 x 5 מיקרומטר 3 . דגימות מוטמעים שרף methacrylate ו חתך על microtome. לאחר כל קטע תמונה של משטח לחסום נתפס עם מצלמת וידאו דיגיטלית שיושב על phototube מחובר הראש מיקרוסקופ המתחם. הציר האופטי עובר דרך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) קוביית מסנן והוא מיושר עם עמדה, שבה זרוע מחזיק בוק מגיע לנוח אחרי כל מקטע. בדרך זו, סדרה של תמונות מיושרות מיסודו מיושר, הצגת משטחי בלוק הבאים מיוצרים. טעינת סדרת תמונות כזו בתוכנת הדמיה תלת מימדית (3D) מאפשרת המרה מיידית לנתוני נפח דיגיטלי, המאפשרים וירטואליזציהEctioning שונים מטוסים אורתוגונליים ו אלכסוני ויצירת נפח ו משטח המחשב שניתנו מודלים. אנו מציגים שלושה פשוטים, רקמות ספציפיות רקמות לעיבוד קבוצות שונות של דגימות אורגניות, כולל עכבר, אפרוח, שליו, צפרדע ועופות זברה דגים, חומר ביופסיה האדם, נייר uncoated והחלפת העור החומר.

HREM מייצר סדרה של תמונות מיושרות מיושר באופן טבעי עם ניגודים דומים לתמונות של hematoxylin / eosin קטעים היסטולוגית מוכתמים. בניגוד תמונות סעיף 2D, ערימות של תמונות HREM לאפשר הדמיה וניתוח של ארכיטקטורת רקמות, מורפולוגיה, טופולוגיה של מגוון רחב של חומרים אורגניים בתלת מימד. ניגודיות גבוהה לעתים קרובות מאפשר להדמיה מהירה ופשוטה 3D של נפח מודלים המחשב שניתנו ו ממצאי קונטור חצי אוטומטי עבור הדור של מודלים שניתנו על פני השטח. הגודל של נתוני HREM משתנה בהתאם לגודל של המצלמה היעד, את מצב לכידת תמונות (8, 12, 16 ביט, גודל אפור, צבע) ואת מספר תמונות לחסום בודדים. ערכות נתונים קטנות יותר של 1,000 8-bit.jpg תמונות בקנה מידה אפור של 2,048 פיקסלים x 2,048 פיקסלים יש גודל של כ 900 MB. ערכות נתונים גדולים יותר של 3,000 8-bit.jpg תמונות בקנה מידה אפור של 4,096 p<html> Ixel x 4,096 פיקסלים יש כרכים של כ 20 GB. הפרוטוקולים הניתנים הם פשוט וחזק, ובמהלך העשור האחרון, הם הועסקו להפקת נתונים HREM של דגימות שונות. פרוטוקול סעיף 1.1 מותאם במיוחד לעיבוד עוברי שלם של אורגניזמים מודל ביו-רפואי עם אורך של עד 1 ס&quot;מ דגימות רקמת עוברי עם מימד של עד 5 x 5 x 5 מ&quot;מ 3 ; השתמשנו בשיטה זו להפקת נתוני HREM של העוברים הבאים: עכבר ( Mus musculus) , אפרוח ( Gallus gallus ), זברה דג ( Danio rerio ), שליו ( Coturnix coturnix) , צפרדע צפרדע אפריקה ( Xenopus laevis ), סוס ( Equus ferus caballus ), באג חלבון ( Oncopeltus fasciatus ), תנין ( Crocodylia ), תמנון ( אוקטופוס vulgaris ). הנתונים של כל המינים היו באיכות מעולה ( למשל , איור 3 ) = &quot;פרוטוקול סעיף 1.2 היה מותאם במיוחד לעיבוד דגימות רקמות לנוער ומבוגרים עם מידות של עד 5 x 5 x 7 מ&quot;מ 3 ו מועסקים לדמיין דגימות רקמות של העור, הכבד, הלבלב, הכליות, בלוטת התריס, הלב, שרירים מופשטים, מוח, עצבים ודגמי גידול שנלקחו מאדם ( הומו סאפיינס ), עכברים ( Mus musculus ), חולדות ( Rattus norvegicus ), חזירים ( Sus scrofa domestica ) Furo ), זבוב פירות ( תסיסנית melanogaster ), זברה דג ( Danio rerio ). בעוד שהתוצאות היו מצוינות עם רוב הדגימות ( למשל , איור 4 , הנפשה 1 ), החלקים המרכזיים של העור (עם האפידרמיס) ודגימות מוח גדולות מ -3 x 3 x 3 מ&quot;מ 3 נותרו ללא תלות בשל חוסר חדירה מספיק של eosin אלה רקמות. פרוטוקול sEction 1.3 היה מותאם במיוחד לעיבוד חומר סיבי אורגני מועסקים דמיינו את ארכיטקטורת סיבים של נייר מצופה, נייר uncoated, חומר תחליפי יליד ותאי גזע זרע חומר תחליף זרע. דגימות אלה היו קלים ומהירים לעבד. הנתונים של הנייר uncoated ואת רוב תחליפי העור היו באיכות טובה ( איור 5 , אנימציה 2 ). בעיות התרחשו בעיבוד נייר מצופה, כאשר החומר האורגני הפריע חדירה של eosin. בעיה נוספת התרחשה בעת עיבוד תחליפי העור על בסיס אגר כי הם נעשו חלקית על ידי פתרון חדירה. <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig1.jpg" /> איור 1: זרימת עבודה. השלבים המוצגים בתיבות האדומות מחייבים שינויים בהתאם למאפייני המדגם. צעדים בתיבות הירוק הם אלהדומים בכל הדגימות. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig2.jpg" /> איור 2: תבניות מותאמות אישית. Moulds ניתן להתאים על ידי חיתוך חור לתוך התבנית המקורית, החדרת הנורה של pipet פסטר ואטימתו עם חומר הדוגמנות. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig3.jpg" /> איור 3: עוברי דמיינו באופן זמני. (A, B) העובר עכבר שנקצרו ביום עובריים, E = 9.5. תמונת סעיף HRM מוצגת ב (א) </חזקה&gt;. נפח שניתנו מודל 3D מראה את פני השטח מוצג ב (B) . (ג) קטע sagittal וירטואלי באמצעות נפח שניתנו מודל של הצוואר של העובר העכבר E15.5. (ד) חומוס חומוס ב המבורגר המילטון התפתחותי (HH) שלב 18. מודל השטח של לומינה של רכיבים קרדיווסקולריים בשילוב עם טיוח נפח של כל רקמות העובר. סולם ברים = 200 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig4.jpg" /> איור 4: דוגמאות דגימות רקמות למבוגרים בלבד. (א) חלק מקטע תמונה HREM דרך עצב אנושי. Inlay מראה קטע מהתמונה ביתר פירוט. (ב) חלק של תמונת סעיף HREM דרך כבד חזירי. הערה nאוקלי. (ג) חלק של תמונת סעיף HRM של רקמה אנושית הלימפה. (D, E) עור עבה של כרית אגודל אנושית. נפח שניתנו מודל 3D של הביופסיה כולה. (ד) משטח שניתנו מודלים של עורקים, ורידים, ועצבים מול כריתה וירטואלית באמצעות נתונים HREM (E) . (F) גידול ניסיוני ברקמת העכבר הבוגרת. נפח שניתנו מודל 3D מול שלושה סעיפים וירטואליים באמצעות נתונים HREM. שים לב לחלקים הנרוטיים (ראשי חץ). סולם ברים = 200 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig5.jpg" /> איור 5: חומר סיבי דמיינו. (A, B) תמונה HRM סעיף של נייר חום, ללא ציפוי. (ב) </s<html> Trong&gt; מראה קטע של (A) . הערה סיבים לומן שלהם. (C) סעיף HRM של נייר מצופה. שים לב כי סיבים להישאר בלא כתם. (ד) נפח שניתנו מודל של חומר תחליפי יליד. שימו לב לקליבר ולצורה השונים של הסיבים. סולם ברים = 100 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="סרט 1" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov1.jpg" /> אנימציה 1: נפח הנפוץ מודל של עור עבה של האדם Thumb Pad. גודלו של גוש הרקמה הוא כ 4.2 x 2.7 x 2.7 מ&quot;מ 3 . גודל Voxel הוא 1.07 x 1.07 x 2 מיקרומטר 3 . <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/animation1.mp4" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).</a> Class = &quot;jove_content&quot; עבור: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="סרט 2" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov2.jpg" /> אנימציה 2: נפח הנפוץ מודל של חומר תחליף דרמטי הילידים. גודל המדגם הוא כ 1.2 x 0.85 x 0.4 מ&quot;מ 3 . גודל Voxel הוא 0.54 x 0.54 x 2 מיקרומטר 3 . <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/animation2.mp4" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials at JoVE.com

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

אנו מספקים פרוטוקולים פשוטים וחזקים לעיבוד חומר ביופסיה של מינים שונים, עוברים של אורגניזמים מודל ביו-רפואי ודגימות של רקמות אורגניות אחרות על מנת לאפשר דיגיטלי נפח נתונים הדור עם ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית האפיסקופיים שיטה.

