Name: dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling
Uploaded: 2017-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling at JoVE.com

MAK تعترف بتقديم الدعم لهذا العمل من "المعاهد الوطنية للصحة"/منح المعهد الوطني للسرطان رقم-1R15CA152985-01A1. كما دعمت هذا المشروع "ميامي جامعة الدراسات الجامعية البحوث جائزة البرنامج"، الفرص الجامعية الدكتوراه جامعة ميامي لبرنامج المنح الدراسية وبرنامج الباحثين الصيف جامعة ميامي.

الإجراءات التي نفذت في شريط الفيديو وهو موضح أدناه عليها "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة ميامي-
 1-إعداد واختبار التحفيز <ol><li>تأسيس اثنين مجالات متميزة لإجراء العمليات الجراحية وطاولة العمليات والجدول بعد انتهاء العملية. المرحلة كلا المجالين مع جميع المواد والأدوات اللازمة.
	الجدول <ol><li>المرحلة تعمل تحت غطاء التهوية. ترتيب الجدول بالمعدات بطريقة تسمح بأداء الإجراء مستمر ودون عوائق.</li>
		إنشاء <li>جدول بعد العملية الجراحية في نفس الغرفة والقرب من الجدول الرئيسي للعملية. الحفاظ على كلا الجدولين بيئات معقمة طوال فترة الإجراءات.</li>
	</ol></li> <li>مكان ما يلي اللوازم على طاولة العمليات: جرة زجاج واحد مع غطاء وأنبوب 15 مل واحد وزوج واحد من مقص الجراحة، وضغط واحد زجاجة من الإيثانول 70%، والمجلسين الرغوة، الملقط اثنين، هما محاقن قياس 1 مل 21، أنبوبين 50 مل، أنبوب أحد أجهزة الطرد المركزي ، قنينة المبردة واحدة وأربع منصات الجراحية والدبابيس عشرة، موزع مناديل تعقيم وحاوية الأدوات الحادة-</li>
	<li>وضع الإمدادات التالية على الجدول بعد انتهاء العملية: واحد تحليلية التوازن، أحد ديوار ل 4 من النتروجين السائل، ضحلة واسعة الفم ديوار ورف microtube عائمة وزوج واحد من مقص الجراحة، الملقط اثنين، أربعة قنينات المبردة وموزع ل مناديل معقمة.</li>
	<li>ملء واحدة 50 مل وأنبوب 15 مل واحد بحجم 75% مع الفورمالين.</li>
	<li>استخدام pin في كل زاوية، إلصاق لوحة الجراحية واحد إلى هيئة رغوة تقريبي 30 × 30 سم ليكون بمثابة مجلس تشريح. استخدام دبابيس الأربع المتبقية خلال العملية. إعداد لوحة رغوة أصغر مع لوحة العمليات جراحية لنقل الأجهزة إلى الجدول بعد العملية. 
	تنبيه: إيسوفلوراني (99.9%) المواد كيميائية سامة، وينبغي أن تستخدم في غطاء تنفيس لضمان أقصى مستوى من الأمان من مسح النفايات غاز مخدر 8. يمكن العثور على معلومات إضافية فيما يتعلق بالمخاطر التي يتعرض لها الباحثون المقترنة باستخدام الأسلوب فتح المنسدلة استخدام إيسوفلوراني في مقال ب تايلور وموك 8-</li>
	<li>وضع لوح الجراحية واحد في جرة زجاجية ونقع مع بضع قطرات من إيسوفلوراني (99.9%) ثم ضع منشفة ورقية عبر الجزء العلوي للحيلولة دون الاتصال المباشر للماوس مع إيسوفلوراني. وبالمثل، استخدام لوحة العمليات جراحية لخط الأنبوب المتبقي ونقع مع بضع قطرات من إيسوفلوراني ووضع لوحة إضافية عبر الجزء العلوي للحيلولة دون الاتصال المباشر بين الماوس وإيسوفلوراني.</li>
	<li>صب النتروجين السائل في فم واسعة الضحلة هو التوصل إلى ديوار حتى الحد الأقصى لملء خط-</li>
	<li>مكان الماوس المحدد للتشريح في التخدير للدائرة، أي قطرات جرة زجاج مع لوحة غارقة مع عدد قليل من إيسوفلوراني (99.9%) مغطاة بالغطاء، لدقيقة ~ 1 
	ملاحظة: يختلف هذا الوقت من الماوس. مرة واحدة الماوس فاقد الوعي، إزالته من الدائرة ووضعه على لوحة التشغيل.</li>
	<li>توجيه الماوس حيث أن ذلك هو الكذب الجانب البطني ومع رئيسها وأشار بعيداً عن العالم. وضع الرأس داخل أنبوب مبطنة بوسادة جراحية غارقة مع بضع قطرات من إيسوفلوراني (99.9%)، وإجراء اختبار تحفيز برشة سيرا على أقدام التأكد من أن الماوس لا يستجيب للمنبهات.
	<ol><li>إذا فشل هذا الاختبار والماوس يستجيب لاختبار قرصه سيرا على الأقدام، كرر الخطوة 1.8.</li>
	</ol></li></ol> 2. الأولى شق وثقب القلب والقتل الرحيم <ol><li>دبوس أطرافه الماوس للمجلس رغوة الجراحية والرطب في الجانب البطني من الماوس مع الإيثانول 70%-</li>
	<li>قرصه الفراء/الجلد بالقرب من افتتاح الاحليل مع الملقط وسحب إلى أعلى قليلاً. جعل شق بالمقص الجراحي عن طريق تجويف البطن ابتداء من فتح الاحليل، خط الوسط وتنتهي في الذقن.
	<ol><li>قرب نقطة انطلاق لشق الأولى، الاستيلاء على جانب واحد من الجلد/الفراء مع الملقط وجعل شق آخر مع المقص إلى الأسفل وقطرياً نحو مخلب الظهر.</li>
		<li>كرر هذا بنفس الطريقة على الجانب الآخر- 
		ملاحظة: قد يكون تمركزها إلى خلق فرصة أوسع الفراء/الجلد، ولكن ليس من الضروري-</li>
	</ol></li> <li>موقع القلب وإزالة تامور، وهو الكيس حول القلب، لتجنب انسداد من إبرة المحقن.
	فهم تامور مع الملقط <ol><li>وقطع عليه مع المقص. إجراء ثقب القلب بإدخال إبرة حقنه بعناية في قلب ينبض وتبدأ ببطء لسحب المكبس.</li>
		<li>لجمع الدم الأمثل، واستخدام المكبس الإبرة لتقليد عمل الضخ للقلب وتجنب الرسم بسرعة كبيرة جداً- 
		ملاحظة: عادة حوالي 1 مل دم يمكن جمعها-</li>
		<li>بعد الانتهاء من جمع الدم، تبديد الدم في أنبوب جهاز الطرد المركزي والتخلص من المحاقن في حاوية الأدوات الحادة-</li>
		<li>بعد أن يتم إجراء ثقب القلب، القيام بالقتل الرحيم بإزالة المرفقات يربط القلب. 
		ملاحظة: لم يتم إضافة الهيبارين، تخثر المضادة، لحقنه في هذا الإجراء قبل ثقب القلب للسماح للدم يتجمد لجمع المصل في هذه الدراسة المحددة. ومع ذلك، إذا أراد الباحث أن منع تخثر الدم جمع البلازما، يمكن إضافة الهيبارين للمحاقن قبل ثقب القلب-</li>
	</ol></li> <li>إذا كان ينطوي الدراسة الوراثي للفأرة، قص جزء من الإذن مع المقص ووضع في أنبوب الطرد مركزي لتحقق وراثي.</li></ol>
 3-"استخراج البنكرياس" <ol><li>تحديد موقع المعدة على الجانب الأيسر للماوس. تبدأ بلطف (لتجنب تمزيق) فصل البنكرياس من المعدة والاثني عشر باستخدام الملقط اثنين. 
	ملاحظة: عند فصل البنكرياس من المعدة والأمعاء، من المهم جداً أن الملقط تستخدم بلطف دليل نسيج البنكرياس بعيداً عن الأجهزة وعدم سحق أو المسيل للدموع البنكرياس مع الملقط.
	<ol><li>الاستمرار في فصل البنكرياس من أقسام الأمعاء صائم والدقاق، وأخيراً من الأعور الأمعاء الغليظة.</li>
	</ol></li> <li>في الأعور، تغيير موضع الملقط ومواصلة الفصل بين البنكرياس على طول القولون المتبقية نحو المستقيم. 
	ملاحظة: عند هذه النقطة، أنها ملائمة لخفض وإزالة الجزء من المعدة إلى منطقة القولون السابقة مباشرة للمستقيم.</li>
	<li>تحديد موقع البنكرياس والطحال. شريحة البنكرياس نحو الجانب الأيمن من الماوس. فصل الاتصالات المتبقية بين البنكرياس وتجويف الصدر بالملقط لفصل كامل البنكرياس والطحال ملاصقة.</li>
	<li>إزالة البنكرياس وانتشرت للفحص. اترك الطحال يعلق على البنكرياس لأغراض تحديد الهوية.
	النسيج الضام <ol><li>إزالة الكل، والأنسجة والدهون والمساريقي العلوي من البنكرياس. 
		ملاحظة: هذا النسيج بياضا في اللون وهكذا يمكن تمييزها بسهولة عن أنسجة البنكرياس هو وردي اللون. هذا مهم خاصة إذا كان البنكرياس كله يحتاج إلى إزالة. على سبيل المثال، إذا كان البنكرياس بحاجة إلى موازنة ومقارنة مع وزن الجسم، أو بين مجموعات من الحيوانات. في Ptf1a cre/+؛ LSL-كراس G12D/+ نموذج الماوس، وعلى وجه التحديد في الشهور القديمة، يمكن أن تكون أنسجة البنكرياس الليفي الثابت الحالي. وفي هذه الحالة، يجب أن تتم إزالة حذراً من البنكرياس كما يمكن أن يكون متشابك الأمعاء في أنسجة الورم. في الحالات المتقدمة، الطحال غير طبيعي ونسيج الكبد قد يكون أيضا هذا-</li>
