Name: dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling
Uploaded: 2017-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling at JoVE.com

MAK reconhece apoio para este trabalho a partir do National Institutes of Health / número - 1R15CA152985-01A1 de concessão do National Cancer Institute. Este projeto também foi apoiado pela Miami University graduação prêmio programa de pesquisa, as oportunidades de doutorado-graduação de Universidade de Miami para programa de bolsas e o programa de estudiosos de Verão de Universidade de Miami.

os procedimentos realizados no vídeo e descritos a seguir foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) na Universidade de Miami e institucional Cuidado Animal.
 1. preparação e estímulo teste <ol><li>estabelecer duas áreas distintas para o procedimento cirúrgico, mesa de operações e a tabela de pós operação. Estágio de ambas as áreas com todos os materiais e utensílios necessários.
	Tabela de <ol><li>fase a operar sob uma capa exalada. Organizar a mesa com o equipamento de uma forma que permite o desempenho contínuo e sem entraves do processo.</li>
		<li>Estabelecer uma tabela pós-operatória na mesma sala e perto da mesa principal da operação. Manter ambas as tabelas como ambientes estéreis durante o procedimento.</li>
	</ol></li> <li>Lugar o seguinte fornece na mesa de operações: um frasco com tampa, um tubo de 15 mL, um par de tesouras cirúrgicas, uma garrafa de etanol a 70%, duas placas de espuma, duas pinças, duas seringas de calibre 1 mL 21, dois tubos de 50 mL, tubo de centrifugação de uma , um frasco criogênico, quatro almofadas cirúrgicas, dez pinos, um distribuidor de toalhetes esterilizantes e um recipiente de objectos cortantes.</li>
	<li>Coloque o seguinte material na mesa de pós operação: uma balança analítica, um 4 L dewar de nitrogênio líquido, uma rasa grande boca dewar, um rack de microtubo flutuante, um par de tesouras cirúrgicas, pinças de dois, quatro frascos criogênicos e um dispensador de Toalhetes esterilizados.</li>
	<li>Preencher um de 50 mL e um tubo de 15 mL, volume 75% com formalina.</li>
	<li>Usando um alfinete em cada esquina, apor um bloco cirúrgico para uma placa de espuma de aproximadamente 30 cm x 30 cm para servir como o tabuleiro de dissecação. Use os restantes quatro pinos durante a operação. Preparar uma placa de espuma menor com um bloco cirúrgico para transferir os órgãos à tabela pós-operatório. 
	Cuidado: Isoflurano (99,9%) é um químico do tóxico e deve ser usado em uma capa do respiradouro para garantir o máximo nível de segurança da eliminação de resíduos de gás anestésico 8. Informações adicionais sobre os riscos para os pesquisadores associados com o uso do método aberto-gota utilizando isoflurano podem ser encontradas em um artigo por Taylor e Mook 8.</li>
	<li>Colocar um bloco cirúrgico, o frasco de vidro e embeba com algumas gotas de isoflurano (99,9%) e coloque um papel toalha por cima para evitar o contato direto do mouse com o isoflurano. Da mesma forma, use um bloco cirúrgico para o restante do tubo de linha e mergulhe com algumas gotas de isoflurano e coloque uma almofada adicional por cima para evitar o contato direto entre o rato e o isoflurano.</li>
	<li>Pour nitrogênio líquido na boca larga superficial dewar até o máximo preencher linha é alcançado.</li>
	<li>Lugar o mouse selecionado para dissecção para a anestesia de câmara, ou seja, o frasco de vidro com um pad embebido com algumas gotas de isoflurano (99,9%) coberto com a tampa, para ~ 1 min. 
	Nota: Esse tempo varia de rato de rato. Uma vez que o mouse é inconsciente, removê-lo da câmara e colocá-lo no quadro de funcionamento.</li>
	<li>Oriente do mouse para que o lado ventral é uma mentira e com sua cabeça apontada longe o cientista. Coloque a cabeça dentro do tubo alinhado com um bloco cirúrgico embebido com algumas gotas de isoflurano (99,9%) e executar um teste de estímulo uma pitada de pé para garantir que o mouse não responde a estímulos.
	<ol><li>Se este teste falha e o mouse responde para o teste do beliscão de pé, repita o passo 1.8.</li>
	</ol></li></ol> 2. Inicial de incisão, punção de coração e eutanásia <ol><li>Pin dos membros do rato para a placa de espuma cirúrgica e molhado do lado ventral do mouse com etanol a 70%.</li>
	<li>Aperte a pele/pele perto da abertura uretral com pinça e puxe ligeiramente para cima. Fazer uma incisão com a tesoura cirúrgica através da cavidade abdominal a partir da linha mediana, a abertura uretral e terminando no queixo.
	<ol><li>Perto de ponto de partida da incisão inicial, pegue um dos lados da pele/pele com a pinça e fazer outra incisão com a tesoura para baixo e na diagonal em direção a pata traseira.</li>
		<li>Repetir isto da mesma maneira do lado oposto. 
		Nota: A pele/pele pode ser fixada para baixo para criar uma abertura mais larga, mas não é necessária.</li>