מיקרוסקופיה אפיסקופית ברזולוציה גבוהה (HREM) - פרוטוקולים פשוטים ורב-עוצמה לעיבוד והדמיה של חומרים אורגניים

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

high-resolution-episcopic-microscopy-hrem-simple-robust-protocols-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

10.1K Views.  Medical University of Vienna.  אנו מספקים פרוטוקולים פשוטים וחזקים לעיבוד חומר ביופסיה של מינים שונים, עוברים של אורגניזמים מודל ביו-רפואי ודגימות של רקמות אורגניות אחרות על מנת לאפשר דיגיטלי נפח נתונים הדור עם ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית האפיסקופיים שיטה. 

Video: High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

רזולוציה גבוהה סיבים אופטיים עבור Microendoscopy באתרו נייד הדמיה

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Bioengineering

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) morphometric data. Here, we describe the detailed protocol to image the entire mouse embryo. The protocol consists of four major sections: sample preparation, embedding, image acquisition and finally, 3D visualization. The technology requires specimens to be stained with a fluorescent dye, which can be problematic for large or dense specimens. To overcome this limitation, we have improved the existing protocol to enhance tissue penetration of the dye by pretreating the specimen with a solution containing urea and sodium dodecyl sulfate. The protocol uses only routine laboratory equipment and reagents for easy adaptation in standard laboratory settings. We show that the resulting high-resolution 3D images faithfully recapitulate the detailed morphologic features of the internal organs of mouse embryos, thereby permitting morphometric analyses. Together, we present a detailed and improved protocol using standard laboratory equipment to acquire high-resolution 3D images of small and large sized specimens.

We describe a detailed protocol using high-resolution episcopic microscopy to acquire three-dimensional (3D) images of mouse embryos. This improved protocol utilizes a modified tissue preparation method to enhance penetration of the fluorescent dye, thereby permitting morphometric analysis of both small and large-sized specimens.

ראפיד רכישת תמונות 3D באמצעות ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית episcopic

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, methods involved in processing different biological samples involve unique practices. All conventional practices described in the literature for processing samples still find useful applications, but subtle changes in the sample preparation can alter image quality, as well as, introduce artifacts. Hence, using a unique sample preparation technique specific to the type of tissue analyzed is required to obtain a good quality image with ultrastructural resolution. The focus of this study is to provide the optimal sample preparation protocols for imaging embryos, rigid eggshells, and fungal cultures using SEM. The following optimizations were recommended to yield good results for the three different delicate biological samples studied. Use of milder fixatives like 4% paraformaldehyde or 3% glutaraldehyde followed by dehydration with ethanol series is mandatory. Fungal mycelium on agar blocks obtained by slide cultures yields a better ultrastructural integrity compared to cultures taken directly from agar plates. Chemical drying of embryos with HMDS provides drying without introducing surface tension artifacts compared to critical point drying. HMDS prevents cracking caused by shrinkage as samples are less brittle during drying. However, for fungal culture, critical point drying provides acceptable image quality compared to chemical drying. Eggshells can be imaged with no special preparation steps except for thorough washing and air drying prior to mounting. Preparation methodologies were standardized based on acceptable image quality obtained with each trial.&#160;

Here, we present detailed processing protocols for imaging delicate tissue samples using scanning electron microscopy (SEM). Three different processing methods, namely, hexamethyl disilazana (HMDS) chemical drying, simple air drying, and critical point drying are described for preparing rigid eggshells, embryos at early developmental stages, and fungal cultures respectively.

עיבוד העובר, קליפת ביצה, ופטרייתי תרבות לסריקת מיקרוסקופ אלקטרוני

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Environment

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a combination of light and electron microscopy. Samples embedded in resin are sectioned into arrays consisting of ribbons of hundreds of ultrathin sections and deposited on pieces of silicon wafer or conductively coated coverslips. Arrays are imaged at low resolution using a digital consumer like smartphone camera or light microscope (LM) for a rapid large area overview, or a wide field fluorescence microscope (fluorescence light microscopy (FLM)) after labeling with fluorophores. After post-staining with heavy metals, arrays are imaged in a scanning electron microscope (SEM). Selection of targets is possible from 3D reconstructions generated by FLM or from 3D reconstructions made from the SEM image stacks at intermediate resolution if no fluorescent markers are available. For ultrastructural analysis, selected targets are finally recorded in the SEM at high-resolution (a few nanometer image pixels). A ribbon-handling tool that can be retrofitted to any ultramicrotome is demonstrated. It helps with array production and substrate removal from the sectioning knife boat. A software platform that allows automated imaging of arrays in the SEM is discussed. Compared to other methods generating large volume EM data, such as serial block-face SEM (SBF-SEM) or focused ion beam SEM (FIB-SEM), this approach has two major advantages: (1) The resin-embedded sample is conserved, albeit in a sliced-up version. It can be stained in different ways and imaged with different resolutions. (2) As the sections can be post-stained, it is not necessary to use samples strongly block-stained with heavy metals to introduce contrast for SEM imaging or render the tissue blocks conductive. This makes the method applicable to a wide variety of materials and biological questions. Particularly prefixed materials e.g., from biopsy banks and pathology labs, can directly be embedded and reconstructed in 3D.