	</ol></li> <li>إذا كان مطلوباً، إزالة الأجهزة الأخرى عند هذه النقطة.</li></ol>
 4-جمع البيانات وتخزينها <ol><li>بعد استخراج الأجهزة، نقل العينات إلى منطقة ما بعد الجراحة للحفاظ على-</li>
	<li>تزن كل جهاز ووضعها في قنينة المبردة كل منهما. 
	ملاحظة: على طول فيتح الشامل لكل عينة، ينبغي أن تسجل أي مخالفات للرجوع إليها في المستقبل-</li>
	<li>حالما يتم وزن الأجهزة، وضعها في النيتروجين السائل لتجميد المفاجئة.</li>
	<li>بعد تجميد المفاجئة، تخزين الأجهزة في-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.</li>
	<li>بوضع عينات الفورمالين المخزنة في أعلى هيئة بين عشية وضحاها، وصباح اليوم التالي بتغيير حل بهم من الفورمالين إلى إيثانول 70%- 
	ملاحظة: يجب تخزين هذه العينات عند 4 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.</li>
	<li>للتخزين على المدى الطويل، تجميد لكمه الدم والإذن في-80 درجة مئوية. لجمع المصل من الدم، تسمح للدم أن يتجمد لمدة 30 دقيقة ثم الطرد المركزي أنه. إزالة الجزء المصل باستخدام ماصة ومن ثم تخزين في-80 درجة مئوية.</li>
</ol> 5. تنظيف <ol><li>سانيتيزي جميع تشريح مع مناديل تعقيم أدوات. غطاء أنبوب تصطف isoflurane غارقة في لوحة العمليات الجراحية. استبدال لوحة المفاتيح الجراحية على متن الرغوة مع لوحة جراحة طازجة. التصرف في أجزاء الماوس التي جمعت لا كل المرفق &#39; سياسة التخلص من الحيوانات s-</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fesinmeyer, M. D., Austin, M. A., Li, C. I., De Roos, A. J., Bowen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+Survival+by+Histologic+Type+of+Pancreatic+Cancer.">Differences in Survival by Histologic Type of Pancreatic Cancer.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 14 (7), 1766-1773 (2005).</li><li>Jackson-Grusby, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+cancer+in+mice.">Modeling cancer in mice.</a> Oncogene. 21 (35), 5504-5514 (2002).</li><li>Heid, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+requirement+of+Rac1+in+a+mouse+model+of+pancreatic+cancer.">Early requirement of Rac1 in a mouse model of pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 141 (2), 719-730 (2011).</li><li>Hingorani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+and+invasive+ductal+pancreatic+cancer+and+its+early+detection+in+the+mouse.">Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse.</a> Cancer cell. 4 (6), 437-450 (2003).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS2+Mutations+in+Human+Pancreatic+Acinar-Ductal+Metaplastic+Lesions+Are+Limited+to+Those+with+PanIN+Implications+for+the+Human+Pancreatic+Cancer+Cell+of+Origin.">KRAS2 Mutations in Human Pancreatic Acinar-Ductal Metaplastic Lesions Are Limited to Those with PanIN Implications for the Human Pancreatic Cancer Cell of Origin.</a> Mol Cancer Res. 7 (2), 230-236 (2009).</li><li>LaConti, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+serum+metabolomics+profiles+associated+with+malignant+progression+in+the+KrasG12D+mouse+model+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Distinct serum metabolomics profiles associated with malignant progression in the KrasG12D mouse model of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> BMC Genomics. 16 (1), 1-10 (2015).</li><li>Ludwig, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+the+serologic+proteome+in+a+tissue-specific+kras(G12D)+knockin+mouse+model+of+pancreatic+cancer.">Surveying the serologic proteome in a tissue-specific kras(G12D) knockin mouse model of pancreatic cancer.</a> Proteomics. 16 (3), 516-531 (2016).</li><li>Taylor, D. K., Mook, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+Waste+Anesthetic+Gas+Concentrations+Associated+with+the+Open-Drop+Method.">Isoflurane Waste Anesthetic Gas Concentrations Associated with the Open-Drop Method.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 61-64 (2009).</li><li>Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sample+collection+in+small+laboratory+animals.">Blood sample collection in small laboratory animals.</a> J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).</li><li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).</li><li>Auer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+frozen+tissue+storage+conditions+on+the+integrity+of+RNA+and+protein.">The effects of frozen tissue storage conditions on the integrity of RNA and protein.</a> Biotech Histochem. 89 (7), 518-528 (2014).</li><li>Ma, J., Leung, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbic+System+Participates+in+Mediating+the+Effects+of+General+Anesthetics.">Limbic System Participates in Mediating the Effects of General Anesthetics.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 1177-1192 (2006).</li><li>Ijichi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggressive+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+in+mice+caused+by+pancreas-specific+blockade+of+transforming+growth+factor-&#946;+signaling+in+cooperation+with+active+Kras+expression.">Aggressive pancreatic ductal adenocarcinoma in mice caused by pancreas-specific blockade of transforming growth factor-&#946; signaling in cooperation with active Kras expression.</a> Genes Dev. 20 (22), 3147-3160 (2006).</li><li>Abiatari, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin-dependent+cytoskeleton+remodelling+is+associated+with+an+anaplastic+phenotype+of+pancreatic+cancer.">Moesin-dependent cytoskeleton remodelling is associated with an anaplastic phenotype of pancreatic cancer.</a> J Cell Mol Med. 14 (5), 1166-1179 (2010).</li><li>Goodpaster, A. M., Romick-Rosendale, L. E., Kennedy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Statistical+significance+analysis+of+nuclear+magnetic+resonance-based+metabonomics+data.">a Statistical significance analysis of nuclear magnetic resonance-based metabonomics data.</a> Analytical biochemistry. 401, 134-143 (2010).</li><li>Yadav, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+Tumefactive+Chronic+Pancreatitis:+Clinical+Profile,+Histology,+and+Natural+History+After+Resection.">Idiopathic Tumefactive Chronic Pancreatitis: Clinical Profile, Histology, and Natural History After Resection.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 1 (2), 129-135 (2003).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