	</ol></li> <li>Localizar o coração e remover o pericárdio, que é o saco em torno do coração, para evitar entupimento da agulha da seringa.
	<ol><li>Segure o pericárdio com a pinça e cortar com a tesoura. Realizar a punção do coração inserindo cuidadosamente a agulha da seringa o coração e comece a retrair o êmbolo lentamente.</li>
		<li>Para coleta de sangue ideal, utilize o êmbolo da agulha para imitar a ação de bombeamento do coração e evitar desenhar rapidamente. 
		Nota: Normalmente cerca de 1 mL de sangue pode ser coletado.</li>
		<li>Depois de concluir a coleta de sangue, dissipar o sangue no tubo de centrífuga e descarte a seringa no recipiente de objectos cortantes.</li>
		<li>Depois que é feita a punção do coração, realizar eutanásia removendo os anexos conectando o coração. 
		Nota: Heparina, um anticoagulante, não foi adicionada à seringa neste procedimento antes da punção do coração para permitir que o sangue a coagular para coleta de soro neste estudo específico. No entanto, se o pesquisador quis evitar a coagulação de sangue para coleta de plasma, heparina pôde ser adicionada à seringa antes da punção do coração.</li>
	</ol></li> <li>Se o estudo envolve a determinação do genótipo do rato, cortar uma parte da orelha com a tesoura e coloque em um tubo de centrífuga para uma verificação de genótipo.</li></ol>
 3. extração do pâncreas <ol><li>localizar o estômago do lado esquerdo do mouse. Comece suavemente (a fim de evitar rasgar) Separe o pâncreas do estômago e duodeno, utilizando duas pinças. 
	Nota: Quando desconectar o pâncreas do estômago e intestinos, é muito importante que a pinça é usada suavemente para guiar o tecido do pâncreas longe os órgãos e para não esmagar ou rasgar o pâncreas com a pinça.
	<ol><li>Continuar a separar o pâncreas das seções intestino delgado jejuno e íleo e por último do ceco do intestino grosso.</li>
	</ol></li> <li>Para o ceco, reposicionar o fórceps e continuar a separação do pâncreas ao longo do cólon restante no sentido reto. 
	Nota: Neste ponto, é conveniente cortar e remover a parte do estômago para a região do cólon imediatamente anterior do reto.</li>
	<li>Localizar o pâncreas e baço em anexo. Deslize o pâncreas para o lado direito do mouse. Separe as restantes ligações entre o pâncreas e a cavidade torácica com a pinça para retirar totalmente o pâncreas e o baço conjugado.</li>
	<li>Remover o pâncreas e espalhá-lo para exame. Deixe o baço anexado ao pâncreas para fins de identificação.
	<ol><li>Remover todos do tecido conjuntivo, tecido gordo e mesentérico do pâncreas. 
		Nota: Este tecido é mais branco na cor e, portanto, pode ser facilmente distinguido do tecido do pâncreas é mais rosado na cor. Isto é particularmente importante se o pâncreas inteiro precisa ser removido. Por exemplo, se o pâncreas precisa ser pesado e em relação ao peso corporal, ou entre grupos de animais. No Ptf1a cre / +; LSL-Kras G12D / + modelo do rato, especificamente nos meses mais velhos, difícil fibroso tecido pancreático poderia estar presente. Neste caso, a remoção cuidadosa do pâncreas deve ser conduzida como os intestinos podem ser entrelaçados no tecido do tumor. Em casos avançados, baço anormal e tecido do fígado podem também estar presentes.</li>
	</ol></li> <li>Se desejado, remover outros órgãos neste ponto.</li></ol>
 4. coleta de dados e armazenamento <ol><li>após a extração dos órgãos, mover as amostras para a área de pós-operatório para preservação.</li>
	<li>Pesar cada órgão e colocá-los em seus respectivos frascos criogênicos. 
	Nota: ao longo de sagacidadeh a massa de cada amostra, as irregularidades devem ser registadas para referência futura.</li>
	<li>Uma vez que os órgãos são pesados, colocá-los para o nitrogênio líquido para congelamento de snap.</li>
	<li>Após snap congelando, armazenar os órgãos a-80 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
	<li>Colocar as amostras de formalina armazenada na parte superior do banco durante a noite, e na manhã seguinte alterar sua solução de formalina para etanol a 70%. 
	Nota: Estas amostras devem ser armazenadas a 4 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
	<li>Para o armazenamento de longo prazo, congelar o ponche de sangue e orelha a-80 ° c... Para coleta de soro do sangue, permitir que o sangue a coagular por 30 min, em seguida, centrifugá-lo. Remover a porção de soro com uma pipeta e armazene-o em seguida a -80 ° C.</li>
</ol> 5. Clean Up <ol><li>Sanitize a dissecação todas as ferramentas com as toalhitas esterilizantes. Tampa do tubo alinhado com o isoflurano embebido bloco cirúrgico. Substitua o bloco cirúrgico sobre a placa de espuma com um bloco cirúrgico novo. Elimine as porções do mouse que não foram coletadas pela facilidade &#39; política de eliminação de animais de s.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fesinmeyer, M. D., Austin, M. A., Li, C. I., De Roos, A. J., Bowen, D. 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Os autores não têm nada para divulgar.

Importância no que diz respeito a métodos existentes Enquanto existem outros vídeos informais de dissecções de rato, este artigo de vídeo fornece a primeira qualidade profissional, par-revistos, demonstração visual de todas as etapas detalhadas necessárias para extração e colheita do pâncreas rato por dissecação10 . Com o pâncreas é um órgão principal para a atividade metabólica e insulina produção, dissecção e colheita do pâncreas permite a preservação das características fisiológicas11. Isolando o pâncreas, análises futuras podem ser realizadas na amostra. Este procedimento permite a comparação e o estudo das interações de outros tecidos dentro do organismo mesmo dentro do mesmo prazo.
Limitações da técnica A maior limitação deste procedimento é a cessação da vida do rato, evitando assim que a coleção longitudinal e amostragem de múltiplas amostras de tecido do mouse mesmo. A fim de analisar as tendências relacionadas à idade, sexo ou outros quantificadores, uma população transversal deve ser implementada, como fizemos para nosso estudo de biomarcadores metabólicos de câncer pancreático. Outra limitação deste protocolo é a incapacidade para pausar o processo. Uma vez que a eutanásia é iniciada, o procedimento deve efectuar na sua totalidade.
Passos críticos dentro do protocolo Execução do teste de estímulo beliscando a pata traseira do mouse é fundamental para garantir que o rato recebe tratamento humano. Se o mouse não reage a este estímulo, então o procedimento se efectuar como planejado. No entanto, deve o mouse exibir uma resposta angustiada como resultado do teste de estímulo, o rato deve ser retornado para a câmara de anestesia para um período adicional de tempo e o teste repetido até uma reação ao teste de estímulo não é observada a12.
Da mesma forma, a punção do coração terminal seguida da remoção das conexões para o coração, imediatamente após a amostra de sangue terminal é recolhida como um método secundário de eutanásia garante o sacrifício humano do mouse. Para garantir uma eficaz recolha de sangue, o cientista deve usar um movimento de bombeamento com a seringa que é parecida com o batimento cardíaco do mouse, permitindo a máxima coleta de sangue para análise.
Modificações e solução de problemas Os órgãos de formalina para soluções de etanol 70% de comutação prepara os órgãos para o processo de incorporação necessário para análise histológica. Soluções de armazenamento diferente podem ser necessárias caso o cientista opte por realizar outros experimentos com os órgãos. Antes da análise, é importante limitar qualquer potencial descongelamento dos órgãos armazenados no freezer-80 ° C para preservar a integridade do órgão.
Uso da Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / + modelo do rato minimiza a ocorrência de não-pancreática primária tumores e doenças13. Assim, é importante observar as irregularidades que são aparentes para o pâncreas ou outros órgãos durante a dissecção e coleta das amostras de tecido para análise.
Aplicações futuras Colheita do pâncreas rato por dissecação permite vários tipos de análise para ser realizado na mesma amostra. O mais popular destes incluem, mas não está limitados a, microscopia de fluorescência, hematoxilina e histologia eosina, imuno-histoquímica, espectrometria de massa e de6,de espectroscopia de ressonância magnética nuclear7, 14 , 15. doenças como diabetes, câncer de pâncreas e pancreatite podem ser estudadas usando as técnicas mencionadas acima de16.

O mouse tem emergido como um importante modelo animal de câncer no pâncreas humano1,2. No Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / + modelo do rato, a Kristen oncogene de sarcoma (K-Ras) de rato é ativado exclusivamente no pâncreas, resultando em iniciação de lesões pré-cancerosas no pâncreas, conhecido como neoplasias intra-epitelial pancreáticas (PanINs), que o progresso para adenocarcinoma ductal do pâncreas, comumente referido como PDACs3. Este sistema de modelo do mouse fornece dentre os melhores modelos animais disponíveis para4,câncer de pâncreas humano5, com a vantagem adicional dos PanINs emergem dentro os primeiros cinco meses de vida e, frequentemente, progresso a PDAC dentro um único ano4,5, Considerando que o câncer de pâncreas ocorre mais frequentemente em humanos 60-70 anos de idade.
Extração do pâncreas por dissecação do Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / + ratos em várias idades permite detalhado exame histológico longitudinal do desenvolvimento de câncer no pâncreas, desde os primeiros estágios de PanIN através da progressão PDAC3,4 , 5. colheita do pâncreas em idades que variam de cinco a quinze meses também pode ser usada para preparar o tecido extratos para caracterizar mudanças globais no metabolismo de4 pâncreas que ocorrem durante a transição de saudável para o tecido doente 6,7.
Este artigo apresenta um guia visual completo das etapas necessárias para realizar uma extração de pâncreas de rato e fornece diretrizes para o armazenamento de um pâncreas para posterior análise. Este guia será igualmente valioso para indivíduos realizando pesquisa sobre outras doenças do pâncreas, incluindo diabetes tipo e devem ser especialmente útil para estudantes e investigadores novos para pesquisas envolvendo a colheita do pâncreas de rato usando dissecação para criação de perfil metabólico ou análise histológica.

<table><tbody><tr><td>Glass Jar&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3140-150</td><td>The glass jar used in the video has been discontinued.&amp;nbsp; This is its replacement.</td></tr><tr><td>Lid of Glass Jar</td><td>Corning</td><td>9985-150</td><td>The glass jar lid used in the video has been discontinued.&amp;nbsp; This is its replacement.</td></tr><tr><td>15 mL Falcon Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>9201</td><td></td></tr><tr><td>Squeeze bottle&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-409-10DD</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-103</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>245-684</td><td></td></tr><tr><td>Foam Boards</td><td>Therapak</td><td>562908</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>200205SHN</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 21G Syringes</td><td>BD Biosciences</td><td>309624</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL Microcentrifuge Tubes&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-258</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Pads</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67011</td><td></td></tr><tr><td>T-Pins Length:&amp;nbsp; 2&quot;&amp;nbsp;</td><td>Advance Store Products</td><td>X32T-05</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizing Wipes</td><td>Professional Disposables International Inc.</td><td>Q85084</td><td></td></tr><tr><td>Sharps Container</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-827-122</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Marshall Scientific</td><td>ME-AE200</td><td></td></tr><tr><td>4L Dewar</td><td>Taylor-Wharton</td><td>4LD</td><td></td></tr><tr><td>Shallow Wide Mouth Dewar</td><td>Fisher Scientific</td><td>F3087-V</td><td></td></tr><tr><td>Floating Microtube Rack</td><td>VWR</td><td>60986-100</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Vial 1.2 mL, Sterile</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-25</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia (Isoflurane)&amp;nbsp;</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>050033</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td>Wright Brothers</td><td>NIT-60-XX</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Kras Strain</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>OO8179</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Cre Strain</td><td>MMRRC</td><td>OOO435-UNC</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling

Nós temos investigado o fator de transcrição específico do pâncreas, 1a cre-recombinase; sarcoma de rato LOX-paragem-lox-Kristen, glicina, ácido aspártico no codão 12 (Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / +) cepa de rato como modelo de câncer no pâncreas humano. O objetivo dos nossos estudos atuais é identificar biomarcadores metabólicos romance de progressão do câncer pancreático. Efetuamos a criação de perfil metabólico de urina, fezes, sangue e extratos de tecido do pâncreas, bem como a análise histológica do pâncreas para encenar a progressão do câncer. O pâncreas de rato não é um órgão sólido bem definido como nos seres humanos, mas pelo contrário, é um tecido mole difusamente distribuído que não é facilmente identificado por indivíduos que não estão familiarizados com a anatomia interna do mouse ou por indivíduos que têm pouca ou nenhuma experiência realizando dissecções de órgão do rato. O objetivo deste artigo é fornecer uma detalhada step-wise demonstração visual para orientar noviços na remoção do pâncreas rato por dissecação. Este artigo deve ser especialmente valioso para estudantes e investigadores de novo à investigação que requer a colheita do pâncreas de rato por dissecação para criação de perfil metabólico ou análise histológica.

A Figura 1 mostra uma visão geral da área de ambiente operacional e a Figura 2 mostra a área de operação do post. Enquanto essa configuração fornece a quantidade mínima de equipamentos e preparo, os indivíduos podem optar por alterar isto para melhor atender as necessidades individuais. O protocolo deve ser otimizado de acordo com as necessidades específicas da experiência. Este procedimento é realizado de uma forma que termina a vida de um rato, exigindo adequada eutanásia9. Quando o pesquisador está pronto, o mouse é colocado na câmara de anestesia com as almofadas encharcada de isoflurano (Figura 3).
Uma vez que o mouse é inconsciente, remover o mouse e colocá-lo lado dorsal na placa. Um procedimento de dedo-pinch deve ser realizado para garantir que o mouse não responde à dor (Figura 4). Aplica álcool 70% para esterilizar a área da incisão inicial. O terminal de sangue deve ser realizado em primeiro lugar, antes da remoção do pâncreas, para garantir a recuperação de sangue adequada. Antes da remoção do sangue, o pericárdio deve ser removido para evitar o entupimento da agulha 21G de abertura. Depois de completar o sangue terminal desenhar, o coração é destacado como um método secundário de eutanásia e o pâncreas é removido.
Comece localizando o estômago, o que fornece um bom ponto de partida para a remoção do pâncreas (Figura 5). Nota: Extremo cuidado deve ser exercido durante a remoção do pâncreas, que é um tecido delicado e frágil, e, portanto, todas as operações devem ser executadas com uma força suave. Usando fórceps, começar a dissecação por começar a puxar suavemente o pâncreas longe o estômago e continuar a separar o tecido pancreático do forro exterior do trato gastrintestinal (GI) trabalhando a partir do estômago para o duodeno, o jejuno e o íleo ( Figura 6). Uma vez atingido o ceco, mais fácil remoção do pâncreas é conseguida pelo reposicionamento do fórceps para que um fórceps está segurando o ceco e a outra pinça é usada para continuar a separar o pâncreas do intestino grosso (Figura 7). Após a remoção do intestino grosso, o pâncreas é colocado no lado direito do mouse e os restantes anexos são cortadas(Figura 8).
O pâncreas devem ser espalhado para inspeção e qualquer anormalidade deve ser gravado (Figura 9). No Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / + mouse estirpe, o pâncreas potencialmente poderia conter um tumor endurecido (Figura 10). Outros órgãos também devem ser examinados para potencial metástase. Uma vez que o pâncreas foi removido, isso deve ser pesado e o peso verificado. Uma parte do pâncreas deve ser snap-congelado em nitrogênio líquido para futuro análise de perfil metabólico ou outros testes e uma porção do pâncreas devem ser colocados em formol para futura análise histológica. A Figura 11 mostra o armazenamento inicial de vários órgãos coletados a partir da dissecação para uso em análise posterior. Os objetivos do pesquisador individual dependerá os órgãos colhidos por dissecação e armazenados para um estudo mais aprofundado.
Amostras de tecido e o sangue podem ser usadas para análise histológica e para criação de perfil metabólico. Um exemplo da análise histológica do tecido do pâncreas é mostrado na Figura 12. De perfil metabólico pode ser realizado na amostra de sangue e amostras de tecido congelado snap. Espectros de espectroscopia (NMR) representante da ressonância magnética nuclear dos componentes de extratos de pâncreas tecido hidrofílicos e hidrofóbicos são mostrados na Figura 13A e 13B, respectivamente. Um espectro de NMR representante coletado em uma amostra de soro preparada a partir de sangue coletado no momento do procedimento de desenhar sangue terminal é mostrado na Figura 14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig1.jpg"> 
Figura 1 : Preparo da área de funcionamento. Layout geral de ferramentas corretas e condições de funcionamento para a dissecação. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig2.jpg"> 
Figura 2 : Preparo da área de pós operação. Layout geral de ferramentas corretas e condições de funcionamento para os procedimentos pós-operatórios. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig3.jpg"> 
Figura 3 : Câmara anestesia. Ambiente adequado para a anestesia através do isoflurano. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig4.jpg"> 
Figura 4 : Exame de estímulo. O teste de estímulo realizado no mouse antes da incisão inicial para garantir qualquer dor ou desconforto não é ser suportado. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig5.jpg"> 
Figura 5 : Começando a remoção do pâncreas. A orientação do mouse indicando a extração inicial do pâncreas, local indicado pelo fórceps. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig6.jpg"> 
Figura 6 : Extração de pâncreas ao longo do intestino. Processo de isolar o pâncreas do tracto gastrointestinal. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647 alt="Figure 7" class="xfigimg" src=""></img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647>Fig7.jpg"/ > 
Figura 7 : Remoção do pâncreas para o ceco. Reposicionamento da pinça uma vez o ceco é alcançado. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig8.jpg"> 
Figura 8 : Remoção do pâncreas. Coloque o pâncreas no lado direito do mouse. Os restantes anexos devem ser cortados para remover totalmente o pâncreas. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig9.jpg"> 
Figura 9 : Pâncreas exame. O pâncreas baço anexado a ser examinados após a remoção do mouse. O baço é indicado pela seta vertical, e o pâncreas é indicado pela seta horizontal. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig10.jpg"> 
Figura 10 : Pâncreas exame. O pâncreas baço anexado exibindo um tumor pancreático sendo examinado após a remoção do mouse. O baço é indicado pela seta vertical, e o pâncreas é indicado pela seta horizontal. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig12.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;">
Figura 11 : Armazenamento de órgãos removidos. Armazenamento adequado dos órgãos e amostras coletadas, preparado para armazenamento a longo prazo e análise futura. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig11large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig11.jpg" style="opacity: 0.9;"> 
Figura 12 : Análise histológica do tecido do pâncreas. Hematoxilina e eosina manchado imagens do tecido do pâncreas. A) tecido do pâncreas normal de um Ptf1acre /-; LSL-KrasG12D /- rato de controle. B) PanIN tecido do pâncreas de um Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / + rato de estudo. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig12large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig13.jpg"> 
Figura 13 : Metabólica Análise de criação de perfil. Próton unidimensional ressonância magnética nuclear (NMR) de espectroscopia espectros de componentes de fase A) hidrofílico e B) hidrofóbico de extratos de tecido do pâncreas após homogeneização do tecido e submetido a extração de clorofórmio/metanol. O espectro de RMN foram adquirido em 850 MHz e é adequado para uso em análises de perfil metabólicos. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig13large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55647/55647fig14.jpg"> 
Figura 14 : Espectro de NMR representante de soro. O sangue coletado pelo procedimento de sorteio de sangue terminal pode ser usado para análise de perfil metabólico. Este espectro mostra um típico espectro de 850 MHz NMR próton unidimensional coletadas sobre o soro obtido a partir de uma amostra de sorteio de sangue terminal. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55647/55647fig14large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

Este artigo de vídeo fornece uma demonstração detalhada das formalidades necessárias para remover com êxito o pâncreas de um rato por dissecação para análise histológica e perfis metabólicos.

Dissecação do pâncreas Mouse para análise histológica e perfis metabólicos

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

dissection-mouse-pancreas-for-histological-analysis-metabolic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

36.5K visualizações.  Miami University. Este artigo de vídeo fornece uma demonstração detalhada das formalidades necessárias para remover com êxito o pâncreas de um rato por dissecação para análise histológica e perfis metabólicos.

Vídeo: Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires further study. To understand the mechanisms regulating acinar-to-ductal metaplasia (ADM), ex vivo 3D culture and differentiation of primary acinar cells to ductal cells offers many advantages over other systems. With the technique herein, modulation of protein expression is simple and quick, requiring only one day to isolate, stimulate or virally infect, and begin culturing primary acinar cells to investigate the ADM process. In contrast to using basement membrane matrix, the seeding of acinar cell clusters in collagen I extracellular matrix, allows acinar cells to retain their acinar identity before manipulation. This is vital when testing the contribution of various components to the induction of ADM. Not only are the effects of cytokines or other ectopically administered factors testable through this technique, but the contribution of common mutations, increased protein expression, or knockdown of protein expression is testable via viral infection of primary acinar cells, using adenoviral or lentiviral vectors. Moreover, cells can be re-isolated from collagen or basement membrane matrix at the endpoint and analyzed for protein expression.

Primary acinar cell isolation, protein expression or activity modulation, culture, and down-stream applications are abundantly useful in the ex vivo study of acinar-to-ductal metaplasia (ADM), an early event in the development of pancreatic cancer.

Imitando e manipulando Metaplasia acinares-para-Ductal pancreático na cultura de pilha 3-dimensional

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Pesquisa do câncer

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.

Here, we describe a method for the isolation of cells in the pancreas microenvironment from embryonic, neonatal and adult mouse tissue, focusing on the isolation of mesenchymal cells. This method allows profiling of cell gene expression and protein secretion in order to elucidate the extrinsic signals that regulate pancreas development, function, and tumorigenesis.

Isolando e analisando células do pâncreas Mesênquima por citometria de fluxo

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Biologia do Desenvolvimento

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Análises de célula única Transcriptomic de células endócrinas no pâncreas de rato

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Pancreatic Tissue Dissection to Isolate Viable Single Cells

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for approximately 90% of the pancreas and includes cells that produce and secrete digestive enzymes. The digestive enzymes are produced in the pancreatic acinar cells, stored in vesicles called zymogens, and are then released into the duodenum via the pancreatic duct to initiate metabolic processes. The enzymes produced by the acinar cells can kill cells or degrade cell-free RNA. In addition, acinar cells are fragile, and common dissociation protocols result in a large number of dead cells and cell-free proteases and RNases. Therefore, one of the biggest challenges in pancreatic tissue digestion is recovering intact and viable cells, especially acinar cells. The protocol presented in this article shows a two-step method that we developed to meet this need. The protocol can be used to digest normal pancreata, pancreata that include pre-malignant lesions, or pancreatic tumors that include a large number of stromal and immune cells.

Pancreatic metaplastic cells are precursors of malignant cells that give rise to pancreatic tumors. However, isolating intact viable pancreatic cells is challenging. Here, we present an efficient method for pancreatic tissue dissociation. The cells can then be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) or for two- or three-dimensional co-culturing.

Dissecção do tecido pancreático para isolar células únicas viáveis

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for ...

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic beta-cell proliferation and islet growth is particularly challenging. We have developed a method to capture the distribution of beta-cells in the intact pancreas of transgenic mice with fluorescence-tagged beta-cells with a macro written for ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij/). Following pancreatic dissection and tissue clearing, the entire pancreas is captured as a virtual slice, after which the GFP-tagged beta-cells are examined. The analysis includes the quantification of total beta-cell area, islet number and size distribution with reference to specific parameters and locations for each islet and for small clusters of beta-cells. The entire distribution of islets can be plotted in three dimensions, and the information from the distribution on the size and shape of each islet allows a quantitative and qualitative comparison of changes in overall beta-cell area at a glance.

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

The following protocol outlines the process of pancreatic dissection for virtual slice imaging, and the subsequent quantification of all GFP-tagged beta-cells in the entire pancreas.

Quantificação em situ da Missa das células beta pancreáticas em camundongos

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

Biologia

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Medicina

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

Observando a função da ilhota e interações celulares ilhotas-imunes em fatias de tecido pancreático ao vivo

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Imunologia e Infecção

A Mouse Model for Chronic Pancreatitis via Bile Duct TNBS Infusion

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. Several rodent models have been developed to study CP, of which the bile duct 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) infusion model replicates the features of neuropathic pain seen in CP. However, bile duct drug infusion in mice is technically challenging. This protocol demonstrates the procedure of bile duct TNBS infusion for generation of a CP mouse model. TNBS was infused into the pancreas through the ampulla of Vater in the duodenum. This protocol optimized drug volume, surgical techniques, and drug handling during the procedure. TNBS-treated mice showed features of CP as reflected by bodyweight and pancreas weight reductions, changes in pain-associated behaviors, and abnormal pancreatic morphology. With these improvements, mortality associated with TNBS injection was minimal. This procedure is not only critical in generating pancreatic disease models but is also useful in local pancreatic drug delivery.

Chronic pancreatitis (CP) is a disease characterized by inflammation and fibrosis of the pancreas, often associated with intractable abdominal pain. This article focuses on refining the technique to generate a mouse model of CP via bile duct infusion with 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS).

Um modelo de rato para pancreatite crônica através da infusão TNBS do ducto biliar

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. ...

Acinar-to-Ductal Metaplasia Induction: A Method to Study Acinar Cell to Ductal Cell Differentiation in 3D Ex Vivo Culture

Source: Fleming Martinez, A. K. et. al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/59096/" target="_blank">Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the technique of differentiating pancreatic acinar cells to ductal cells in ex vivo 3D culture. This helps to understand the mechanisms regulating the acinar-to-ductal metaplasia (ADM), a key process in the early development of pancreatic cancer.

Indução de metaplasia acinar-ductal: um método para estudar a diferenciação de células acinares para células ductais em cultura 3D ex vivo

Source: Fleming Martinez, A. K. et. al. Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture. J. Vis. Exp. ...