Name: isolating and analyzing cells of the pancreas mesenchyme by flow cytometry
Uploaded: 2017-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry at JoVE.com

The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.

הניסויים נערכו על פי הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת בעלי חיים למחקר באוניברסיטת תל אביב. 1. ניתוק של רקמת לבלב מעכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עכברים בוגרים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ העיכול: 0.4 מ&quot;ג / P collagenase מ&quot;ל ו 0.1 ng / mL DNase אני מומס תמיסת מלח מאוזן &quot;הנקס (HBSS). טרי להכין 5 מ&quot;ל של חיץ לכל עכבר צינורות חרוטי 15 מ&quot;ל ולשמור אותם על הקרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים על פי הנחיה מוסדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח כל עכבר כדי להסיר את הלבלב (להוראה, אנא ראה חומר עזר 18); ומניחים אותו בצלחת תרבות המכילה HBSS. אפשר לבצע בשלב זה תחת סטראו, וכדי להגביר את יעילות עיכול, לחתוך את הרקמה לתוך 2 - 4 חתיכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את רקמת לבלב לתוך צינור המכיל מאגר העיכול (מוכן בשלב 1.1.1). שמור את הצינורות על קרח עד שכל העכברים הם גזורים ורקמות לבלבשנאסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.1.2 - 1.1.4 עם עכברים הנותרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עוברים ועכברים בילוד: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ העיכול: 0.4 מ&quot;ג / P collagenase מ&quot;ל ו 0.1 ng / mL DNase אני מומס HBSS. עבור עוברי לגורים ב יום לאחר הלידה 7 (P7) ומטה, טרי להכין 1.5 - 2 מ&quot;ל של חיץ לכל עכבר בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל קונית. לקבלת P7 או גורים מבוגרים, להכין 3 - 4 מ&quot;ל של חיץ לכל עכבר בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל קונית. שמור על הקרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים על פי הנחיה מוסדית. עבור עוברי, להסיר את כל העוברים מן הרחם של אמא שלהם ומניחים אותם בצלחת תרבות 10 מ&quot;מ המכיל PBS. לנתח עובר אחד בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר על הגב שלה, עם הראש שלה מצביע הרחק החוקר. בעזרת מלקחיים בסדר, להרים את עור הבטן ופתוח על קו האמצע כדי לחשוף את חלל הבטן עד סרעפת העכבר 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר, לנתק את הכבד frאום דופן הבטן האחורית. בתנועה רציפה לקראת זנב עכבר, לגרוף את האיברים הפנימיים (כולל הכבד, הקיבה, הטחול, המעיים, הכליות והלבלב) ומניחים אותם בצלחת תרבות המכילה HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת סטראו, להסיר את הכבד והכליות לחשוף את הלבלב (איור 1). בעזרת מלקחיים בסדר, לנתק את הלבלב מהבטן, תריסריון, ולבסוף, מן הטחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את רקמת לבלב לתוך צינור המכיל מאגר העיכול (מוכן בשלב 1.2.1). עבור גורים P14 ומעלה, לחתוך את הרקמה לתוך 2 חתיכות כדי להגביר את יעילות העיכול. שמור את הצינורות על קרח עד שכל העכברים הם גזורים ורקמות לבלב שנאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.2.2 - 1.2.6 עם עכברים הנותרים. </li></ol></li></ol> 2. עיכול לבלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצינורות המכילים את רקמת הלבלב (חיץ עיכול) בתוך גוש חימום על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם agitatיון ב 700 סל&quot;ד. לאחר 15 דקות, ידני לנער את הצינורות על ידי היפוך אותם 3 - 4 פעמים ומניחים אותם בחזרה בבלוק החימום. הערה: אם באמצעות בלוק חימום ללא יכולות תסיסה, להפוך את הצינורות כל 5 - 10 דקות. ודא כי הרקמה מתעכל כראוי. אם לא, לחתוך את הרקמה לחתיכות קטנות יותר לפני הדגירה או להגדיל את התסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצור את עיכול רקמות, מניחים את הצינורות על הקרח ולהוסיף 10 מ&quot;ל של HBSS קר צינור אחד. צנטריפוגה צינורות ב 4 ° C ו- XG 300 דקות 5 ו לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-השעיה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עכברי בוגרים P14 או גורים מבוגרים, מחדש להשעות את הגלולה עם 6 מיליליטר של PBS ו לסנן אותם דרך מסננת תא 70 מיקרומטר מונחת על גבי צינור פוליפרופילן אוסף חרוטים חדש של 15 מיליליטר. כדי להבטיח התאוששות התא מקסימלי, לשטוף את הצינור המקורי עם תוספת 6 מ&quot;ל של PBS ו מסננים אותו דרך מסננת התא על צינור איסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עוברים גורים צעירים tP14 האן, מחדש להשעות את גלולה עם 2 מ&quot;ל של PBS ו לסנן אותם דרך מסננת תא 35 מיקרומטר מונח על גבי צינור איסוף קלקר 5 מ&quot;ל מסביב לתחתית (צינור FACS). כדי להבטיח התאוששות תא מקסימלי, לשטוף את הצינור המקורי עם תוספת 2 מיליליטר של PBS ו מסנן אותו דרך מסננת התא על צינור האיסוף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות ב 4 ° C ו- XG 300 דקות 5 ו לשאוב supernatant. הסר את הנוזל בזהירות, כמו תאים המחוברים באופן רופף אל צינור הקלקר. </li></ol> 3. הכנת תווית תאים בודדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההכנות הצפת: בידוד תא על ידי FACS, להכין מיון חיץ על ידי ערבוב PBS (ללא כלוריד סידן מגנזיום כלוריד), 5% בסרום שור העובר (FBS), ו -5 מ&quot;מ EDTA. עבור ניתוח תזרים cytometry, להכין חיץ ניתוח על ידי השלמת חיץ מיון עם אזיד הנתרן 0.05%. מאגרי שניהם עשויים להיות מאוחסן על 4-8 מעלות צלזיוס למשך עד 2 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש להשעות תאים למיון או anaחיץ תמוגה. Re- להשעות כל הלבלב מבודד עוברים גורים מתחת לגיל P7 ב 1 מ&quot;ל, מן הגורים בין P8 ו בן חודש ב 1.5 מ&quot;ל, ו מעכברים מבוגרת חודש 3 מ&quot;ל. מסננים את התאים דרך מסננת תא 35 מיקרומטר מונח על גבי צינור פוליסטירן מסביב לתחתית (צינור FACS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור פקדים מכתימים, להוציא 50 עד 100-μL aliquots ממדגמים שבוצעו בשלב הקודם (לא יותר מ -5% מנפח כלל המדגם) ולהכניס אותם לתוך צינורות FACS חדשים; כולל צינור עבור כל fluorophore בשימוש, כולל חלבוני DAPI ו ניאון, כמו גם עבור פקד בלא כתם. הערה: בעת שימוש בעכברים טרנסגניים עם תאי מבטאי חלבון פלואורסצנטי, או כאשר המספר סלולארי מוגבל, כולל רקמות הלא מהונדס כביקורת מכתימה. אם תאי מבטאי חלבון פלואורסצנטי משמשים ללא מכתים נוסף, המשך לשלב 3.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התאים ב 300 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ו לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת גושמלך, מחדש להשעות את התאים עם פתרון חסימה (100 μL למיון או חיץ ניתוח בתוספת 1 μL של IgG עז) דגירה במשך 30 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים סמנים פני התא, להכין תערובת הכוללת את כל הנוגדנים fluorophore מצומדות הרצוי בהיקף של 100 μL לדגימה. כן דילולי נוגדן 2x במיון או חיץ ניתוח (כלומר, לדלל את הנוגדן להשיג את הריכוז הנדרש כפול; אם דילול סופי של 1: 200 הוא רצוי, לדלל את הנוגדן 1: 100). מבלי לשטוף היטב את הפתרון החוסם, להוסיף 100 μL של התערובת אל התאים המדגמים כדי להשיג נפח מכתים סופי של 200 μL. דגירה של 30-60 דקות על הקרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את הניתוח או פרמטרי מיון (ראה צעדים 4.3 ו -5.2), להכין צינורות נוספים המכילים רק אחד הנוגדנים המשמשים (שליטה מכתימה). כן דילולי נוגדן 2x במיון או חיץ ניתוח (כמתואר בשלב 3.6). הקפד לכלול סידילול מלא מכתים ngle לכל fluorophore בשימוש, כמו גם פקד בלא כתם. מבלי לשטוף היטב את הפתרון חוסם, להוסיף 100 μL של תערובות נוגדנים לתאי (מוכן בשלב 3.3) כדי להשיג נפח מכתים סופי של 200 μL. דגירה של 30 - 60 דקות על הקרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף על ידי מילוי צינור אחד עם ניתוח או מיון חיץ לנפח מקסימאלי של 4 מיליליטר. לחלופין, מחדש נקע את התאים דרך מסננת תא 35 מיקרומטר (כמתואר בשלב 3.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש להשעות את הדגימות בניתוח או מיון חיץ. Re- להשעות את התאים מבודדים מעוברים ב 500 μL, מן הגורים מתחת לגיל חודש ב 1 מ&quot;ל, מ 1 - 3 חודשים הישן 2 מ&quot;ל, ו מעכברים מעל גיל 3 חודשים ב 3 מ&quot;ל. בקרות מכתימות ניתנות מחדש תלויות 300 μL של חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 ng / mL של DAPI מחדש מושעה תאים לזהות את התאים המתים. הקפד לכלול שיתוף צינורntaining תאים בלא כתם ללא DAPI עבור הגדרות cytometer. המשך מיון תא (שלב 4) או ניתוח (שלב 5). </li></ol> 4. מיון תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כנות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מיון התא לפני מיצוי RNA, מעיל צינור איסוף 1.5 מ&quot;ל עם RNase מעכב מיד לפני מיון. לשם כך, להוסיף 1 מ&quot;ל של מיון חיץ, המכיל 0.01 U / mL RNase מעכב, אל צינור 1.5 מ&quot;ל אוסף סטרילי. לאחר 5 דקות, מערבולת הצינור ולהסיר את הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מיון התא לפני תרבית תאים, להוסיף 3 מ&quot;ל של התקשורת culturing סטרילי (בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) השלימו עם FBS 20%, 1% L- גלוטמין, ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין) לתוך צינור איסוף 15 מ&quot;ל סטרילי . </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני טעינת שפופרת לתוך סדרן FACS, מערבולת אותו קלות על מנת מחדש להשעות את התאים. שמור את הצינורות הנותרים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי ניתוח הבקרות המכתימות מנת לקבוע את פרמטרי המיון (למשל, </em&gt; מתח ופיצויים) ומיון שערים (למשל, אוכלוסיית תאים כוללת, תאי DAPI שלילי חיות, אוכלוסיות תאים להיות מסודרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפרמטרים ושערי מיון מוגדרים, טען את הדגימות וליזום מיון תא לתוך הצינורות האוספים. הערה: תנאי מיון הם תלויים במידה רבה על המכשיר. אנו משתמשים ברוחב זרבובית של 100 מיקרומטר, בלחץ של 23.1 psi, ומהירות מיון מקסימלי של 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך מיצוי RNA או culturing של תאים ממוינים. הערה: לקבלת מיצוי RNA, צנטריפוגה התאים XG ב 2000 במשך 5 דקות ולהסיר את הנוזל העודף לפני שתמשיך עם פרוטוקול מיצוי סטנדרטי. עבור culturing תאים, אם התאים מוינו בתנאים לא סטריליים, לשטוף אותם פעמיים על ידי מילוי צינור עם המדיום culturing ו צנטריפוגה זה ב XG 300 7 דקות לפני culturing כדי למזער זיהום שלהם. </li></ol> 5. ניתוח Cell על ידי cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שאניoading כל צינור לתוך, מערבולת cytometer אותו קלות על מנת מחדש להשעות את התאים. שמור את הצינורות הנותרים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי ניתוח דגימות בלא כתם חד מוכתם על מנת לקבוע את הפרמטרים ניתוח (לדוגמה, מתח ופיצויים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפרמטרים ניתוח מוגדרים, לטעון כל דגימה, כולל בקרת מכתים, ולהקליט את התוצאות. לנתח את התוצאות שהושגו באמצעות זרימת cytometry תוכנה לניתוח. </li></ol>

<ol>
	<li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li><li>Cabrera, O., Berman, D. M., Kenyon, N. S., Ricordi, C., Berggren, P. -. O., Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function.">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).</li><li>Gittes, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology+of+the+pancreas:+a+comprehensive+review.">Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review.</a> Developmental biology. 326 (1), 4-35 (2009).</li><li>Villasenor, A., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+developing+pancreas+and+its+blood+vessels:+An+evolving+dialog.">Crosstalk between the developing pancreas and its blood vessels: An evolving dialog.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. , 1-8 (2012).</li><li>Landsman, L., Nijagal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+mesenchyme+regulates+epithelial+organogenesis+throughout+development.">Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development.</a> PLoS Biology. 9 (9), e1001143 (2011).</li><li>Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pancreatic+differentiation+by+signals+from+blood+vessels.">Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels.</a> Science. 294 (5542), 564-567 (2001).</li><li>Pierreux, C. E., Cordi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial:+Endothelial+cross-talk+regulates+exocrine+differentiation+in+developing+pancreas.">Epithelial: Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas.</a> Developmental biology. 347 (1), 216-227 (2010).</li><li>Golosow, N., Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitheliomesenchymal+interaction+in+pancreatic+morphogenesis.">Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis.</a> Developmental biology. 4, 242-255 (1962).</li><li>Bhushan, A., Itoh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf10+is+essential+for+maintaining+the+proliferative+capacity+of+epithelial+progenitor+cells+during+early+pancreatic+organogenesis.">Fgf10 is essential for maintaining the proliferative capacity of epithelial progenitor cells during early pancreatic organogenesis.</a> Development. 128 (24), 5109-5117 (2001).</li><li>Larsen, B. M., Hrycaj, S. M., Newman, M., Li, Y., Wellik, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Hox6+function+is+required+for+mouse+pancreatic+endocrine+cell+differentiation.">Mesenchymal Hox6 function is required for mouse pancreatic endocrine cell differentiation.</a> Development. 142 (22), 3859-3868 (2015).</li><li>Sasson, A., Rachi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+pericytes+are+required+for+beta-cell+maturity.">Islet pericytes are required for beta-cell maturity.</a> Diabetes. 65 (10), 3008-3014 (2016).</li><li>Stanley, S. A., Kelly, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+electromagnetic+control+of+the+hypothalamus+regulates+feeding+and+metabolism.">Bidirectional electromagnetic control of the hypothalamus regulates feeding and metabolism.</a> Nature. 531 (7596), 647-650 (2016).</li><li>Brissova, M., Aamodt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+microenvironment,+modulated+by+vascular+endothelial+growth+factor-A+signaling,+promotes+&#946;+cell+regeneration.">Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes &#946; cell regeneration.</a> Cell metabolism. 19 (3), 498-511 (2014).</li><li>Nikolova, G., Jabs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+basement+membrane:+a+niche+for+insulin+gene+expression+and+Beta+cell+proliferation.">The vascular basement membrane: a niche for insulin gene expression and Beta cell proliferation.</a> Developmental cell. 10 (3), 397-405 (2006).</li><li>Rhim, A. D., Oberstein, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+elements+act+to+restrain,+rather+than+support,+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer cell. 25 (6), 735-747 (2014).</li><li>&#214;zdemir, B. C., Pentcheva-Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival.">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer cell. 25 (6), 719-734 (2014).</li><li>Russ, H. A., Landsman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Proteomic+Analysis+of+Pancreatic+Mesenchyme+Reveals+Novel+Factors+That+Enhance+Human+Embryonic+Stem+Cell+to+Pancreatic+Cell+Differentiation.">Dynamic Proteomic Analysis of Pancreatic Mesenchyme Reveals Novel Factors That Enhance Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Cell Differentiation.</a> Stem cells international. 2016, 6183562 (2016).</li><li>Gout, J., Pommier, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Mouse+Primary+Pancreatic+Acinar+Cells.">Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50514 (2013).</li><li>Verzi, M. P., Stanfel, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+homeodomain+transcription+factor+Bapx1+in+mouse+distal+stomach+development.">Role of the homeodomain transcription factor Bapx1 in mouse distal stomach development.</a> Gastroenterology. 136 (5), 1701-1710 (2009).</li><li>Tribioli, C., Frasch, M., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bapx1:+an+evolutionary+conserved+homologue+of+the+Drosophila+bagpipe+homeobox+gene+is+expressed+in+splanchnic+mesoderm+and+the+embryonic+skeleton.">Bapx1: an evolutionary conserved homologue of the Drosophila bagpipe homeobox gene is expressed in splanchnic mesoderm and the embryonic skeleton.</a> Mech Dev. 65 (1-2), 145-162 (1997).</li><li>Hecksher-Sorensen, J., Watson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+splanchnic+mesodermal+plate+directs+spleen+and+pancreatic+laterality,+and+is+regulated+by+Bapx1/Nkx3.2.">The splanchnic mesodermal plate directs spleen and pancreatic laterality, and is regulated by Bapx1/Nkx3.2.</a> Development. 131 (19), 4665-4675 (2004).</li><li>Walmsley, G. G., Rinkevich, Y., Hu, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Fibroblast+Harvest+Reveals+Surface+Marker+Shift+In+Vitro.">Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift In Vitro.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. , (2014).</li><li>Morris, J. P., Greer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer+regulates+differentiation+and+viability+during+mouse+pancreatic+cancer+initiation.">Dicer regulates differentiation and viability during mouse pancreatic cancer initiation.</a> PloS one. 9 (5), 95486 (2014).</li><li>Miyatsuka, T., Matsuoka, T. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronological+analysis+with+fluorescent+timer+reveals+unique+features+of+newly+generated+&#946;-cells.">Chronological analysis with fluorescent timer reveals unique features of newly generated &#946;-cells.</a> Diabetes. 63 (10), 3388-3393 (2014).</li><li>Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic-stem-cell-derived+progenitors+by+organ-matched+mesenchyme.">Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme.</a> Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).</li><li>Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+expressed+by+murine+embryonic+pancreatic+mesenchyme+enhance+generation+of+insulin-producing+cells+from+hESCs.">Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs.</a> Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).</li><li>Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Hedgehog+signaling+enhances+delivery+of+chemotherapy+in+a+mouse+model+of+pancreatic+cancer.">Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer.</a> Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).</li><li>Raz, Y., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inflammatory+vicious+cycle:+Fibroblasts+and+immune+cell+recruitment+in+cancer.">An inflammatory vicious cycle: Fibroblasts and immune cell recruitment in cancer.</a> Experimental cell research. 319 (11), 1596-1603 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן אנו מתארים שיטה לבודד ולנתח תאים של microenvironment הלבלב. שיטה זו יכולה לשמש כדי לבודד תאי mesenchymal מרקמות לבלב עובריות מבוגרות. בנוסף, אנו השתמשנו בהצלחה בפרוטוקול זה כדי לבודד תאי האנדותל מן המבוגר בילוד הלבלב 5, 17. עם זאת, זה לא יכול להיות מתאים לקבלת השעית תא בודד לשחזור של תאי אפיתל לבלב (פרוטוקולים חלופיים מתוארים הפניות 18, 23, ו -24). באמצעות שיטה זו, שכותרתו תאי פלורסנטי, או להביע חלבוני ניאון או immunostained עבור סמני פני שטח, יכול להיות מטוהר על ידי FACS או מנותח על ידי cytometry זרימה. RNA יכול להיות מופק תאים מטוהרים לפרופיל דפוס ביטוי הגנים שלהם. לחלופין, תאים מטוהרים יכול להיות מתורבת להקים קו תא לניתוח proteomic שלאחר מכן. שיטה זו תאפשר האפיון של גורמי דוארxpressed ידי microenvironment הלבלב, אשר למשול organogenesis, פיזיולוגיה, והפתופיזיולוגיה שלה. Mesenchyme הלבלב תומך organogenesis רקמות באמצעות קידום ההתפשטות של מבשר ותאי בדיל 5, 9. תאים אלה הוצגו לתמוך הרחבת תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) -derived אבות לבלב 17, 25, 26. לכן, המגדיר את זהותו של גורמי mesenchymal עובריים יקל מאמצים נוכחיים כדי ליצור תאים בטאו מייצר אינסולין מן hESCs ותאי גזע מושרים (iPSCs) כתרופה פוטנציאל סוכרת. מחקרים גנטיים עכבר איפשר זיהוי של גורמי גדילה, כגון Fgf10, המיוצרים על ידי mesenchyme לקדם הרחבת האפיתל הלבלב בשלבים הראשונים של התפתחות הלבלב3, 9. במטרה לזהות גורמים נוספים לידי ביטוי mesenchyme העוברי, אנחנו מבודדים תאים אלה באמצעות microdissection ליזר שנתפס, חילוץ RNA שלהם, ובצענו ניתוח ביטוי גנים 26. עם זאת, בנוסף להיותו העבודה-אינטנסיבי, שיטה זו מסתמכת על זיהוי תאים בהתבסס על תכונות מורפולוגיות שלהם, אשר מגביל את השימוש בו לשלבים התפתחותיים לפני הסתעפות של האפיתל לתוך mesenchyme שמסביב (כלומר, E12.5). כדי לאפיין תאים mesenchymal בשלבים התפתחותיים מאוחר יותר, שיישמנו השיטה המתוארת כאן 5, 17. השתמשנו בשיטה זו כדי לנתח ביטוי סמן פני השטח על ידי mesenchyme 5 הלבלב בילוד. בנוסף, תאי mesenchymal בודדו רקמת לבלב עוברית בילוד של Nkx3.2 -Cre; עכברי R26-EYFP, מבוסס עלתיוג פלורסנט שלהם בתור העכבר הזה, והיה תרבותי להקים שורות תאים 17. ניתוח proteomic של תאים אלה מותר לצורך זיהוי של גורמים מופרשים mesenchyme הלבלב עם היכולת לקדם אבות לבלב נגזר hESC 17. בנוסף, אנו השתמשנו בשיטת בידוד תא זה לטהר תאי mesenchymal מרקמות לבלב מבוגרים עבור ביטוי גני מיצוי RNA ניתוח 17. לכן, שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות גנים וחלבונים שהביעו mesenchyme הלבלב, עם היכולת לתמוך בפיתוח תאי לבלב. תאי mesenchymal לבלב הוצגו עוד לשחק תפקיד tumorigenesis לבלב. PDAC מאופיין ההיווצרות של stroma desmoplastic עשיר-פיברובלסטים מורכבים פיברובלסטים, תאי מערכת חיסון, ECM 27. בעוד stroma היה נהוג לחשוב כדי לקדם את הפיתוח של רביםסוגים של סרטן, זה הוצג לרסן התקדמות PDAC 15, 16, 28. הדבר מצביע על כך רכיבים של stroma הלבלב להפריש גורמים המעכבים tumorigenesis. יתר על כן, שינויים בהרכב הסלולר stroma וכן פנוטיפ תא יכולים ביסוד השפיעו על תאי אפיתל 15, 16, 28. השיטה המתוארת כאן ולכן יכול לסייע באפיון תאים מסוגים שונים שמרכיבים stroma PDAC לעומת רקמת לבלב בריא. זה היה עוד יותר את הטיהור של סוגי תאי סטרומה השונים לאפיין שינויים פוטנציאליים פרופילי ביטוי הגנים שלהם במהלך התקדמות PDAC. עם זאת, בשל שינויים בהרכב ECM לבלב במהלך tumorigenesis 27, התאמות של הפרמטרים לעיכול רקמה, כגון הכללת additional סוגי collagenase או הגדלת זמן הדגירה, ייתכן שתידרש.

הומאוסטזיס אנרגיה ועיכול מזון ביונקים תלוי פונקצית לבלב נכונה. הלבלב המבוגר מורכב משני תאים סלולריים עיקריים: אקסוקרינית ואת האנדוקרינית. תאים אקסוקרינית, לרבות תאים acinar המייצרים ומפרישים אנזימים העיכול והתאים בתעלות אותה להעביר אנזימים אלה במעיים, להקיף יותר מ -80% ממסת 1 הלבלב הכולל. תאים האנדוקרינית, הכוללים תאי ביתא מייצר אינסולין ותאי אלפא מייצר גלוקגון, מאורגנים האיים לנגרהנס מוטבעות הרקמה אקסוקרינית ומפרישים הורמונים כדי לווסת את רמות סוכר בדם 2. תאי לבלב לרכוש גורל הבדיל שלהם באמצעות תהליך מאוד מוסדר, רב שלבי 3. הראיות עולה כי רמזים חיצוניים הניתנים על ידי נוירונים, אנדותל ותאים mesenchymal להנחות התמיינות תאים בלבלב ושגשוגם ב tהוא העובר 3, 4, 5. דוגמא אחת היא הדרישה של אב העורקים עבור המפרט של מבשרי לבלב מוקדם 6. בהמשך הפיתוח, תאי אנדותל הוצגו לשחק תפקיד מרכזי בהתפתחות של שני תאים האנדוקרינית אקסוקרינית הלבלב לקדם בידול בטא תאים 4, 6, 7. תאי mesenchymal הוצגו לתמוך הישרדות ורחבה של אבות לבלב נפוצים, בעיקר באמצעות הפרשת גורם הגדילה Fgf10 8, 9. הראינו עוד, כי תאים אלו תומכים בריבוי מבשר האנדוקרינית אקסוקרינית, כמו גם של תאים ממוינים (כולל תאי acinar ובטא) בלבלב העוברי 5. לאחרונה, תאי mesenchymal היו עודהראה להסדיר תאים האנדוקרינית בידול 10. בשינה המבוגרת, פונקצית תאי בטא ומסה הוצגו תלוי תאי microenvironment שלהם, כולל עצבי, חיסון, ותאי האנדותל, כמו גם pericytes 11, 12, 13. במהלך הפציעה, תאי אנדותל הוצגו לגייס תאים חיסוניים הלבלב לקדם בטא תאים שכפול 13. תאי האנדותל הוצגו נוספת לייצר תאי מטריקס (ECM) רכיבים לתמוך ביטוי אינסולין תאים בטא פונקציה 14. אנו לאחרונה הדגימו את הדרישה של pericytes איון לתפקוד תאים בטא 11. לבסוף, תאים של stroma הלבלב הוצגו להסדיר את התקדמות אדנוקרצינומה ductal הלבלב (PDAC) 15, 16. עם זאת, האידישות של רמזים חיצוניים המנחים בפיתוח לבלב, פונקציה, tumorigenesis הם ידועים ברובם. זיהוי רמזים הניתנים על ידי תאים של microenvironment הלבלב דורש המאפיין את הגנים והחלבונים הביעו על ידי תאים אלו. זה תלוי לבודד תאים אלה מהלבלב כדי לבצע ביטוי גנים וניתוחי proteomic ו / או על הקמת שורות תאים. כאן, אנו מציעים שיטה לבודד תאים mesenchymal של microenvironment הלבלב על ידי ניצול הקרינה המופעל עיכול אנזימטי רקמת התא מיון (FACS) של כל אחד immunofluorescently שכותרתו תאים או תאים המבטאים חלבוני ניאון. פרוטוקול זה בוצע בהצלחה לבודד ולנתח חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) -expressing תאים mesenchymal של העוברית, בילוד, ומבוגר הלבלב 5, 17.

<table><tbody><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche</td><td>11213865001</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td>The effective units should be at least 2,000 unitz/mL protein</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt solution (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>01-862-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Goat IgG serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>RNAse inhibitor</td><td>Invitrogen</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride</td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72 690</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Round Bottom Polystyrene 5 mL tube</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>FACS tube. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands</td></tr><tr><td>5 mL tube with 35 &amp;mu;m cell strainer Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>FACS tube</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m cell strainer&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>Heating block with agitation&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>ThermoMixer C</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ThermoFisher</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td>Steromicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td></td></tr><tr><td>Cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria IIu</td><td></td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>Gallios&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating and analyzing cells of the pancreas mesenchyme by flow cytometry

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.

Mesenchyme הלבלב נדרש במהלך התפתחות ובגרות. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הבידוד של תאי mesenchymal מן עוברי, בילוד, והלבלב המבוגר. תאים mesenchymal, אך אין סוגי תאים אחרים, לבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) בלבלב של Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP עכברים 5, 11, 17, 19. במהלך פיתוח, Nkx3.2 (הידוע גם בשם BapX1) בא לידי ביטוי על ידי לבלב עוברי, קיבת mesenchyme מעיים, כמו גם תת-קבוצה של somites שלד 19, 20, 21. גן זה התבטא mesenchyme הלבלב מ E9.5 עד E11.5, המאפשר ביטוי גנים בשליטת Nkx3.2 -Cre מ E9.5 5, </sup&gt; 19, 20. בהתבסס על תיוג זה, יכול להיות מטוהרים תאים מרקמות הלבלב בכמות גדולה באמצעות cytometry הזרימה. תרשים 2 מציג ניתוח התזרים-cytometry של תאים בודדים מן עובריות, בילוד, ורקמות לבלב מבוגרות, מבודדות כפי שמתואר כאן. בעוד רקמות הלבלב שאינו מהונדס לא מכילים תאים פלורסנט, Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP רקמת לבלב מכל הגילים נתחו מכילה אוכלוסיית תאים YFP שכותרתו ברורה (איור 2; המסומנות שערים). בעקבות השיטה המתוארת כאן, תאי מבטאי חלבוני ניאון יכולים להיות מטוהרים או מנותח על ידי cytometry זרימה, עם או בלי immunostaining נוסף. לדוגמה, לאחר מיון מבוסס על תיוג פלורסנט, תאים mesenchymal יכול להיות מתורבת להקים קו תא (במשך חמש קטעים לפחות), כפי שמוצג באיור 3 א. הערה t<html> הוא fibrocytic מורפולוגיה של תאים בתרבית, אופייני לתאי mesenchymal. בנוסף, מערכת זו שימשה לנתח ביטוי גנים על ידי תאים ממוינים. לשם כך, RNA הופק מתאי mesenchymal מסודרים לסנתז cDNA, ורמות ביטוי גנים נותחו על ידי qPCR. ניתוח כזה עולה כי תאים ממוינים לבטא את vimentin סמן הפאן mesenchymal (איור 3 ב). לבסוף, ביטוי סמן פני השטח על ידי תאי הלבלב יכול להיות מנותח על ידי-cytometry הזרימה. לדוגמה, אנחנו מבודדים תאים מרקמות הלבלב של Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP עכברים בוגרים בשיטה המתוארת כאן ומוכתמת אותם עם פני התא גליקופרוטאין CD9, אשר דווחו להתבטא פיברובלסטים 22. כפי שניתן לראות בתרשים 3C, כל fluorescently שכותרתו התאים Nkx3.2 -Cre; לבלב R26R -YFP להביע CD9. tp_upload / 55,344 / 55344fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1: רקמת לבלב עוברית בילוד. בדרך מבודדת כולו עיכול, כולל הבטן, טחול, מעי, ולבלב, של עובר E15.5 (א) ו גור P4 (B). רקמת הלבלב היא תחום עם קו כחול. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55344/55344fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig2.jpg" /> איור 2: תאים mesenchymal מסומנים fluorescently ב Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP רקמת לבלב. ניתוח זרימה cytometry של תאי הלבלב מבודד שאינו מהונדס (פאנלים משמאל) Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP מהונדס (לוחות מימין) עכברים בגילים שונים: עוברי (א), בילוד (B), ומודעהult (C). תאים נותחו על פיזור בצד (ציר y) קרינה צהובה (ציר x). גייטס (מסומן &quot;D&quot;) מצביע על בעיית אוכלוסיית תא YFP + בעכברים טרנסגניים אך לא בקבוצת ביקורת הלא מהונדסת. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55344/55344fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig3.jpg" /> איור 3: ניתוח של תאי לבלב מבודדים. (א) תאים ממוינים מן רקמת לבלב של Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP עכברים בילוד (כמתואר באיור 2B) היו בתרבית להקים קו התא. תאים בתרבית הם צילמו עבור פלואורסצנטי (ירוק; ימין לוחות משמאל) לעומת שלב (אפור; פאנל מימין). (ב) בתרשים בר מראה Vimentin1 (Vim1)רמות הביטוי על ידי YFP + -sorted תאים מרקמות הלבלב של Nkx3.2 -Cre; עכברי בוגרי R26R -YFP (כמתואר באיור 1C; ירוק) לעומת רקמת לבלב ממוינת (שחורה). RNA הופק ביטוי גנים נותח על ידי qPCR; הביטוי היה מנורמל Cyclophilin. N = 4. *** P &lt;0.001. הנתונים מייצגים את ממוצע ± סטיית תקן. (ג) ניתוח זרימת cytometry של תאי לבלב התפזרו Nkx3.2 -Cre; חיסוניים מוכתם מבוגר עכברי R26R -YFP עם allophycocyanin (APC), מצומדות נוגדן אנטי CD9 ונותח עבור APC (ציר y) קרינה צהובה (ציר x). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55344/55344fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry at JoVE.com

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד של תאים במייקרו-הסביבה של הלבלב עוברי, רקמת עכבר בילוד ומבוגרים, תוך התמקדות הבידוד של תאי mesenchymal. שיטה זו מאפשרת יצירת פרופיל של ביטוי גני התא והפרשת חלבון על מנת להבהיר את האותות החיצוניים המווסתים פיתוח לבלב, פונקציה, tumorigenesis.

בידוד וניתוח תאים של mesenchyme הלבלב ידי cytometry הזרימה

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

isolating-analyzing-cells-pancreas-mesenchyme-flow

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.1K Views.  Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University.  כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד של תאים במייקרו-הסביבה של הלבלב עוברי, רקמת עכבר בילוד ומבוגרים, תוך התמקדות הבידוד של תאי mesenchymal. שיטה זו מאפשרת יצירת פרופיל של ביטוי גני התא והפרשת חלבון על מנת להבהיר את האותות החיצוניים המווסתים פיתוח לבלב, פ?...

Video: Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly its immune-components, is vital to the prognosis and prediction of treatment outcomes, especially those of immunotherapy. TME immune-components are composed of different subsets of tumor-infiltrating immune cells assessable by multi-color FACS. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is among the deadliest malignances lacking good treatment options, thus an urgent and unmet medical need. One important reason for its non-responsiveness to various therapies (chemo-, targeted, I/O) has been its abundant TME, consisting of fibroblasts and leukocytes that protect tumor cells from these therapies. Orthotopically implanted PDAC is believed to more accurately recapture the TME of human pancreatic cancers than conventional subcutaneous (SC) models.
Homograft tumors (KPC) are transplants of mouse spontaneous PDAC originating from genetically engineered KPC-mice (KrasG12D/+/P53-/-/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). The primary tumor tissue is cut into small fragments (~2 mm3) and transplanted subcutaneously (SC) to the syngeneic recipients (C57BL/6, 7&#8211;9 weeks old). The homografts were then surgically orthotopically transplanted onto the pancreas of new C57BL/6 mice, along with SC-implantation, which reached tumor volumes of 300&#8211;1,000 mm3 by 17 days. Only tumors of 400&#8211;600 mm3 were harvested per approved autopsy procedure and cleaned to remove the adjacent non-tumor tissues. They were dissociated per protocol using a tissue dissociator into single-cell suspensions, followed by staining with designated panels of fluorescently-labeled antibodies for various markers of different immune cells (lymphoid, myeloid and NK, DCs). The stained samples were analyzed using multi-color FACS to determine numbers of immune cells of different lineages, as well as their relative percentage within tumors. The immune profiles of orthotopic tumors were then compared to those of SC tumors. The preliminary data demonstrated significantly elevated infiltrating TILs/TAMs in tumors over the pancreas, and higher B-cell infiltration into orthotopic rather than SC tumors.

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

The experimental procedure on the immunophenotyping of murine orthotopic PDAC homografts aims at profiling the tumor immuno-microenvironment. Tumors are orthotopically implanted via surgery. Tumors of 200&#8211;600 mm3 in size were harvested and dissociated to prepare single-cell suspensions, followed by multi-immune marker FACS analysis using different fluorescently-labeled antibodies.

Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Cancer Research

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological conditions including parasitic infection, inflammation, traumatic stress, graft-versus-host disease, diabetes and cancer1-7. In mice, MDSC express Mac-1 (CD11b) and Gr-1 (Ly6G and Ly6C) surface antigens7. It is important to note that MDSC are well studied in various tumor-bearing hosts where they are significantly expanded and suppress anti-tumor immune responses compared to na&iuml;ve counterparts7-10. However, depending on the pathological condition, there are different subpopulations of MDSC with distinct mechanisms and targets of suppression11,12. Therefore, effective methods to isolate viable MDSC populations are important in elucidating their different molecular mechanisms of suppression in vitro and in vivo.
Recently, the Ghansah group has reported the expansion of MDSC in a murine pancreatic cancer model. Our tumor-bearing MDSC display a loss of homeostasis and increased suppressive function compared to na&iuml;ve MDSC 13. MDSC percentages are significantly less in lymphoid compartments of na&iuml;ve vs. tumor-bearing mice. This is a major caveat, which often hinders accurate comparative analyses of these MDSC. Therefore, enriching Gr-1+ leukocytes from na&iuml;ve mice prior to Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enhances purity, viability and significantly reduces sort time. However, enrichment of Gr-1+ leukocytes from tumor-bearing mice is optional as these are in abundance for quick FACS sorting. Therefore, in this protocol, we describe a highly efficient method of immunophenotyping MDSC and enriching Gr-1+ leukocytes from spleens of na&iuml;ve mice for sorting MDSC in a timely manner. Immunocompetent C57BL/6 mice are inoculated with murine Panc02 cells subcutaneously whereas na&iuml;ve mice receive 1XPBS. Approximately 30 days post inoculation; spleens are harvested and processed into single-cell suspensions using a cell dissociation sieve. Splenocytes are then Red Blood Cell (RBC) lysed and an aliquot of these leukocytes are stained using fluorochrome-conjugated antibodies against Mac-1 and Gr-1 to immunophenotype MDSC percentages using Flow Cytometry. In a parallel experiment, whole leukocytes from na&iuml;ve mice are stained with fluorescent-conjugated Gr-1 antibodies, incubated with PE-MicroBeads and positively selected using an automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator. Next, an aliquot of Gr-1+ leukocytes are stained with Mac-1 antibodies to identify the increase in MDSC percentages using Flow Cytometry. Now, these Gr1+ enriched leukocytes are ready for FACS sorting of MDSC to be used in comparative analyses (na&iuml;ve vs. tumor- bearing) in in vivo and in vitro assays.

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

This is a rapid and comprehensive method of immunophenotyping Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) and enriching Gr-1+ leukocytes from mouse spleens. This method uses flow cytometry and AutoMACS Cell Sorting to enrich for viable Gr-1+ leukocytes prior to FACS sorting of MDSC for use in vivo and in vitro assays.

הכנת מיאלואידית תאים מדכאי נגזרים (MDSC) מן הגידול נושאות עכברים תמימים הלבלב באמצעות cytometry זרימה ומיון אוטומטי מגנטי נייד הופעל (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

Medicine

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The isolation of these cells offers the possibility of studying their involvement in cardiac diseases, and, in addition, provides a useful primary cell model to investigate biological mechanisms.
Here, the method for the isolation of C-MSC from arrhythmogenic cardiomyopathy patients&#39; bioptic samples is described. The endomyocardial biopsy sampling is guided in the right ventricular areas adjacent to the scar visualized by electro-anatomical mapping. The digestion of the biopsies in collagenase and their plating on a plastic dish in culture medium to allow C-MSC growth is described. The isolated cells can be expanded in culture for several passages. To confirm their mesenchymal phenotype, the description of immuno-phenotypical characterization is provided. C-MSC are able to differentiate into several cell types like adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts: in the context of ACM, characterized by adipocyte deposits in patients&#39; hearts, the protocols for the adipogenic differentiation of C-MSC and the characterization of lipid droplet accumulation are described.

In this article, a method to isolate cardiac mesenchymal stromal cells from endomyocardial bioptic samples of arrhythmogenic cardiomyopathy patients is provided. Their characterization and the protocol to boost their adipogenic differentiation are described.

בידוד ואפיון של תאי סטרומה Mesenchymal לב מדגימות Bioptic Endomyocardial של שריר הלב Arrhythmogenic חולים

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Pancreatic Tissue Dissection to Isolate Viable Single Cells

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for approximately 90% of the pancreas and includes cells that produce and secrete digestive enzymes. The digestive enzymes are produced in the pancreatic acinar cells, stored in vesicles called zymogens, and are then released into the duodenum via the pancreatic duct to initiate metabolic processes. The enzymes produced by the acinar cells can kill cells or degrade cell-free RNA. In addition, acinar cells are fragile, and common dissociation protocols result in a large number of dead cells and cell-free proteases and RNases. Therefore, one of the biggest challenges in pancreatic tissue digestion is recovering intact and viable cells, especially acinar cells. The protocol presented in this article shows a two-step method that we developed to meet this need. The protocol can be used to digest normal pancreata, pancreata that include pre-malignant lesions, or pancreatic tumors that include a large number of stromal and immune cells.

Pancreatic metaplastic cells are precursors of malignant cells that give rise to pancreatic tumors. However, isolating intact viable pancreatic cells is challenging. Here, we present an efficient method for pancreatic tissue dissociation. The cells can then be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) or for two- or three-dimensional co-culturing.

דיסקציה של רקמת הלבלב לבידוד תאים בודדים בני קיימא

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

בידוד של בתאי גזע xenografts סרטן הלבלב האנושי

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Biology

בידוד תאי לוויין משרירי גפיים של עכבר וניתוח ציטומטריית זרימה

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of satellite cells from the limb muscle, a tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice were mechanically disrupted by mincing in medium supplemented with dispase and type I collagenase. Upon digestion,&#160;the homogenate was filtered through cell strainers, and cells were suspended in FACS buffer. Viability was determined with fixable viability stain, and immunostained satellite cells were isolated by FACS. Cells were lysed with Triton X-100 and released nuclei were bound to concanavalin A magnetic beads. Nucleus/bead complexes were incubated with antibodies against the transcription factor or histone modifications of interest. After washes, nucleus/bead complexes were incubated with protein A-micrococcal nuclease, and chromatin cleavage was initiated with CaCl2. After DNA extraction, libraries were generated and sequenced, and the profiles for genome-wide transcription factor binding and covalent histone modifications were obtained by bioinformatic analysis. The peaks obtained for the various histone marks showed that the binding events were specific for satellite cells. Moreover, known motif analysis unveiled that the transcription factor was bound to chromatin via its cognate response element. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in adult mice limb muscle satellite cells.

מחבר זרקור: ניתוח Cistrome בתאי גזע שריר עכבר 

Presented here is an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of mouse limb muscle satellite cells adapted to the study of transcription regulation in muscle fibers by cleavage under targets and release using nuclease (CUT&amp;RUN).

פרוטוקול יעיל לניתוח CUT&amp;RUN של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FAC

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

בידוד של מזנכימה במעי מורין וכתוצאה מכך תשואה גבוהה של טלוציטים

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

בידוד וניתוח תאים של mesenchyme הלבלב ידי cytometry הזרימה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

הכנת מיאלואידית תאים מדכאי נגזרים (MDSC) מן הגידול נושאות עכברים תמימים הלבלב באמצעות cytometry זרימה ומיון אוטומטי מגנטי נייד הופעל (AutoMACS)

בידוד ואפיון של תאי סטרומה Mesenchymal לב מדגימות Bioptic Endomyocardial של שריר הלב Arrhythmogenic חולים

דיסקציה של רקמת הלבלב לבידוד תאים בודדים בני קיימא

בידוד של בתאי גזע xenografts סרטן הלבלב האנושי

פרוטוקול יעיל לניתוח CUT&RUN של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FAC

פרוטוקול יעיל לניתוח CUT&RUN של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FAC

פרוטוקול יעיל לניתוח CUT&RUN של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FAC

בידוד של מזנכימה במעי מורין וכתוצאה מכך תשואה גבוהה של טלוציטים