أهمية فيما يتعلق بالأساليب القائمة على الرغم من وجود أشرطة فيديو أخرى غير رسمية لتشريح الفأر، توفر هذه المقالة الفيديو الجودة الفنية الأولى، واستعراض النظراء، مظاهرة البصرية لجميع الخطوات التفصيلية المطلوبة للاستخراج وحصاد البنكرياس الماوس بتشريح10 . مع البنكرياس جهاز الرئيسي للنشاط الأيضي والإنسولين ويجري إنتاج وتشريح وحصاد البنكرياس يسمح للحفاظ على الخصائص الفسيولوجية11. بعزل البنكرياس، يمكن إجراء التحليل في المستقبل على العينة. يسمح هذا الإجراء للمقارنة ودراسة التفاعلات بين من الأنسجة الأخرى داخل نفس الكائن الحي داخل نفس الإطار الزمني.
القيود المفروضة على هذه التقنية الحد أعظم من هذا الإجراء إنهاء الحياة الماوس، مما يحول دون جمع الطولي وأخذ عينات من عينات الأنسجة المتعددة من الماوس نفسه. من أجل تحليل الاتجاهات المتصلة بالعمر، والجنس، أو محددات الكمية الأخرى، يجب أن ينفذ عدد سكانها مستعرضة، كما فعلنا لدراستنا للمؤشرات الحيوية الأيضية لسرطان البنكرياس. قيد آخر من هذا البروتوكول هو عدم القدرة على إيقاف هذا الإجراء. بمجرد بدء يوثانيزيشن، يجب أن تنفذ الإجراء برمته.
الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول تنفيذ اختبار التحفيز معسر مخلب هند الماوس أمر حاسم لضمان أن يتلقى الماوس معاملة إنسانية. إذا كان الماوس لا تستجيب لهذا الحافز، ثم الإجراء قد تنفذ كما هو مخطط لها. ومع ذلك، يجب عرض الماوس استجابة الأسى نتيجة اختبار التحفيز، الماوس تعاد إلى دائرة التخدير لفترة إضافية من الوقت والاختبار وتتكرر حتى لا يلاحظ رد فعل لاختبار التحفيز12.
وبالمثل، ثقب قلب المحطة الطرفية متبوعاً بإزالة الاتصالات إلى القلب فورا بعد أن يتم جمع عينة الدم الطرفية كما يضمن أسلوب القتل الرحيم ثانوية تضحية إنسانية بالماوس. الكفيلة رسم دم فعالة، ينبغي أن تستخدم العلماء حركة ضخ مع المحاقن مشابهة للقلب النابض للماوس، السماح لجمع الحد الأقصى من الدم للتحليل.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها التبديل بين الأجهزة من الفورمالين إلى حلول الإيثانول 70% تعد أجهزة لعملية الدمج اللازمة للتحليل النسيجي. حلول تخزين مختلفة قد تكون مطلوبة يجب اختيار العلماء لإجراء تجارب أخرى مع الأجهزة. قبل التحليل، من المهم للحد من أي جمود المحتملة الأجهزة مخزنة في الثلاجة-80 درجة مئوية للحفاظ على سلامة الجهاز.
استخدام Ptf1acre/+؛ LSL-كراسG12D/+ طراز الماوس يقلل من الحدوث غير البنكرياس الأورام والأمراض الرئيسية13. وبالتالي، من المهم ملاحظة أي مخالفات جلية للبنكرياس أو الأجهزة الأخرى أثناء التشريح وجمع عينات الأنسجة لتحليلها.
التطبيقات المستقبلية حصاد البنكرياس الماوس بتشريح يسمح لأنواع متعددة من التحليل على نفس العينة. الأكثر شعبية من هذه تشمل، ولكن لا تقتصر على، مجهرية الأسفار وتوضع والأنسجة ويوزين، إيمونوهيستوتشيميستري، الكتلي ومطيافيه الرنين المغناطيسي النووي6،7، 14 , 15-الأمراض مثل مرض السكري والتهاب البنكرياس وسرطان البنكرياس يمكن دراستها باستخدام التقنيات المذكورة أعلاه16.

وبرز الماوس حيوان نموذجا هاما لسرطان البنكرياس البشرية1،2. في Ptf1acre/+؛ LSL-كراسG12D/+ طراز الماوس، كريستين السرطاني كابوزي (ك-Ras) الفئران يتم تنشيط حصرا في البنكرياس، أسفر عن البدء بأورام في البنكرياس، المعروف باسم نيوبلاسياس للسيتولوجيا البنكرياس (بانينس)، أن التقدم للبنكرياس adenocarcinomas الأقنية، يشار إليها باسم بدأكس3. ويتيح هذا النظام النموذجي الماوس واحدة من أفضل النماذج الحيوانية المتاحة لسرطان البنكرياس البشرية4،5، مع ميزة إضافية التي تظهر بانينس خلال الأشهر الخمسة الأولى من الحياة، وكثيراً ما تقدم إلى بدك داخل واحد السنة4،5، في حين أن سرطان البنكرياس يحدث غالباً في البشر 60-70 سنة عمر.
استخراج البنكرياس بالتشريح من Ptf1acre/+؛ LSL-كراسG12D/+ الفئران في مختلف الإعمار يسمح لدراسة نسيجية طولية تفصيلية للتنمية سرطان في البنكرياس، بدءاً من أولى مراحل بانين من خلال التقدم إلى بدك3،4 , 5-حصاد البنكرياس في سن تتراوح ما بين خمسة إلى خمسة عشر شهرا يمكن أن تستخدم أيضا لإعداد الأنسجة مقتطفات لتوصيف التغيرات العالمية في البنكرياس4 الأيض التي تحدث أثناء الانتقال من صحية إلى الأنسجة المريضة 6،7.
هذه المقالة يعرض دليل مرئي كاملة للخطوات المطلوبة للقيام استخراج بنكرياس ماوس ويوفر مبادئ توجيهية للتخزين البنكرياس لمزيد من التحليل. هذا الدليل سوف تكون ذات قيمة متساوية للأفراد إجراء بحوث بشأن أمراض البنكرياس الأخرى، بما في ذلك مرض السكري من النوع الأول، وينبغي أن يكون مفيداً بشكل خاص للطلاب والباحثين جديدة للأبحاث المتعلقة بحصاد من البنكرياس الماوس باستخدام تشريح للتنميط الأيضية أو تحليلات النسيجي.

<table><tbody><tr><td>Glass Jar&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3140-150</td><td>The glass jar used in the video has been discontinued.&amp;nbsp; This is its replacement.</td></tr><tr><td>Lid of Glass Jar</td><td>Corning</td><td>9985-150</td><td>The glass jar lid used in the video has been discontinued.&amp;nbsp; This is its replacement.</td></tr><tr><td>15 mL Falcon Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>9201</td><td></td></tr><tr><td>Squeeze bottle&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-409-10DD</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-103</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>245-684</td><td></td></tr><tr><td>Foam Boards</td><td>Therapak</td><td>562908</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>200205SHN</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 21G Syringes</td><td>BD Biosciences</td><td>309624</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL Microcentrifuge Tubes&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-258</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Pads</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67011</td><td></td></tr><tr><td>T-Pins Length:&amp;nbsp; 2&quot;&amp;nbsp;</td><td>Advance Store Products</td><td>X32T-05</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizing Wipes</td><td>Professional Disposables International Inc.</td><td>Q85084</td><td></td></tr><tr><td>Sharps Container</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-827-122</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Marshall Scientific</td><td>ME-AE200</td><td></td></tr><tr><td>4L Dewar</td><td>Taylor-Wharton</td><td>4LD</td><td></td></tr><tr><td>Shallow Wide Mouth Dewar</td><td>Fisher Scientific</td><td>F3087-V</td><td></td></tr><tr><td>Floating Microtube Rack</td><td>VWR</td><td>60986-100</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Vial 1.2 mL, Sterile</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-25</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia (Isoflurane)&amp;nbsp;</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>050033</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td>Wright Brothers</td><td>NIT-60-XX</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Kras Strain</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>OO8179</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Cre Strain</td><td>MMRRC</td><td>OOO435-UNC</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling

لقد تم التحقيق عامل النسخ المحددة البنكرياس، 1a cre-ريكومبيناسي؛ ساركومه لوكس-توقف-لوكس-كريستين الفئران، جليكاين لحمض الأسبارتيك في كودون 12 (Ptf1acre/+؛ لسلكراسG12D/+) الفأر سلالة كنموذج للبشرية سرطان البنكرياس. لدينا الدراسات الحالية يهدف إلى تحديد المؤشرات الحيوية الأيضية رواية لتطور سرطان البنكرياس. وقد أجرينا التنميط الأيضية للبول، والبراز، والدم، ومقتطفات أنسجة البنكرياس، فضلا عن تحليلات النسيجي لمرحلة تطور سرطان البنكرياس. البنكرياس الماوس ليس جهازا صلبة محددة تحديداً جيدا مثل البشر، ولكن بدلاً من ذلك هو أنسجة ناعمة تصطبغ موزعة التي لم تحدد بسهولة من الأفراد غير مألوف مع الماوس التشريح الداخلي أو عن طريق الأفراد التي لديها القليل أو لا القيام بتجربة تشريح جهاز الماوس. والغرض من هذه الوثيقة تقديم مفصل المجوعات مظاهرة البصرية دليل المبتدئين في إزالة البنكرياس الماوس بالتشريح. ينبغي أن تكون هذه المادة ذات قيمة خاصة للطلاب والباحثين جديدة للبحوث التي يتطلب الحصاد البنكرياس الماوس بتشريح للتنميط الأيضية أو تحليلات النسيجي.

ويبين الشكل 1 نظرة عامة مجال البيئة التشغيلية، ويبين الشكل 2 في مجال تشغيل وظيفة. وبينما يوفر هذا الإعداد الحد الأدنى من المعدات والتدريج، يجوز اختيار الأفراد لتغيير هذا لتناسب الاحتياجات الفردية. ينبغي أن يكون الأمثل في البروتوكول وفقا للاحتياجات المحددة للتجربة. ويجري هذا الإجراء بطريقة ينهي حياة الفأر، التي تتطلب يوثانيزيشن السليم9. عند الباحث جاهزاً، يتم وضع الماوس في غرفة التخدير مع منصات غارقة في إيسوفلوراني (الشكل 3).
مرة واحدة الماوس فاقد الوعي، إزالة الماوس ووضعه الجانب الظهرية على المجلس. تو-رشة ينبغي إجراء للتأكد من أن الماوس لا يستجيب للألم (الشكل 4). تطبيق الإيثانول 70% لتعقيم منطقة الشق الأولى. يجب أن يتم سحب الدم الطرفي أولاً، قبل إزالة البنكرياس، لضمان استرجاع الدم كافية. قبل إزالة الدم، يجب إزالة تامور لمنع انسداد الإبرة ز 21 فتح. بعد الانتهاء من الدم الطرفي رسم ويتم فصل القلب كوسيلة ثانوية للقتل الرحيم وثم يتم إزالة البنكرياس.
ابدأ بتحديد موقع المعدة، والذي يوفر نقطة انطلاق جيدة لإزالة البنكرياس (الشكل 5). ملاحظة: ينبغي ممارسة الحذر الشديد أثناء إزالة البنكرياس، وأنسجة الحساسة والهشة، ولذلك ينبغي إجراء جميع العمليات مع قوة لطيف. استخدام الملقط، يبدأ التشريح بالبدء في سحب بلطف البنكرياس بعيداً عن المعدة ولا تزال تفصل أنسجة البنكرياس الخارجي بطانة الجهاز الهضمي (غي) تعمل من المعدة والعفج وصائم والدقاق ( 6 الرقم). حالما يتم التوصل إلى الأعور، يتحقق أسهل إزالة البنكرياس بإعادة تموضع الملقط حتى أن الملقط واحد هو عقد الأعور ويستخدم الملقط الأخرى الاستمرار في فصل البنكرياس من الأمعاء الغليظة (الشكل 7). بعد إزالة من الأمعاء الغليظة، البنكرياس يوضع على الجانب الأيمن من الماوس وأي مرفقات المتبقية هي قطعت(الشكل 8).
ينبغي أن يكون البنكرياس وانتشر للتفتيش، وأي شذوذ ينبغي تسجيلها (الشكل 9). في Ptf1acre/+؛ LSL-كراسG12D/+ الماوس السلالة، البنكرياس يمكن أن يحتمل أن تحتوي على ورم تصلب (الشكل 10). وينبغي أيضا دراسة الأجهزة الأخرى لورم خبيث المحتملة. بمجرد إزالة البنكرياس، فإنه ينبغي أن يكون وزنه وسجلت الوزن. ينبغي أن يكون جزء من البنكرياس المجمدة المفاجئة في النتروجين السائل للتحليل الأيضي التنميط في المستقبل أو التجارب الأخرى وجزء من البنكرياس ينبغي أن توضع في فورمالين للتحليل النسيجي في المستقبل. يبين الشكل 11 التخزين الأولية لمختلف أجهزة جمعها من تشريح للاستخدام في تحليلها في وقت لاحق. أجهزة التشريح بجمعها وتخزينها لمزيد من الدراسة سوف تعتمد على أهداف الباحث الفردية.
يمكن استخدام عينات الدم والأنسجة لإجراء تحاليل نسيجية والتنميط الأيضية. ويرد مثال التحليل النسيجي للأنسجة البنكرياس في الشكل 12. التنميط الأيضية يمكن أن تجري على عينات الأنسجة المجمدة المفاجئة وعينه الدم. الممثل الرنين المغناطيسي النووي الطيفي (الرنين المغناطيسي النووي) أطياف مكونات ماء ومسعور من مقتطفات أنسجة البنكرياس تظهر في الشكل 13A و 13B، على التوالي. ويرد في الشكل 14طيف الرنين المغناطيسي النووي ممثل جمعت عينة مصل أعدت من الدم التي جمعت في وقت إجراء سحب الدم الطرفي.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig1.jpg"> 
الشكل 1 : انطلاق تشغيل المنطقة. التخطيط العام للأدوات الصحيحة وظروف التشغيل للتشريح. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig2.jpg"> 
الشكل 2 : انطلاق من المنطقة بعد انتهاء العملية. التخطيط العام للأدوات الصحيحة وظروف التشغيل للحصول على إجراءات ما بعد الجراحة. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig3.jpg"> 
الشكل 3 : دائرة التخدير. البيئة المناسبة للتخدير عن طريق إيسوفلوراني. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig4.jpg"> 
الشكل 4 : دراسة التحفيز. يجري هو عدم تحمل اختبار التحفيز التي أجريت على الماوس قبل شق الأولية لضمان أي ألم أو إزعاج. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig5.jpg"> 
الشكل 5 : تبدأ إزالة البنكرياس. اتجاه الماوس مشيراً إلى استخراج الأولية في البنكرياس، الموقع المشار إليه بالملقط. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig6.jpg"> 
الرقم 6 : استخراج البنكرياس على طول الأمعاء. عملية عزل البنكرياس من الجهاز الهضمي. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647 alt="Figure 7" class="xfigimg" src=""></img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647>fig7.jpg "/> 
الشكل 7 : إزالة البنكرياس في الأعور. هو التوصل إلى إعادة تموضع الملقط مرة الأعور. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig8.jpg"> 
الشكل 8 : إزالة البنكرياس. مكان البنكرياس على الجانب الأيمن من الماوس. يجب قطع أي مرفقات المتبقية لإزالة البنكرياس تماما. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig8large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig9.jpg"> 
الرقم 9 : فحص البنكرياس. البنكرياس مع الطحال المرفقة التي يجري بحثها بعد إزالة من الماوس. يشار الطحال بواسطة السهم الرأسي، ويشار في البنكرياس بواسطة السهم الأفقي. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig9large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig10.jpg"> 
الرقم 10 : فحص البنكرياس. البنكرياس مع الطحال المرفقة عرض ورم البنكرياس يجري بحثها بعد إزالة من الماوس. يشار الطحال بواسطة السهم الرأسي، ويشار في البنكرياس بواسطة السهم الأفقي. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig10large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig12.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;">
الرقم 11 : تخزين أجهزة إزالة. التخزين المناسبة للأجهزة والعينات التي تم جمعها، المعدة للتخزين على المدى الطويل والتحليل في المستقبل. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig11large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig11.jpg" style="opacity: 0.9;"> 
الرقم 12 : تحليل النسيجي أنسجة البنكرياس. توضع وويوزين الملون الصور من أنسجة البنكرياس. A) أنسجة البنكرياس عادي من Ptf1acre/--؛ LSL-كراسG12D/- التحكم الماوس. ب) بانين أنسجة من البنكرياس من Ptf1acre/+؛ LSL-كراسG12D/+ الماوس الدراسة. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig12large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig13.jpg"> 
الرقم 13 : التنميط التحليل الأيضي. الرنين المغناطيسي النووي الطيفي (الرنين المغناطيسي النووي) بروتون أحادي البعد أطياف مكونات المرحلة A) ماء وب) مسعور من مقتطفات أنسجة البنكرياس بعد تجانس الأنسجة وتعرض لاستخراج كلوروفورم/الميثانول. أطياف الرنين المغناطيسي النووي تم الحصول عليها في 850 ميغاهيرتز، وهي مناسبة للاستخدام في تحليل التنميط الأيضية. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig13large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig14.jpg"> 
الرقم 14 : الممثل طيف الرنين المغناطيسي من المصل. يمكن استخدام الدم جمعت بإجراء سحب الدم الطرفي لتحليل التنميط الأيضية. ويبين هذا الطيف نموذجي بروتون أحادي الأبعاد 850 ميغاهرتز الرنين المغناطيسي النووي الطيف التي جمعت في مصل الدم التي تم الحصول عليها من عينة رسم دم طرفي. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig14large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling at JoVE.com

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

توفر هذه المقالة الفيديو مظاهرة تفصيلاً الإجراءات اللازمة لإزالة البنكرياس بنجاح من ماوس بتشريح للتحليل النسيجي والتنميط الأيضية.

تشريح البنكرياس الماوس للتحليل النسيجي والتنميط الأيضية

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

dissection-mouse-pancreas-for-histological-analysis-metabolic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

36.5K Views.  Miami University. توفر هذه المقالة الفيديو مظاهرة تفصيلاً الإجراءات اللازمة لإزالة البنكرياس بنجاح من ماوس بتشريح للتحليل النسيجي والتنميط الأيضية.

Video: Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires further study. To understand the mechanisms regulating acinar-to-ductal metaplasia (ADM), ex vivo 3D culture and differentiation of primary acinar cells to ductal cells offers many advantages over other systems. With the technique herein, modulation of protein expression is simple and quick, requiring only one day to isolate, stimulate or virally infect, and begin culturing primary acinar cells to investigate the ADM process. In contrast to using basement membrane matrix, the seeding of acinar cell clusters in collagen I extracellular matrix, allows acinar cells to retain their acinar identity before manipulation. This is vital when testing the contribution of various components to the induction of ADM. Not only are the effects of cytokines or other ectopically administered factors testable through this technique, but the contribution of common mutations, increased protein expression, or knockdown of protein expression is testable via viral infection of primary acinar cells, using adenoviral or lentiviral vectors. Moreover, cells can be re-isolated from collagen or basement membrane matrix at the endpoint and analyzed for protein expression.

Primary acinar cell isolation, protein expression or activity modulation, culture, and down-stream applications are abundantly useful in the ex vivo study of acinar-to-ductal metaplasia (ADM), an early event in the development of pancreatic cancer.

محاكاة والتلاعب في البنكرياس حؤول Acinar للأقنية في ثقافة الخلية 3 الأبعاد

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Cancer Research

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.

Here, we describe a method for the isolation of cells in the pancreas microenvironment from embryonic, neonatal and adult mouse tissue, focusing on the isolation of mesenchymal cells. This method allows profiling of cell gene expression and protein secretion in order to elucidate the extrinsic signals that regulate pancreas development, function, and tumorigenesis.

عزل وتحليل خلايا البنكرياس اللحمة المتوسطة عن طريق التدفق الخلوي

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Developmental Biology

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

تحليلات ترانسكريبتوميك خلية واحدة من خلايا الغدد الصماء البنكرياس الماوس

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Pancreatic Tissue Dissection to Isolate Viable Single Cells

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for approximately 90% of the pancreas and includes cells that produce and secrete digestive enzymes. The digestive enzymes are produced in the pancreatic acinar cells, stored in vesicles called zymogens, and are then released into the duodenum via the pancreatic duct to initiate metabolic processes. The enzymes produced by the acinar cells can kill cells or degrade cell-free RNA. In addition, acinar cells are fragile, and common dissociation protocols result in a large number of dead cells and cell-free proteases and RNases. Therefore, one of the biggest challenges in pancreatic tissue digestion is recovering intact and viable cells, especially acinar cells. The protocol presented in this article shows a two-step method that we developed to meet this need. The protocol can be used to digest normal pancreata, pancreata that include pre-malignant lesions, or pancreatic tumors that include a large number of stromal and immune cells.

Pancreatic metaplastic cells are precursors of malignant cells that give rise to pancreatic tumors. However, isolating intact viable pancreatic cells is challenging. Here, we present an efficient method for pancreatic tissue dissociation. The cells can then be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) or for two- or three-dimensional co-culturing.

تشريح أنسجة البنكرياس لعزل الخلايا المفردة القابلة للحياة

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for ...

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic beta-cell proliferation and islet growth is particularly challenging. We have developed a method to capture the distribution of beta-cells in the intact pancreas of transgenic mice with fluorescence-tagged beta-cells with a macro written for ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij/). Following pancreatic dissection and tissue clearing, the entire pancreas is captured as a virtual slice, after which the GFP-tagged beta-cells are examined. The analysis includes the quantification of total beta-cell area, islet number and size distribution with reference to specific parameters and locations for each islet and for small clusters of beta-cells. The entire distribution of islets can be plotted in three dimensions, and the information from the distribution on the size and shape of each islet allows a quantitative and qualitative comparison of changes in overall beta-cell area at a glance.

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

The following protocol outlines the process of pancreatic dissection for virtual slice imaging, and the subsequent quantification of all GFP-tagged beta-cells in the entire pancreas.

في الوضع الطبيعي للقداس الكمي بيتا في البنكرياس خلايا الفئران

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

Biology

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; ديسيبل</sup&gt; نموذج الفأر من النوع 2 من مرض السكري: البنكرياس عزل جزيرة وتعيش خلية 2 فوتون التصوير من الجزر سليمة

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

مراقبة وظيفة الجزيرة وتفاعلات الخلايا المناعية الجزيرة في شرائح أنسجة البنكرياس الحية

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Immunology and Infection

A Mouse Model for Chronic Pancreatitis via Bile Duct TNBS Infusion

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. Several rodent models have been developed to study CP, of which the bile duct 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) infusion model replicates the features of neuropathic pain seen in CP. However, bile duct drug infusion in mice is technically challenging. This protocol demonstrates the procedure of bile duct TNBS infusion for generation of a CP mouse model. TNBS was infused into the pancreas through the ampulla of Vater in the duodenum. This protocol optimized drug volume, surgical techniques, and drug handling during the procedure. TNBS-treated mice showed features of CP as reflected by bodyweight and pancreas weight reductions, changes in pain-associated behaviors, and abnormal pancreatic morphology. With these improvements, mortality associated with TNBS injection was minimal. This procedure is not only critical in generating pancreatic disease models but is also useful in local pancreatic drug delivery.

Chronic pancreatitis (CP) is a disease characterized by inflammation and fibrosis of the pancreas, often associated with intractable abdominal pain. This article focuses on refining the technique to generate a mouse model of CP via bile duct infusion with 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS).

نموذج الماوس لالتهاب البنكرياس المزمن عن طريق ضخ القناة الصفراوية TNBS

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. ...

Acinar-to-Ductal Metaplasia Induction: A Method to Study Acinar Cell to Ductal Cell Differentiation in 3D Ex Vivo Culture

Source: Fleming Martinez, A. K. et. al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/59096/" target="_blank">Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the technique of differentiating pancreatic acinar cells to ductal cells in ex vivo 3D culture. This helps to understand the mechanisms regulating the acinar-to-ductal metaplasia (ADM), a key process in the early development of pancreatic cancer.

تحريض حؤول أسينار إلى قنوي: طريقة لدراسة تمايز خلية أسينار إلى خلايا الأقنية في ثقافة ثلاثية الأبعاد خارج الجسم الحي

Source: Fleming Martinez, A. K. et. al. Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture. J. Vis. Exp. ...