Name: dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling
Uploaded: 2017-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling at JoVE.com

MAK מודה תמיכה עבור עבודה זו של מכוני הבריאות הלאומיים / מכון הסרטן הלאומי מעניק מספר - 1R15CA152985-01A1. פרויקט זה נתמך גם על ידי מיאמי באוניברסיטה לתואר ראשון מחקר פרס התוכנית, אוניברסיטת מיאמי דוקטורט-הסמכה הזדמנויות למילגות, של אוניברסיטת מיאמי מלומדים קייטנה.

ההליכים וידאו והנחת המתוארים להלן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת מיאמי.
 1. הכנה ובדיקה הגירוי <ol><li>צור שני תחומים ברורים הליך כירורגי, שולחן הניתוחים של הטבלה פעולה-מאוחרת. שלב שני אזורים עם כל חומרים וכלים הדרושים.
	שולחן <ol><li>הבמה פעולתו ברדס פרקו. לסדר את השולחן. עם הציוד באופן המאפשר ביצועים רציפה, ללא הפרעה של ההליך-</li>
		<li>ליצור טבלה לאחר הניתוח באותו החדר, ליד השולחן הראשי של המבצע. לשמור על שתי הטבלאות כמו סביבות סטרילי לאורך כל ההליך.</li>
	</ol></li> <li>המקום הבאות מספקת על שולחן הניתוחים: כוס אחת צנצנת עם מכסה, שפופרת אחת 15 מ"ל, זוג מספריים כירורגיים, בקבוק לחיץ אחד של 70% אתנול, שתי לוחות קצף, מלקחיים שני, שני מזרקים מד 1 מ"ל 21, שני צינורות 50 מ ל, שפופרת אחת צנטריפוגה , בקבוקון אחד קריוגני 4 רפידות כירורגי, עשר סיכות, מתקן של מגבונים חיטוי, מיכל שרפ.</li>
	<li>למקם את המצרכים הבאים על השולחן פעולה-מאוחרת: איזון האנליטי אחד, אחד דיואר L 4 של חנקן נוזלי, רחב רדוד פה דיואר מתלה microtube צף, זוג מספריים כירורגיים, מלקחיים שני, 4 מבחנות הקפאה, מתקן של מגבונים סטריליים.</li>
	<li>למלא אחד 50 mL ושפופרת אחת 15 מ"ל לאמצעי 75% עם פורמלין.</li>
	<li>שימוש במספר זיהוי אישי בכל פינה, מוספית אחת כירורגי pad כדי לוח מוקצף משוער 30 ס"מ על 30 ס"מ כדי לשמש הלוח לנתיחה. להשתמש בפינים ארבעת הנותרים במהלך המבצע. להכין לוח מוקצף קטן עם כרית כירורגית כדי להעביר את האיברים הטבלה לאחר הניתוח. 
	התראה: איזופלוריין (99.9%) כימי רעיל, אמור לשמש בשכונה האוורור כדי להבטיח את הרמה המקסימלית של ביטחון מפני ניקוי פסולת גז הרדמה 8. ניתן למצוא פרטים נוספים אודות הסיכונים לחוקרים הקשורים לשימוש של השיטה הפתוחה-שחרור באמצעות איזופלוריין מאמר מאת טיילור ו מוק 8.</li>
	<li>מקום אחד משטח כירורגי לתוך צנצנת זכוכית להשרות כמה טיפות של איזופלוריין (99.9%) ומניחים מגבת נייר לפסגה כדי למנוע מגע ישיר של העכבר עם איזופלוריין. באופן דומה, להשתמש בפתקים כירורגי קו הצינור הנותרים, להשרות כמה טיפות של איזופלוריין ולמקם רכיב pad נוספים לפסגה כדי למנוע מגע ישיר בין העכבר את איזופלוריין.</li>
	<li>חנקן נוזלי לשפוך לתוך הפה רחב רדוד דיואר עד למקסימום מילוי קו מתמלאת.</li>
	<li>המקום העכבר שנבחר עבור ניתוח לתוך ההרדמה קאמרית, כלומר צנצנת הזכוכית עם כרית ספוג עם כמה טיפות של איזופלוריין (99.9%) מכוסה את המכסה, עבור מינימלית ~ 1 
	הערה: הפעם משתנה של עכבר. ברגע העכבר מחוסר הכרה, להסיר אותו מן החדר ומניחים אותו על גבי לוח ההפעלה.</li>
	<li>אוריינט העכבר כך הוא שוכב בצד הגחוני והגביר את ראשו הצביע מן המדען. שים את ראשך בתוך הצינור מרופדת עם כרית כירורגי שרויות במים עם מספר טיפות של איזופלוריין (99.9%), ולבצע מבחן גירוי על ידי צביטה רגל כדי להבטיח העכבר מגיב לגירויים.
	<ol><li>אם נכשלת במבחן זה העכבר מגיב במבחן קמצוץ רגל, חזור על שלב 1.8.</li>
	</ol></li></ol> 2. ראשוניות החתך לב לנקב, המתת חסד <ol><li>להצמיד את הגפיים של העכבר ללוח קצף כירורגי. ולהשתין הצד הבטני של העכבר באמצעות אתנול 70%-</li>
	<li>לצבוט הפרווה/העור ליד הפתח השופכה עם מלקחיים ולמשוך מעט כלפי מעלה. לעשות חתך עם המספריים כירורגי דרך חלל הבטן החל פתח השופכה, את האמצע ואת הסוף על הסנטר.
	<ol><li>ליד נקודת המוצא של החתך הראשוני, תפוס צד אחד של הפרווה/העור עם המלקחיים, להפוך את חיתוך נוסף עם המספריים כלפי מטה באלכסון לכיוון הכפה גב-</li>
		<li>חוזר זה באופן זהה בצד השני. 
		הערה: הפרווה/העור עלול להיסגר כדי ליצור פתח רחב יותר, אך לא הכרחי.</li>
	</ol></li> <li>לאתר הלב ולהסיר את קרום הלב, אשר נמצא השק. סביב הלב, כדי למנוע סתימת מחט מזרק.
	<ol><li>ולהיאחז הכפורת בעזרת המלקחיים. ולהפסיק עם המספריים. לבצע הניקוב הלב על ידי בקפידה החדרת מחט מזרק לתוך הלב הפועם ולאט לאט מתחילים לחזור בו הבוכנה.</li>
		<li>לאיסוף דם מיטביים, השתמש הבוכנה של המחט לחקות את פעולת השאיבה של הלב ואף להימנע מהדפסת מהר מדי. 
		הערה: בדרך כלל כ 1 מ"ל של דם ניתן לאסוף.</li>
		<li>לאחר השלמת איסוף דם, להפיג את הדם לתוך צנטריפוגה צינור והשלך המזרק לתוך המיכל שרפ.</li>
		<li>לאחר הניקוב הלב מבוצע, לבצע המתת חסד על-ידי הסרת הקבצים המצורפים חיבור הלב. 
		הערה: הפארין, אנטי מקריש, לא נוסף את המזרק בהליך זה לפני הניקוב הלב כדי לאפשר את הדם והקרשה לאוסף סרום במחקר ספציפי זה. עם זאת, אם החוקר רצה למנוע קרישת דם כדי לאסוף פלזמה, הפארין היתה אפשרות להוסיף את המזרק לפני הניקוב הלב.</li>
	</ol></li> <li>אם המחקר כרוכה genotyping של העכבר, לגזור חלק האוזן עם המספריים ומניחים לתוך שפופרת צנטרפוגה עבור אימות גנוטיפ.</li></ol>
 3. החילוץ הלבלב <ol><li>אתר בבטן בצד שמאל של העכבר. בגין בעדינות (כדי למנוע קריעה) הפרדת הלבלב הקיבה, התריסריון באמצעות מלקחיים שני. 
	הערה: בעת ניתוק הלבלב הקיבה, המעיים, חשוב מאוד כי המלקחיים משמשים בעדינות כדי להנחות את רקמת הלבלב מן האברים וכדי לא למעוך או לקרוע את הלבלב עם המלקחיים.
	<ol><li>להמשיך להפריד בין הלבלב מן הסעיפים מעי ו המעי הדק, ולבסוף החל caecum של המעי הגס.</li>
	</ol></li> <li>ב caecum, מיקום מחדש של המלקחיים ולהמשיך ההפרדה של הלבלב לאורך המעי הגס הנותרים לקראת בחלחולת. 
	הערה: בשלב זה, זה נוח לחתוך ולהסיר את החלק מן הקיבה לאזור של המעי הגס מיד לפני החלחולת.</li>
	<li>לאתר הלבלב ומצורפת הטחול. החלק הלבלב כלפי הצד הימני של העכבר. להפריד את החיבורים שנותרו בין הלבלב חלל בית החזה עם המלקחיים להתנתק לחלוטין לבלב וטחול מחודשים, נוחים ומרווחים.</li>
	<li>להסיר את הלבלב, להפיץ את זה לבדיקה. השאר הטחול קשור הלבלב למטרות זיהוי.
	<ol><li>הסר כל רקמת חיבור, רקמת שומן, מצע המעי העליון מן הלבלב. 
		הערה: זה רקמות לבן בצבע, ולכן ניתן בקלות להבחין בין רקמת לבלב זה pinker בצבע. הדבר חשוב במיוחד אם הלבלב כל צריך להיות מוסר. לדוגמה, אם הלבלב צריך להיות שקל, לעומת משקל הגוף או בין קבוצות של בעלי חיים. ב- Ptf1a cre / +; LSL-קראס G12D / + דגם העכבר, במיוחד בחודשים בוגרים, קשה סיבי רקמת הלבלב יכול להיות נוכח. במקרה זה, הסרת זהיר של הלבלב שחייבת להתנהל כמו המעיים יכול להיות שזורה ברקמת הגידול. במקרים מתקדמים, הטחול לא תקין ואת רקמת הכבד עשוי גם להיות נוכח.</li>
	</ol></li> <li>במידת הצורך, מסירים איברים אחרים בשלב זה.</li></ol>
 4. איסוף נתונים ואחסון <ol><li>לאחר החילוץ של האיברים, מעביר את הדגימות לאזור לאחר הניתוח לשימור.</li>
	<li>שוקל כל איבר ואיבר ולמקם אותם לתוך המבחנה קריוגני בהתאמה שלהם. 
	הערה: לאורך שנינותh המסה של כל דגימה, חריגות צריך להיות מוקלט לשימוש עתידי.</li>
	<li>לאחר ששקלת את האיברים, למקם אותם לתוך החנקן הנוזלי עבור הצמד לקפוא.</li>
	<li>אחרי הצמד קופאים, לאחסן את האיברים ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך-</li>
	<li>למקם את הדגימות פורמלין המאוחסנים על גבי ספסל בן לילה, למחרת בבוקר לשנות את הפתרון שלהם פורמלין אתנול 70%- 
	הערה: הדוגמאות האלה צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C לאחסון לטווח ארוך-</li>
	<li>לאחסון לטווח ארוך, להקפיא את האגרוף דם ועל אוזנו ב-80 º C. אוסף נסיוב מהדם, לאפשר את הדם מצב של קרישת חסר במשך 30 דקות ולאחר מכן centrifuge את זה. להסיר את החלק סרום באמצעות פיפטה ולאחר מכן אחסן ב-80 מעלות צלזיוס</li>
</ol> 5. ניקוי <ol><li>Sanitize כל הקרע כלים עם המחיקות לחיטוי. מכסה הצינורית הרצוף של איזופלוריין ספוג כרית כירורגי. החלף משטח כירורגי על לוח מוקצף עם כרית כירורגי טריים. תשליך את החלקים של העכבר לא אסף לכל המתקן &#39; מדיניות לרשות בעלי חיים s.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fesinmeyer, M. D., Austin, M. A., Li, C. I., De Roos, A. J., Bowen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+Survival+by+Histologic+Type+of+Pancreatic+Cancer.">Differences in Survival by Histologic Type of Pancreatic Cancer.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 14 (7), 1766-1773 (2005).</li><li>Jackson-Grusby, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+cancer+in+mice.">Modeling cancer in mice.</a> Oncogene. 21 (35), 5504-5514 (2002).</li><li>Heid, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+requirement+of+Rac1+in+a+mouse+model+of+pancreatic+cancer.">Early requirement of Rac1 in a mouse model of pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 141 (2), 719-730 (2011).</li><li>Hingorani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+and+invasive+ductal+pancreatic+cancer+and+its+early+detection+in+the+mouse.">Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse.</a> Cancer cell. 4 (6), 437-450 (2003).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS2+Mutations+in+Human+Pancreatic+Acinar-Ductal+Metaplastic+Lesions+Are+Limited+to+Those+with+PanIN+Implications+for+the+Human+Pancreatic+Cancer+Cell+of+Origin.">KRAS2 Mutations in Human Pancreatic Acinar-Ductal Metaplastic Lesions Are Limited to Those with PanIN Implications for the Human Pancreatic Cancer Cell of Origin.</a> Mol Cancer Res. 7 (2), 230-236 (2009).</li><li>LaConti, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+serum+metabolomics+profiles+associated+with+malignant+progression+in+the+KrasG12D+mouse+model+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Distinct serum metabolomics profiles associated with malignant progression in the KrasG12D mouse model of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> BMC Genomics. 16 (1), 1-10 (2015).</li><li>Ludwig, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+the+serologic+proteome+in+a+tissue-specific+kras(G12D)+knockin+mouse+model+of+pancreatic+cancer.">Surveying the serologic proteome in a tissue-specific kras(G12D) knockin mouse model of pancreatic cancer.</a> Proteomics. 16 (3), 516-531 (2016).</li><li>Taylor, D. K., Mook, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+Waste+Anesthetic+Gas+Concentrations+Associated+with+the+Open-Drop+Method.">Isoflurane Waste Anesthetic Gas Concentrations Associated with the Open-Drop Method.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 61-64 (2009).</li><li>Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sample+collection+in+small+laboratory+animals.">Blood sample collection in small laboratory animals.</a> J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).</li><li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).</li><li>Auer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+frozen+tissue+storage+conditions+on+the+integrity+of+RNA+and+protein.">The effects of frozen tissue storage conditions on the integrity of RNA and protein.</a> Biotech Histochem. 89 (7), 518-528 (2014).</li><li>Ma, J., Leung, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbic+System+Participates+in+Mediating+the+Effects+of+General+Anesthetics.">Limbic System Participates in Mediating the Effects of General Anesthetics.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 1177-1192 (2006).</li><li>Ijichi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggressive+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+in+mice+caused+by+pancreas-specific+blockade+of+transforming+growth+factor-&#946;+signaling+in+cooperation+with+active+Kras+expression.">Aggressive pancreatic ductal adenocarcinoma in mice caused by pancreas-specific blockade of transforming growth factor-&#946; signaling in cooperation with active Kras expression.</a> Genes Dev. 20 (22), 3147-3160 (2006).</li><li>Abiatari, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin-dependent+cytoskeleton+remodelling+is+associated+with+an+anaplastic+phenotype+of+pancreatic+cancer.">Moesin-dependent cytoskeleton remodelling is associated with an anaplastic phenotype of pancreatic cancer.</a> J Cell Mol Med. 14 (5), 1166-1179 (2010).</li><li>Goodpaster, A. M., Romick-Rosendale, L. E., Kennedy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Statistical+significance+analysis+of+nuclear+magnetic+resonance-based+metabonomics+data.">a Statistical significance analysis of nuclear magnetic resonance-based metabonomics data.</a> Analytical biochemistry. 401, 134-143 (2010).</li><li>Yadav, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+Tumefactive+Chronic+Pancreatitis:+Clinical+Profile,+Histology,+and+Natural+History+After+Resection.">Idiopathic Tumefactive Chronic Pancreatitis: Clinical Profile, Histology, and Natural History After Resection.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 1 (2), 129-135 (2003).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

משמעות לגבי שיטות קיימות בעוד אחרים קטעי וידאו לא רשמי של העכבר והניתוחים קיימים, המאמר וידאו מספק לאיכות המקצועית הראשונה, עמית שנסקרו, הדגמה ויזואלית של כל השלבים מפורט הנדרש לחילוץ קצירת בלבלב עכבר על-ידי דיסקציה10 . הקל להיות איבר הראשי עבור פעילות חילוף החומרים, אינסולין ייצור, חיתוך, קציר של הלבלב מאפשר השימור של ה הפיזיולוגיות11. על-ידי בידוד הלבלב, ניתוח עתידי יכול שיתקיים על הדגימה. הליך זה מאפשר להשוואה ולמידה של אינטראקציות בין רקמות אחרות בתוך האורגניזם אותו בתוך באותה מסגרת זמן.
מגבלות של הטכניקה המגבלה הגדולה ביותר של הליך זה הוא סיום של העכבר החיים, ובכך מונע אוסף אורכי, דגימה של מספר דגימות רקמה מהעכבר אותו. כדי לנתח מגמות הקשורות לגיל, מין או quantifiers אחרים, חתך אוכלוסייה חייב להיות מיושם, כפי שעשינו עבור המחקר שלנו של סמנים מטבוליים של סרטן הלבלב. הגבלה נוספת של פרוטוקול זה הוא חוסר היכולת להשהות את ההליך. ברגע euthanization מאותחלת, ההליך צריך להתבצע בשלמותו.
שלבים קריטיים בתוך פרוטוקול ביצוע הבדיקה גירוי על ידי צובט הכפה האחוריות של העכבר חיוני כדי להבטיח כי העכבר מקבל ליחס אנושי. אם העכבר אינו מגיב לגירוי הזה, ואז ההליך עשוי להתבצע כמתוכנן. עם זאת, צריך העכבר להציג מענה במצוקה בעקבות הבדיקה גירוי, העכבר אמורה להיות מוחזרת לתא הרדמה לתקופה נוספת של זמן הבדיקה עד לתגובה במבחן גירוי לא נצפית12.
באופן דומה, לב סופנית הניקוב ואחריו הסרת חיבורי ללב מיד לאחר דגימת הדם מסוף נאסף שיטה המשני של המתת חסד מבטיח את הקורבן אנושי של העכבר. כדי להבטיח של לקיחת הדם יעיל, המדען עליך להשתמש תנועה שאיבה עם המזרק הדומה פעימות הלב של העכבר, מתן אפשרות לאיסוף מרבי של דם לבדיקה.
שינויים ופתרון בעיות מיתוג האברים של פורמלין לפתרונות אתנול 70% מכין האברים לצורך תהליך ההטבעה הנדרש לבדיקה היסטולוגית. פתרונות אחסון שונים עשוי להידרש צריך המדען לבחור לבצע ניסויים אחרים עם האיברים. לפני ניתוח חשוב להגביל את כל פוטנציאל הפשרתו של האיברים שמאוחסנים במקרר-80 ° C כדי לשמר את השלמות של האיבר.
השימוש Ptf1acre / +; LSL-קראסG12D / + דגם העכבר מצמצם את המופע של הלא-הלבלב הראשי גידולים ומחלות13. לכן, חשוב לציין חריגות שאינן לכאורה הלבלב או איברים אחרים במהלך ניתוח ואוסף של דגימות רקמה לבדיקה.
יישומים עתידיים קציר בלבלב עכבר על-ידי ניתוח מאפשרת לסוגים רבים של ניתוח להתנהל על אותה דגימת זרע. הפופולריות ביותר של אלה כוללים, אך אינם מוגבלים, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ hematoxylin ואאוזין היסטולוגיה, אימונוהיסטוכימיה, ספקטרומטר מסה, תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה6,7, 14 , 15. מחלות כמו סוכרת, דלקת לבלב סרטן הלבלב יכול להילמד תוך שימוש בטכניקות הנ ל16.

העכבר התפתחה חשוב במודל חיה של סרטן הלבלב האנושי1,2. ב- Ptf1acre / +; LSL-קראסG12D / + דגם העכבר, קריסטן עכברוש סרקומה (K-Ras) אונקוגן מופעל באופן בלעדי הלבלב, וכתוצאה מכך חניכה של נגעים טרום סרטניים בלבלב, המכונה הלבלב neoplasias intraepithelial הנרתיק (PanINs), לזה ההתקדמות כדי אדנוקרצינומות ductal הלבלב, נפוץ המכונה PDACs3. מערכת מודל זה העכבר מספק אחד מהדגמים הכי זמין בבעלי חיים עבור סרטן הלבלב האנושי4,5, עם יתרון נוסף העולות PanINs בתוך בחמשת החודשים הראשונים של החיים ולעיתים קרובות התקדמות PDAC בתוך יחיד בן4,5, ואילו סרטן הלבלב מתרחשת לעתים קרובות ביותר בבני 60-70 שנים של גיל.
מיצוי של הלבלב על ידי ניתוח של Ptf1acre / +; LSL-קראסG12D / + עכברים בגילאים שונים מאפשרת בדיקה היסטולוגית האורך מקיפה של התפתחות סרטן הלבלב, החל בשלבים המוקדמים הייתה דרך ההתקדמות PDAC3,4 , 5. קצירת הלבלב בגילאים הנעים מ-5 עד חמישה עשר חודשים יכול לשמש גם כדי להכין טישו תמציות לאפיין שינויים כלליים בחילוף החומרים4 הלבלב להתרחש במהלך המעבר בריא רקמה חולה 6,7.
מאמר זה מציג מדריך ויזואלי מלא של כל השלבים הדרושים לביצוע חילוץ הלבלב של העכבר, מספקת קווים מנחים עבור אחסון פוג'אלאדוצ'נוי זהאלאזי לצורך ניתוח נוסף. מדריך זה יהיה שווה ערך עבור יחידים ניסוי על מחלות אחרות הלבלב, לרבות סוג של סוכרת, צריכה להיות שימושית במיוחד סטודנטים, חוקרים חדשים למחקר מעורבים קציר של הלבלב העכבר באמצעות ניתוח פרופיל מטבולי או ניתוחים היסטולוגית.

<table><tbody><tr><td>Glass Jar&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3140-150</td><td>The glass jar used in the video has been discontinued.&amp;nbsp; This is its replacement.</td></tr><tr><td>Lid of Glass Jar</td><td>Corning</td><td>9985-150</td><td>The glass jar lid used in the video has been discontinued.&amp;nbsp; This is its replacement.</td></tr><tr><td>15 mL Falcon Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>9201</td><td></td></tr><tr><td>Squeeze bottle&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-409-10DD</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-103</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>245-684</td><td></td></tr><tr><td>Foam Boards</td><td>Therapak</td><td>562908</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>200205SHN</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 21G Syringes</td><td>BD Biosciences</td><td>309624</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL Microcentrifuge Tubes&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-258</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Pads</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67011</td><td></td></tr><tr><td>T-Pins Length:&amp;nbsp; 2&quot;&amp;nbsp;</td><td>Advance Store Products</td><td>X32T-05</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizing Wipes</td><td>Professional Disposables International Inc.</td><td>Q85084</td><td></td></tr><tr><td>Sharps Container</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-827-122</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Marshall Scientific</td><td>ME-AE200</td><td></td></tr><tr><td>4L Dewar</td><td>Taylor-Wharton</td><td>4LD</td><td></td></tr><tr><td>Shallow Wide Mouth Dewar</td><td>Fisher Scientific</td><td>F3087-V</td><td></td></tr><tr><td>Floating Microtube Rack</td><td>VWR</td><td>60986-100</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Vial 1.2 mL, Sterile</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-25</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia (Isoflurane)&amp;nbsp;</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>050033</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td>Wright Brothers</td><td>NIT-60-XX</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Kras Strain</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>OO8179</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Cre Strain</td><td>MMRRC</td><td>OOO435-UNC</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling

לנו יש כבר חוקרת את הלבלב גורם שעתוק ספציפיים, 1a cre-recombinase; לקס-עצור-סלומון-קריסטן עכברוש סרקומה, גליצין כדי חומצה אספרטית-codon 12 (Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / +) העכבר זן כמודל של סרטן הלבלב אנושי. מטרת המחקר הנוכחי שלנו הוא לזהות סמנים מטבוליים חדשניים של התקדמות סרטן הלבלב. ערכנו פרופיל מטבולי של שתן, צואה, דם, ואת תמציות רקמת הלבלב, כמו גם ניתוחים היסטולוגית של הלבלב לביים את התקדמות סרטן. הלבלב העכבר אינו איבר מוצק מוגדר היטב כמו בבני אדם, אך מעדיף רקמה רכה diffusely מבוזרת לא בקלות המזוהה על-ידי אנשים מכירים את האנטומיה הפנימית העכבר או על ידי יחידים שיש להם מעט או ללא ניסיון ביצוע העכבר איברים והניתוחים. מטרת מאמר זה היא לספק מפורטת step-wise ויזואלית הפגנה מדריך טירונים להסרת הלבלב העכבר על ידי ניתוח. מאמר זה צריך להיות יקר במיוחד סטודנטים, חוקרים חדשים למחקר הדורש קציר בלבלב עכבר על-ידי ניתוח פרופיל מטבולי או ניתוחים היסטולוגית.

איור 1 מציג סקירה של האזור סביבת ההפעלה, איור 2 מציג את אזור הפעולה פוסט. כאשר הגדרה זו מספקת את כמות מינימלית של ציוד, מעצבים, אנשים יכולים לבחור לשנות את זה בצורה הטובה ביותר לצרכים בודדים. הפרוטוקול צריך להיות מוטבת בהתאם לצרכים הספציפיים של הניסוי. ההליך זה מתנהל בצורה שמסיים את חייו של עכבר, הדורשים euthanization תקין9. כאשר החוקר מוכן, העכבר ימוקם תא הרדמה עם הידיות ספוג איזופלוריין (איור 3).
ברגע העכבר מחוסר הכרה, להסיר את העכבר והנח אותו בצד הגבי על הלוח. הליך הבוהן-קמצוץ צריכה להתבצע כדי להבטיח העכבר מגיב לכאב (איור 4). החל 70% אתנול לחטא את האזור החתך הראשוני. ההגרלה דם מסוף שחייבת להתנהל קודם, לפני הסרת הלבלב, כדי להבטיח אחזור דם נאותה. לפני הסרת דם, יש להסיר את קרום הלב כדי למנוע סתימת של המחט 21 גרם הפתיחה. לאחר שסיים את הדם מסוף לצייר, הלב מנותק כשיטה משנית של המתת חסד, הלבלב מוסר לאחר מכן.
התחל על-ידי איתור הבטן, אשר מספק נקודת התחלה טובה להסרת הלבלב (איור 5). הערה: נקטו זהירות כדאי להשתמש במהלך ההסרה של הלבלב, אשר טישו עדין ושברירי, לכן כל הפעולות יש לבצע עם כוח עדין. באמצעות מלקחיים, להתחיל את הקרע החל למשוך בעדינות את הלבלב מן הקיבה ולהמשיך להפריד את רקמת הלבלב הציפוי החיצוני של מערכת העיכול (GI) עובדים מאזור הבטן תריסריון, מעי ו ( איור 6). ברגע caecum מתמלאת, הסרה קלה של הלבלב מושגת על ידי שינוי מיקום המלקחיים כך מלקחיים אחד מחזיק caecum את המלקחיים אחרים משמש כדי להמשיך להפריד הלבלב המעי הגס (איור 7). לאחר הסרה של המעי הגס, הלבלב ממוקם בצד ימין של העכבר ו קבצים מצורפים הנותרים הם כרות(איור 8).
הלבלב צריך להיות התפזרו לבדיקה, חריגות צריך להיות מוקלט (איור 9). ב- Ptf1acre / +; LSL-קראסG12D / + העכבר זן, הלבלב עשויה להכיל פוטנציאל גידול מוקשה (איור 10). איברים אחרים צריך להיבדק גם עבור פוטנציאל גרורות. ברגע הלבלב הוסר, זה צריך להישקל והקליט המשקל. חלק הלבלב snap-קפוא חנקן נוזלי לניתוח העתיד פרופיל מטבולי או בדיקות אחרות וחלק של הלבלב להניחה בפורמלין לבדיקה היסטולוגית בעתיד. איור 11 מציג האחסון הראשונית של איברים שונים שנאספו מכל הקרע לשימוש בניתוח מאוחר יותר. האיברים שנאספו על ידי דיסקציה ומאוחסנים להמשך לימודים יהיה תלוי המטרות של החוקר בודדים.
דגימות רקמות דם יכול לשמש עבור ניתוחים היסטולוגית, פרופיל מטבולי. דוגמה של ניתוח היסטולוגית של רקמת לבלב מוצג באיור12. פרופיל מטבולי יכול להתבצע על דגימות רקמה מוקפאים snap ו דגימת דם. תהודה מגנטית גרעינית נציג ספקטרה ספקטרוסקופיה (NMR) של רכיבי תמציות רקמת הלבלב הידרופיליות, הידרופובי מוצגים איור 13A עם 13 ב', בהתאמה. ספקטרום NMR נציג שנאסף על דגימת נסיוב מקריסטלים של דם נאסף בזמנו של הליך צייר דם מסוף מוצג באיור14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig1.jpg"> 
איור 1 : היערכות של אזור ההפעלה. הפריסה הכללית של כלים נכונים לתנאי התפעול רוברט. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig2.jpg"> 
איור 2 : היערכות שטח פעולה-מאוחרת. הפריסה הכללית של כלים נכונים לתנאי התפעול ההליכים לאחר הניתוח. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig3.jpg"> 
איור 3 : הרדמה תא. סביבה. שמתאימה הרדמה דרך איזופלוריין. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig4.jpg"> 
איור 4 : גירוי בדיקה. לא הוא להיות עברה את המבחן גירוי שנערך על העכבר לפני החתך כדי להבטיח כל כאב או אי נוחות. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig5.jpg"> 
איור 5 : תחילת הסרת הלבלב. הכיוון של העכבר המציין את החילוץ הראשוני של הלבלב, במיקום המצוין על-ידי המלקחיים. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig6.jpg"> 
איור 6 : חילוץ הלבלב לאורך המעי. תהליך של בידוד הלבלב מ מערכת העיכול. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647 alt="Figure 7" class="xfigimg" src=""></img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647>fig7.jpg"/ > 
איור 7 : הסרת הלבלב-Caecum. מיקום מחדש של המלקחיים פעם את caecum נגיש. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig8.jpg"> 
איור 8 : הסרת הלבלב. במקום הלבלב על הצד הימני של העכבר. צריך להיות חתוך המצורפים הנותרים כדי להסיר לחלוטין את הלבלב. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig9.jpg"> 
איור 9 : בדיקה הלבלב. הלבלב עם הטחול המצורפת נבחנת לאחר הסרת מן העכבר. הטחול הוא שמציין החץ האנכי, הלבלב הוא הצביע על ידי החץ האופקי. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig10.jpg"> 
איור 10 : בדיקה הלבלב. הלבלב עם הטחול המצורף מציג גידול בלבלב נבחנת לאחר הסרת מן העכבר. הטחול הוא שמציין החץ האנכי, הלבלב הוא הצביע על ידי החץ האופקי. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig10large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig12.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;">
איור 11 : אחסון של אבריה הוצאו. אחסון המתאים של איברים ודוגמאות אסף, שהוכנו עבור אחסון לטווח ארוך של ניתוח בעתיד. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig11large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig11.jpg" style="opacity: 0.9;"> 
איור 12 : ניתוח היסטולוגית של רקמת הלבלב. Hematoxylin ואאוזין מוכתם תמונות מתוך רקמת הלבלב. א) רקמת הלבלב נורמלי Ptf1acre /-; LSL-קראסG12D /- שליטה בעכבר. B) הייתה רקמת הלבלב של Ptf1acre / +; LSL-קראסG12D / + המחקר העכבר. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig12large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig13.jpg"> 
איור 13 : מטבולית פרופיל ניתוח. פרוטון חד-ממדי תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) ספקטרום של שלב א) הידרופילית ו ב) הידרופובי רכיבים של תמציות רקמת הלבלב בעקבות רקמות המגון ונחשפו כלורופורם/מתנול החילוץ. ספקטרום NMR נרכשו ב 850 מגה-הרץ, המתאימים לשימוש בניתוח פרופיל מטבולי. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig13large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig14.jpg"> 
איור 14 : נציג ספקטרום NMR של נסיוב. הדם הנאסף על-ידי הפרוצדורה צייר דם מסוף יכול לשמש לצורך ניתוח פרופיל מטבולי. ספקטרום נרחב זה מראה אופייני של הפרוטון חד-ממדי 850 מגה הרץ NMR ספקטרום שנאסף על הסרום המתקבל דגימת דם מסוף לצייר. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig14large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling at JoVE.com

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

המאמר וידאו מספק הפגנה מפורט של ההליכים הנדרשים בהצלחה להסיר בלבלב עכבר על-ידי ניתוח עבור ניתוח היסטולוגית והגדרת פרופיל מטבולי.

דיסקציה של הלבלב העכבר עבור ניתוח היסטולוגית והגדרת פרופיל מטבולי

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

dissection-mouse-pancreas-for-histological-analysis-metabolic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

36.5K Views.  Miami University. המאמר וידאו מספק הפגנה מפורט של ההליכים הנדרשים בהצלחה להסיר בלבלב עכבר על-ידי ניתוח עבור ניתוח היסטולוגית והגדרת פרופיל מטבולי.

Video: Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires further study. To understand the mechanisms regulating acinar-to-ductal metaplasia (ADM), ex vivo 3D culture and differentiation of primary acinar cells to ductal cells offers many advantages over other systems. With the technique herein, modulation of protein expression is simple and quick, requiring only one day to isolate, stimulate or virally infect, and begin culturing primary acinar cells to investigate the ADM process. In contrast to using basement membrane matrix, the seeding of acinar cell clusters in collagen I extracellular matrix, allows acinar cells to retain their acinar identity before manipulation. This is vital when testing the contribution of various components to the induction of ADM. Not only are the effects of cytokines or other ectopically administered factors testable through this technique, but the contribution of common mutations, increased protein expression, or knockdown of protein expression is testable via viral infection of primary acinar cells, using adenoviral or lentiviral vectors. Moreover, cells can be re-isolated from collagen or basement membrane matrix at the endpoint and analyzed for protein expression.

Primary acinar cell isolation, protein expression or activity modulation, culture, and down-stream applications are abundantly useful in the ex vivo study of acinar-to-ductal metaplasia (ADM), an early event in the development of pancreatic cancer.

מחקה וטיפול מטפלזיה Acinar-כדי-Ductal הלבלב בתרבות תלת-ממדי תא

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Cancer Research

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.

Here, we describe a method for the isolation of cells in the pancreas microenvironment from embryonic, neonatal and adult mouse tissue, focusing on the isolation of mesenchymal cells. This method allows profiling of cell gene expression and protein secretion in order to elucidate the extrinsic signals that regulate pancreas development, function, and tumorigenesis.

בידוד וניתוח תאים של mesenchyme הלבלב ידי cytometry הזרימה

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Developmental Biology

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Pancreatic Tissue Dissection to Isolate Viable Single Cells

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for approximately 90% of the pancreas and includes cells that produce and secrete digestive enzymes. The digestive enzymes are produced in the pancreatic acinar cells, stored in vesicles called zymogens, and are then released into the duodenum via the pancreatic duct to initiate metabolic processes. The enzymes produced by the acinar cells can kill cells or degrade cell-free RNA. In addition, acinar cells are fragile, and common dissociation protocols result in a large number of dead cells and cell-free proteases and RNases. Therefore, one of the biggest challenges in pancreatic tissue digestion is recovering intact and viable cells, especially acinar cells. The protocol presented in this article shows a two-step method that we developed to meet this need. The protocol can be used to digest normal pancreata, pancreata that include pre-malignant lesions, or pancreatic tumors that include a large number of stromal and immune cells.

Pancreatic metaplastic cells are precursors of malignant cells that give rise to pancreatic tumors. However, isolating intact viable pancreatic cells is challenging. Here, we present an efficient method for pancreatic tissue dissociation. The cells can then be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) or for two- or three-dimensional co-culturing.

דיסקציה של רקמת הלבלב לבידוד תאים בודדים בני קיימא

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for ...

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic beta-cell proliferation and islet growth is particularly challenging. We have developed a method to capture the distribution of beta-cells in the intact pancreas of transgenic mice with fluorescence-tagged beta-cells with a macro written for ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij/). Following pancreatic dissection and tissue clearing, the entire pancreas is captured as a virtual slice, after which the GFP-tagged beta-cells are examined. The analysis includes the quantification of total beta-cell area, islet number and size distribution with reference to specific parameters and locations for each islet and for small clusters of beta-cells. The entire distribution of islets can be plotted in three dimensions, and the information from the distribution on the size and shape of each islet allows a quantitative and qualitative comparison of changes in overall beta-cell area at a glance.

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

The following protocol outlines the process of pancreatic dissection for virtual slice imaging, and the subsequent quantification of all GFP-tagged beta-cells in the entire pancreas.

ב כימות באתרו של המיסה הלבלב בטא תא עכברים

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

Biology

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

התבוננות בתפקוד אי ואינטראקציות תא חיסוני איון בפרוסות רקמת הלבלב חי

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Immunology and Infection

A Mouse Model for Chronic Pancreatitis via Bile Duct TNBS Infusion

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. Several rodent models have been developed to study CP, of which the bile duct 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) infusion model replicates the features of neuropathic pain seen in CP. However, bile duct drug infusion in mice is technically challenging. This protocol demonstrates the procedure of bile duct TNBS infusion for generation of a CP mouse model. TNBS was infused into the pancreas through the ampulla of Vater in the duodenum. This protocol optimized drug volume, surgical techniques, and drug handling during the procedure. TNBS-treated mice showed features of CP as reflected by bodyweight and pancreas weight reductions, changes in pain-associated behaviors, and abnormal pancreatic morphology. With these improvements, mortality associated with TNBS injection was minimal. This procedure is not only critical in generating pancreatic disease models but is also useful in local pancreatic drug delivery.

Chronic pancreatitis (CP) is a disease characterized by inflammation and fibrosis of the pancreas, often associated with intractable abdominal pain. This article focuses on refining the technique to generate a mouse model of CP via bile duct infusion with 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS).

מודל עכבר לדלקת לבלב כרונית באמצעות עירוי TNBS צינור המרה

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. ...

Acinar-to-Ductal Metaplasia Induction: A Method to Study Acinar Cell to Ductal Cell Differentiation in 3D Ex Vivo Culture

Source: Fleming Martinez, A. K. et. al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/59096/" target="_blank">Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the technique of differentiating pancreatic acinar cells to ductal cells in ex vivo 3D culture. This helps to understand the mechanisms regulating the acinar-to-ductal metaplasia (ADM), a key process in the early development of pancreatic cancer.

Acinar-to-ductal metaplasia induction: שיטה לחקר התמיינות תא אצינר לתא דוקטלי בתרבית 3D Ex Vivo

Source: Fleming Martinez, A. K. et. al. Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture. J. Vis. Exp. ...