This protocol targets specific cells in tissue for imaging at nanoscale resolution using a scanning electron microscope (SEM). Large numbers of serial sections from resin-embedded biological material are first imaged in a light microscope to identify the target and then in a hierarchical manner in the SEM.

הדמיה הירארכי עם מודאלים מרובים סעיפים טורי למציאת מטרות תאיות ספציפיים בתוך כמויות גדולות

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Biology

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

<meta charset="utf8"></head><body>הדמיה של מבנים סינפטיים ברשתית בתלת ממד עם מיקרוסקופ אלקטרונים נפח

Preparation of Retinal Samples for Volume Electron Microscopy

Volume electron microscopy (Volume EM) has emerged as a powerful tool for visualizing the 3D structure of cells and tissues with nanometer-level precision. Within the retina, various types of neurons establish synaptic connections in the inner and outer plexiform layers. While conventional EM techniques have yielded valuable insights into retinal subcellular organelles, their limitation lies in providing 2D image data, which can hinder accurate measurements. For instance, quantifying the size of three distinct synaptic vesicle pools, crucial for synaptic transmission, is challenging in 2D. Volume EM offers a solution by providing large-scale, high-resolution 3D data. It is worth noting that sample preparation is a critical step in Volume EM, significantly impacting image clarity and contrast. In this context, we outline a sample preparation protocol for the 3D reconstruction of photoreceptor axon terminals in the retina. This protocol includes three key steps: retina dissection and fixation, sample embedding processes, and selection of the area of interest.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: מחקרי מדעי המוח ברשתית עם מיקרוסקופ אלקטרונים נפח

This protocol describes the detailed steps for preparing retinal samples for volume electron microscopy, focusing on the structural features of retinal photoreceptor terminals.

הכנת דגימות רשתית למיקרוסקופ אלקטרונים נפח

Volume electron microscopy (Volume EM) has emerged as a powerful tool for visualizing the 3D structure of cells and tissues with nanometer-level ...

Neuroscience

<meta charset="utf8"></head><body>פרוטוקול ממוטב להכנת דגימת אורגנואיד ברשתית עבור TEM

Preparing Retinal Organoid Samples for Transmission Electron Microscopy

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) under specific conditions. Synapse development and maturation in ROs have been studied immunocytochemically and functionally. However, the direct evidence of the synaptic contact ultrastructure is limited, containing both special ribbon synapses and conventional chemical synapses. Transmission electron microscopy (TEM) is characterized by high resolution and a respectable history elucidating retinal development and synapse maturation in humans and various species. It is a powerful tool to explore synaptic structure in ROs and is widely used in the research field of ROs. Therefore, to better explore the structure of RO synaptic contacts at the nanoscale and obtain high-quality microscopic evidence, we developed a simple and repeatable method of RO TEM sample preparation. This paper describes the protocol, reagents used, and detailed steps, including RO fixation preparation, post fixation, embedding, and visualization.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: ניתוח מבנה העל הסינפטי באורגנואידים רשתית בוגרים באמצעות TEM

This protocol provides an optimized and elaborate preparation procedure for retinal organoid samples for transmission electron microscopy. It is suitable for applications that involve the analysis of synapses in mature retinal organoids.

הכנת דגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem ...

מיקרוסקופיה אפיסקופית ברזולוציה גבוהה (HREM) - פרוטוקולים פשוטים ורב-עוצמה לעיבוד והדמיה של חומרים אורגניים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

רזולוציה גבוהה סיבים אופטיים עבור Microendoscopy באתרו נייד הדמיה

ראפיד רכישת תמונות 3D באמצעות ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית episcopic

עיבוד העובר, קליפת ביצה, ופטרייתי תרבות לסריקת מיקרוסקופ אלקטרוני

הדמיה הירארכי עם מודאלים מרובים סעיפים טורי למציאת מטרות תאיות ספציפיים בתוך כמויות גדולות

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

הכנת דגימות רשתית למיקרוסקופ אלקטרונים נפח

הכנת דגימות רשתית למיקרוסקופ אלקטרונים נפח

הכנת דגימות רשתית למיקרוסקופ אלקטרונים נפח

הכנת דגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת