The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.

Deneyler Tel Aviv Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre gerçekleştirilmiştir. Fare gelen Pankreas Doku 1. İzolasyonu <ol><li> Yetişkin fareler için: <ol><li> 0.4 mg / ml kollajenaz P ve 0.1 ng / I Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde çözüldü ml DNaz: sindirim tamponu hazırlayın. Taze 15 ml konik tüpler fare başına tampon 5 ml hazırlamak ve kullanılana kadar buz üzerinde saklayın. </li><li> kurumsal kılavuzuna göre fareler Euthanize. </li><li> pankreas kaldırmak için her fare teşrih (öğretim için Reference 18 bakınız); HBSS içeren bir kültür kabı içine koyun. 4 adet - Bir stereomikroskop altında bu aşamada gerçekleştirmek için, ve sindirim etkinliğinin artırılması 2 doku kesmek mümkündür. </li><li> (Adım 1.1.1 hazırlandı) sindirim tamponu ihtiva eden bir tüpe pankreas dokusu yerleştirin. Tüm fareler disseke ve pankreas dokuları kadar buz üzerinde tüpler tutuntoplanmış. </li><li> Kalan fareler ile 1.1.4 - Tekrar 1.1.2 adımları. </li></ol></li><li> Embriyolar ve neonatal fareler için: <ol><li> 0.4 mg / ml kollajenaz P ve 0.1 ng / I HBSS içinde eritilmiş ml DNAz: sindirim tamponu hazırlayın. 15 ml konik tüp fare başına tampon 2 ml - doğum sonrası 7. günde (P7) ya da daha genç embriyo ve yavruların için, taze 1,5 hazırlamak. 15 ml konik bir tüp içinde, fare başına 4 ml tampon - P7 veya daha büyük yavrular için, 3 hazırlayın. Buz üzerinde kullanıma kadar muhafaza edin. </li><li> kurumsal kılavuzuna göre fareler Euthanize. embriyolar için, annelerinin rahmine tüm embriyolar kaldırmak ve PBS içeren 10 mm&#39;lik kültür kaplarına koyun. her seferinde bir embriyo teşrih. </li><li> başını uzak araştırmacı dan bakacak, sırtında fare yatıyordu. Ince forseps kullanarak, fare diyafram 18 kadar karın boşluğuna maruz orta hatta karın cildi ve açık yukarı çekin. </li><li> Ince forseps kullanarak, karaciğer fr ayırmakarka karın duvarı om. Fare kuyruğu doğru sürekli bir hareket ile, (karaciğer, mide, dalak, bağırsaklar, böbrek ve pankreas dahil) iç organları dışarı kepçe ve HBSS içeren bir kültür tabağına yerleştirin. </li><li> Bir stereomikroskop altında, karaciğer ve pankreası maruz böbrekleri (Şekil 1) çıkartın. Ince forseps kullanarak, dalak, nihayet mide, duodenum gelen pankreas ayırmak ve. </li><li> (Adım 1.2.1 hazırlandı) sindirim tamponu ihtiva eden bir tüpe pankreas dokusu yerleştirin. p14 veya daha büyük yavrular için, sindirim verimliliği artırmak için 2 adet doku kesmek. Tüm fareler disseke ve pankreas dokuları toplanana kadar buz üzerinde tüpler tutun. </li><li> Kalan fareler ile 1.2.6 - Tekrar 1.2.2 adımları. </li></ol></li></ol> 2. Pankreas Sindirim <ol><li> agitat ile 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de bir ısıtma bloğu (sindirim tamponu içinde) pankreas dokusu ihtiva eden tüpler inkübe700 rpm&#39;de ve iyon. 15 dakika sonra, elle onları 3 ters çevrilerek tüpleri sallamak - 4 kez ve geri ısıtma bloğu koyun. Ajitasyon yetenekleri olmayan bir ısıtma bloğu kullanıyorsanız, boruları her 5 ters - 10 dk: NOT. Doku düzgün sindirilir olduğundan emin olun. Değilse, inkübasyondan önce küçük parçalar halinde doku kesme ya da ajitasyon artar. </li><li> Doku sindirim durdurmak buz üzerinde tüpler yerleştirin ve her tüpe soğuk HBSS 10 ml ekleyin. 4 ° C&#39;de tüpler santrifüj ve 5 dakika boyunca 300 x g ve süpernatan aspire. </li><li> Yeniden süspansiyon: <ol><li> Yetişkin fare ve P14 veya daha büyük yavrular için, PBS 6 mL pelet yeniden askıya ve yeni bir 15 mL konik toplama polipropilen tüp üzerine yerleştirilmiş bir 70 mikron hücre süzgecinden geçirin. maksimal hücre iyileşme sağlamak için, PBS ilave 6 ml orijinal tüp yıkayın ve toplama tüpüne hücre süzgecinden süzün. </li><li> Embriyolar ve yavrular genç tHan P14, 2 mL PBS ile pelet yeniden askıya ve 5 mL&#39;lik yuvarlak dipli bir polistiren toplama tüpü (FACS tüpü) üstüne yerleştirilmiş bir 35 mikron hücre süzgecinden geçirin. Maksimal hücre iyileşme sağlamak için, PBS ek olarak 2 mL orijinal tüp yıkama, toplama tüpünün üzerine hücre süzgecinden geçirin. </li></ol></li><li> 4 ° C&#39;de tüpler santrifüj ve 5 dakika boyunca 300 x g ve süpernatan aspire. Hücreler gevşek polistiren tüpüne bağlı olarak, dikkatli bir şekilde sıvı çıkarın. </li></ol> 3. Tek Hücreleri Etiketli Hazırlanması <ol><li> Tampon hazırlanması: FACS hücre izolasyonu için,% 5 fetal sığır serumu (FBS) ve 5 mM EDTA (kalsiyum klorür ve magnezyum klorür) olmadan PBS karıştırılarak tampon sıralama hazırlar. Akışkan sitometri analizi için,% 0.05 sodyum azid ile ayırma tamponu ilave ile analiz tamponu hazırlayın. Her iki tampon maddesi en fazla 2 ay boyunca 4-8 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> sıralama veya Ana hücrelerin yeniden askıyaliziz tamponu. P8 ve 1.5 mL eski bir ay arasında yavrularından embriyolar ve 1 mL P7 daha genç yavruların izole her pankreas, yeniden askıya ve 3 mL bir ay farelerden daha büyük. Yuvarlak dipli bir polistiren tüp (FACS tüpü) üstüne yerleştirilmiş bir 35 mikron hücre süzgecinden hücreleri süzün. </li><li> kontrolleri boyanması için, önceki adımda (toplam örnek hacmi en fazla% 5) yapılan örneklerden 100 mcL alikotları için 50- çıkar ve yeni FACS tüpler içine yerleştirin; DAPI floresan proteinleri de dahil olmak üzere, kullanılan her bir fluorofor için bir tüp, ve aynı zamanda bir lekesiz kontrolü bulunmaktadır. Not: bir flüoresan proteini eksprese eden hücrelerle transgenik fareler kullanılarak, hücre sayısı sınırlı olduğunda, ya da bir boyama kontrol olarak transgenik olmayan bir doku içerir. Bir floresan proteini eksprese eden hücreler bundan başka boyama kullanıldı ise, 3.8 adım geçin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri aşağı Spin ve süpernatant aspire. </li><li> bloğunKing, (keçi IgG 1 uL ile takviye sıralama 100 uL veya analiz tamponu) bloke etme çözeltisi ile hücrelerin yeniden askıya alma ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edilir. </li><li> hücre yüzeyi işaretçileri leke için, numune başına 100 uL bir hacimde, istenen tüm florofor-konjuge antikor içeren bir karışımın hazırlanması. Ayırma veya analiz tamponu içinde 2x antikor dilüe (yani, çift gerekli konsantrasyon elde etmek için bir antikor seyreltilmiş 1; nihai seyreltme: 100: 200 istenirse, antikor 1 seyreltilmiş). Engelleme solüsyonun olmadan, 200 uL nihai boyama hacmi elde etmek örnek hücreleri karışımın 100 uL ilave edin. Buz üzerinde 30-60 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin. </li><li> tek (boyama kontrolü) kullanılan antikorların içeren ek tüpler hazırlamak, analiz veya sıralama parametreleri (adımlarını 4.3 ve 5.2) ayarlamak için kullanılır. (Adım 3.6 açıklandığı gibi) sıralama veya analiz tamponu 2x antikor dilüsyonları hazırlayın. Yap si eklemeyi unutmayınkullanılan her florofor, hem de lekelenmemiş kontrol ngle boyama kontrol seyreltme. Engelleme solüsyonun olmadan, 200 uL nihai boyama hacmi elde etmek (adım 3.3 hazırlandı) hücrelere antikor karışımı, 100 uL ilave edin. Buz üzerinde ve karanlıkta 60 dakika - 30 inkübe edin. </li><li> analizi ile her tüp doldurma ya da 4 ml&#39;lik bir maksimum hacme kadar tampon sıralayarak yıkayın. (Adım 3.2 de tarif edildiği gibi), isteğe bağlı olarak, 35 mikron hücre süzgecinden hücreleri yeniden süzün. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ve dikkatli bir şekilde supernatant çıkarın. </li><li> analiz veya tampon sıralama örnekleri yeniden askıya. 2 mL eski 3 ay ve 3 3 ay ml daha eski farelerden alınan - 1, 1 mL bir ay daha genç yavruların, 500 uL embriyoların izole hücrelerin yeniden askıya. Boyama kontrol tampon maddesi 300 uL içinde yeniden süspanse edilebilir. </li><li> 200 ng ekle / DAPI mL ölü hücreleri tanımlamak için hücreler yeniden askıya için. Make a tüp co eklemeyi unutmayınsitometresinin ayarları için DAPI olmadan lekesiz hücreleri ntaining. hücre sıralama (aşama 4) ya da analiz (aşama 5) &#39;e geçin. </li></ol> 4. Hücre Ayırma <ol><li> hazırlıklar: <ol><li> RNase ile RNA ekstre önce, kaplama bir 1.5 ml toplama tüpü hücre sıralama için önleyicisi hemen sıralamadan önce. Bu amaçla steril bir 1.5 ml toplama tüpüne, 0.01 U / ml RNaz inhibitörü içeren tampon sıralama 1 ml. 5 dakika sonra, tüp vorteks ve sıvıyı ayırın. </li><li> Hücre kültürü önce hücre sıralama için, steril bir kültür ortamının 3 ml ilave edilir, steril bir 15 ml toplama tüpüne (Dulbecco Değiştirilmiş Kartal Ortamı (DMEM)% 20 FBS,% 1 L-glutamin ile takviye edilmiş, ve penisilin-streptomisin,% 1) . </li></ol></li><li> FACS sıralayıcı içine bir tüp yüklemeden önce, girdap kısaca hücrelerin yeniden askıya. Buz üzerinde kalan tüpler tutun. </li><li> (Örn sıralama parametreleri belirlemek için boyama kontrolleri analiz ederek başlayın, </em&gt; Gerilim ve telafisi) ve sıralama kapıları (örneğin, toplam hücre popülasyonu, canlı DAPI-negatif hücreler ve hücre popülasyonları) sıralanacak. </li><li> sıralama parametreleri ve kapıları yukarı ayarlandıktan sonra, örnekler yüklemek ve toplama tüpleri içine sıralama hücreyi başlatın. NOT: Sıralama koşulları alet üzerinde son derece bağlıdır. Bu 100 um meme genişlik, 23.1 psi&#39;lik bir basınç ve 5 maksimum ayırma hızı kullanır. </li><li> RNA ekstraksiyonu veya sıralanmış hücrelerin kültürlenmesi geçin. Not: RNA ekstraksiyonu için, 5 dakika boyunca 2,000 x g&#39;de santrifüj hücreleri ve standart bir ekstraksiyon protokolü ile devam etmeden önce, fazla sıvının çıkması. Hücreler, steril olmayan koşullarda kriteri eğer, hücrelerin kültürlenmesi için, kültür ortamı ile tüp doldurma ve kirlenmeyi en aza indirmek için kültür önceki 7 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj bunu iki kez yıkayın. </li></ol> Akış Sitometrisi ile 5. Hücre Analizi <ol><li> l öncesitometre girdabına her tüp oading kısaca hücrelerin yeniden askıya. Buz üzerinde kalan tüpler tutun. </li><li> Analiz parametrelerini (örneğin, gerilim ve telafisi) belirlemek amacıyla lekesiz ve tek boyanmış numunelerin analiz ederek başlayın. </li><li> analiz parametreleri ayarlandıktan sonra, boyama kontrolü de dahil olmak üzere her örnek yüklemek ve sonuçları kaydedin. analiz yazılımı flow sitometri kullanılarak elde edilen sonuçlar analiz edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li><li>Cabrera, O., Berman, D. M., Kenyon, N. S., Ricordi, C., Berggren, P. -. O., Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function.">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).</li><li>Gittes, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology+of+the+pancreas:+a+comprehensive+review.">Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review.</a> Developmental biology. 326 (1), 4-35 (2009).</li><li>Villasenor, A., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+developing+pancreas+and+its+blood+vessels:+An+evolving+dialog.">Crosstalk between the developing pancreas and its blood vessels: An evolving dialog.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. , 1-8 (2012).</li><li>Landsman, L., Nijagal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+mesenchyme+regulates+epithelial+organogenesis+throughout+development.">Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development.</a> PLoS Biology. 9 (9), e1001143 (2011).</li><li>Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pancreatic+differentiation+by+signals+from+blood+vessels.">Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels.</a> Science. 294 (5542), 564-567 (2001).</li><li>Pierreux, C. E., Cordi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial:+Endothelial+cross-talk+regulates+exocrine+differentiation+in+developing+pancreas.">Epithelial: Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas.</a> Developmental biology. 347 (1), 216-227 (2010).</li><li>Golosow, N., Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitheliomesenchymal+interaction+in+pancreatic+morphogenesis.">Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis.</a> Developmental biology. 4, 242-255 (1962).</li><li>Bhushan, A., Itoh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf10+is+essential+for+maintaining+the+proliferative+capacity+of+epithelial+progenitor+cells+during+early+pancreatic+organogenesis.">Fgf10 is essential for maintaining the proliferative capacity of epithelial progenitor cells during early pancreatic organogenesis.</a> Development. 128 (24), 5109-5117 (2001).</li><li>Larsen, B. M., Hrycaj, S. M., Newman, M., Li, Y., Wellik, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Hox6+function+is+required+for+mouse+pancreatic+endocrine+cell+differentiation.">Mesenchymal Hox6 function is required for mouse pancreatic endocrine cell differentiation.</a> Development. 142 (22), 3859-3868 (2015).</li><li>Sasson, A., Rachi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+pericytes+are+required+for+beta-cell+maturity.">Islet pericytes are required for beta-cell maturity.</a> Diabetes. 65 (10), 3008-3014 (2016).</li><li>Stanley, S. A., Kelly, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+electromagnetic+control+of+the+hypothalamus+regulates+feeding+and+metabolism.">Bidirectional electromagnetic control of the hypothalamus regulates feeding and metabolism.</a> Nature. 531 (7596), 647-650 (2016).</li><li>Brissova, M., Aamodt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+microenvironment,+modulated+by+vascular+endothelial+growth+factor-A+signaling,+promotes+&#946;+cell+regeneration.">Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes &#946; cell regeneration.</a> Cell metabolism. 19 (3), 498-511 (2014).</li><li>Nikolova, G., Jabs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+basement+membrane:+a+niche+for+insulin+gene+expression+and+Beta+cell+proliferation.">The vascular basement membrane: a niche for insulin gene expression and Beta cell proliferation.</a> Developmental cell. 10 (3), 397-405 (2006).</li><li>Rhim, A. D., Oberstein, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+elements+act+to+restrain,+rather+than+support,+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer cell. 25 (6), 735-747 (2014).</li><li>&#214;zdemir, B. C., Pentcheva-Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival.">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer cell. 25 (6), 719-734 (2014).</li><li>Russ, H. A., Landsman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Proteomic+Analysis+of+Pancreatic+Mesenchyme+Reveals+Novel+Factors+That+Enhance+Human+Embryonic+Stem+Cell+to+Pancreatic+Cell+Differentiation.">Dynamic Proteomic Analysis of Pancreatic Mesenchyme Reveals Novel Factors That Enhance Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Cell Differentiation.</a> Stem cells international. 2016, 6183562 (2016).</li><li>Gout, J., Pommier, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Mouse+Primary+Pancreatic+Acinar+Cells.">Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50514 (2013).</li><li>Verzi, M. P., Stanfel, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+homeodomain+transcription+factor+Bapx1+in+mouse+distal+stomach+development.">Role of the homeodomain transcription factor Bapx1 in mouse distal stomach development.</a> Gastroenterology. 136 (5), 1701-1710 (2009).</li><li>Tribioli, C., Frasch, M., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bapx1:+an+evolutionary+conserved+homologue+of+the+Drosophila+bagpipe+homeobox+gene+is+expressed+in+splanchnic+mesoderm+and+the+embryonic+skeleton.">Bapx1: an evolutionary conserved homologue of the Drosophila bagpipe homeobox gene is expressed in splanchnic mesoderm and the embryonic skeleton.</a> Mech Dev. 65 (1-2), 145-162 (1997).</li><li>Hecksher-Sorensen, J., Watson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+splanchnic+mesodermal+plate+directs+spleen+and+pancreatic+laterality,+and+is+regulated+by+Bapx1/Nkx3.2.">The splanchnic mesodermal plate directs spleen and pancreatic laterality, and is regulated by Bapx1/Nkx3.2.</a> Development. 131 (19), 4665-4675 (2004).</li><li>Walmsley, G. G., Rinkevich, Y., Hu, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Fibroblast+Harvest+Reveals+Surface+Marker+Shift+In+Vitro.">Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift In Vitro.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. , (2014).</li><li>Morris, J. P., Greer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer+regulates+differentiation+and+viability+during+mouse+pancreatic+cancer+initiation.">Dicer regulates differentiation and viability during mouse pancreatic cancer initiation.</a> PloS one. 9 (5), 95486 (2014).</li><li>Miyatsuka, T., Matsuoka, T. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronological+analysis+with+fluorescent+timer+reveals+unique+features+of+newly+generated+&#946;-cells.">Chronological analysis with fluorescent timer reveals unique features of newly generated &#946;-cells.</a> Diabetes. 63 (10), 3388-3393 (2014).</li><li>Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic-stem-cell-derived+progenitors+by+organ-matched+mesenchyme.">Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme.</a> Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).</li><li>Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+expressed+by+murine+embryonic+pancreatic+mesenchyme+enhance+generation+of+insulin-producing+cells+from+hESCs.">Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs.</a> Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).</li><li>Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Hedgehog+signaling+enhances+delivery+of+chemotherapy+in+a+mouse+model+of+pancreatic+cancer.">Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer.</a> Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).</li><li>Raz, Y., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inflammatory+vicious+cycle:+Fibroblasts+and+immune+cell+recruitment+in+cancer.">An inflammatory vicious cycle: Fibroblasts and immune cell recruitment in cancer.</a> Experimental cell research. 319 (11), 1596-1603 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, biz izole etmek ve pankreas mikroçevresinin hücreleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, embriyonik ve yetişkin pankreas dokusundan mezenkimal hücreleri izole etmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, başarılı bir şekilde yetişkin ve yeni doğan pankreas 5, 17 endotel hücreleri izole etmek için bu protokolü kullanılmıştır. Bununla birlikte, (alternatif protokoller 24 Kaynaklar 18, 23 tarif edilen ve edilmiştir) pankreas epitel hücreleri tekrar üretilebilir bir tek hücre süspansiyonu elde etmek için uygun olmayabilir. Bu yöntem, floresan etiketli hücreler kullanılarak ya floresan proteinleri ifade eden ya da yüzey belirteçleri için boyanmış, FACS ile saflaştınldı ve akış sitometrisi ile analiz edilebilir. RNA gen sentezleme modelini profil saflaştırılmış hücrelerinden elde edilebilir. Alternatif olarak, saflaştırılmış hücreler, daha sonra proteomik analizi için bir hücre çizgisi oluşturmak için kültürlenebilir. Bu yöntem, faktör D karakterizasyonu sağlayacaktıronun organogenesis, fizyoloji ve patofizyolojisi yöneten pankreas mikro-tarafından xpressed. Pankreatik mezenşimin öncüleri ve farklı hücreler 5, 9 çoğalmasını teşvik doku organogenez destekler. Bu hücreler, insan embriyonik kök hücre büyümesini desteklemek gösterilmiştir (hESC) pankreas atalarıdır 17, 25, 26 -türevlenmiş. Bu nedenle, embriyonik mezenşimal faktörleri kimliğini belirleyen HESC ve diyabet için potansiyel bir tedavi olarak uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) insülin üreten beta hücrelerinin üretilmesi için mevcut çabalar kolaylaştıracaktır. Fare genetik çalışmalar pankreas gelişiminin erken evrelerinde pankreas epitel genişleme teşvik etmek mezenşimin tarafından üretilen gibi FGF10 gibi büyüme faktörleri, tanımlanmasını izin3, 9. Embriyonik mezenşimin ifade ek faktörlerin belirlenmesi amacıyla, biz, lazer yakalanan mikrodiseksiyon kullanarak bu hücrelerin izole onların RNA ayıklanır ve gen ifadesi analizi 26 seslendirdi. Bununla birlikte, emek-yoğun bir olmanın yanı sıra, bu yöntem, önceden çevre mezenşim (yani, E12.5) içerisine epitel dallanma gelişim aşamalarına kullanımını kısıtlar morfolojik özellikleri, temel hücrelerin belirlenmesi dayanır. Daha sonra gelişim aşamalarında mezenkimal hücreler karakterize etmek için, biz burada 5, 17 açıklanan yöntemi kullanılmıştır. Biz yenidoğan pankreas mezenşimin 5 yüzey işaretleyici ifade analiz etmek için bu yöntem kullanılır. Buna ek olarak, mezenkimal hücreler, Nkx3.2 -Cre embriyonik ve neonatal pankreas dokusundan izole edilmiştir; R26-EYFP fareler görefluoresan bu fare hattı etiketleme ve hücre çizgileri 17 kurmak için kültürlendi. HESC türetilen pankreas progenitörlerin 17 desteklemek için yeteneği ile pankreas mezenşimin salgılanan faktörlerin tanımlanması için izin verilen bu hücrelerin proteomik analizi. Biz daha RNA ekstraksiyon ve gen ekspresyon analizi 17 yetişkin pankreas dokulardan mezenkimal hücreler arındırmak için bu hücre izolasyon yöntemi kullanılmıştır. Bu nedenle, bu yöntem, pankreatik hücre gelişimini desteklemek için yeteneği, pankreas mezenşim ile ifade edilen genleri ve proteinleri tanımlamak için kullanılabilir. Pankreas mezenkimal hücreler daha pankreas tümörü oluşumunda rol oynadığı gösterilmiştir. PDAC fibroblastlar, bağışıklık hücreleri içeren bir fibroblast zengin desmoplastik stroma oluşumu ve ECM 27 ile karakterize edilir. Stroma çok gelişmesini teşvik etmek düşünce ikenkanser türleri, o PDAC ilerlemesini 15, 16, 28 sınırlamaya gösterilmiştir. Bu pankreas stroma bileşenleri tümörogenez inhibe eden faktörleri salgılar düşündürmektedir. Ayrıca, stroma hücre bileşimin hem de hücre fenotipinde bir değişiklik epitel hücreleri 15, 16, 28 üzerindeki etkisinin altında olabilir. Burada tarif edilen yöntem, bu nedenle, sağlıklı pankreas dokusu ile karşılaştırıldığında PDAC stroma oluşturan farklı hücre tipleri karakterize yardımcı olabilir. Bundan başka, farklı bir stromal hücre tiplerinin saflaştırma PDAC ilerlemesi sırasında gen ekspresyon profillerinin potansiyel karakterize etmek izin verir. Ancak, tümörogenez 27 sırasında pankreas ECM bileşimindeki değişikliklere, bu tür addit dahil olarak doku sindirim parametrelerinin ayarlamaları,uğratarak kollajenaz tip ya da kuluçka süresini arttırmak gerekli olabilir.

Enerji homeostasis ve memelilerde gıda sindirim düzgün pankreas fonksiyonuna bağlıdır. ekzokrin ve endokrin: yetişkin pankreas iki hücre bölümlerinde oluşmaktadır. Üreten ve salgılayan sindirim enzimleri ve gut, bu enzimleri taşıma kanalı hücreleri, toplam pankreas kütlesinin 1% 80&#39;den fazlasını kapsayacak asiner hücreleri de dahil olmak üzere dış salgı hücreleri. Insülin üreten beta hücrelerini ve glukagon üreten alfa hücreleri bulunur endokrin hücreleri, ekzokrin dokusunda gömülü ve kan şekeri düzeylerini 2 düzenleyen hormonlar salgılar vardır Langerhans adacıkları düzenlenmektedir. Pankreas hücreleri yüksek regüle, çok aşamalı süreç 3 aracılığıyla farklılaşmış kaderini kazanır. Kanıt nöronal, endotelyal ve mezenkimal hücreler tarafından sağlanan dış ipuçları t pankreatik hücre farklılaşması ve çoğalması yol olduğunu göstermektedirEmbriyonun 3, 4, 5. Bir örnek erken pankreas öncüleri 6 özellikleri için aort gerekliliktir. Daha sonra bir gelişme olarak, endotel hücreleri, hem de pankreas salgı ve ekzokrin hücreleri gelişiminde önemli bir rol oynar ve beta hücre farklılaşması, 4, 6, 7 teşvik ettikleri gösterilmiştir. Mezenkimal hücreler esas büyüme faktörü FGF10 8, 9 salgılanması yoluyla, hayatta kalma ve ortak pankreas atalarıdır genişlemesini desteklemek gösterilmiştir. Biz ayrıca, bu hücreler, embriyonik pankreas 5 endokrin ve ekzokrin öncülerinin proliferasyonunu, hem de bir (asinar ve beta hücreleri dahil) farklılaşmış hücreleri destek göstermiştir. Son zamanlarda, mezenkimal hücreler, daha vardıendokrin hücreleri farklılaşmasını 10 düzenleyen gösterilmiştir. Yetişkinde, beta hücresi işlevi ve kütle bağışıklık nöronal, ve endotelyal hücreler gibi perisitlerin 11, 12, 13 dahil olmak üzere, mikro-hücre bağlıdır gösterildi. Yaralanma sırasında endotel hücreleri beta hücresi çoğalmasını 13 desteklemek için pankreas bağışıklık hücreleri iyileştirme gösterildi. Endotel hücreleri daha insülin ekspresyonu ve beta hücresi fonksiyonunu 14 desteklemek için hücre dışı matris (ECM) bileşenleri üretmek için gösterildi. Biz son zamanlarda beta hücre fonksiyonu 11 adacık perisitlerin gereksinimi gösterdi. Son olarak, pankreas stroma hücreleri, pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) 15, 16 ve ilerlemesini düzenleyen gösterildi. Bununla birlikte, kimlikPankreas geliştirme, fonksiyon ve tümörogenez rehberlik dışsal ipuçlarını işletmenin büyük ölçüde bilinmemektedir. pankreas mikro-hücreleri tarafından sağlanan ipuçları belirlenmesi, bu hücreler tarafından ifade edilen genleri ve proteinleri karakterize gerektirir. Bu ve / veya hücre hatları kurma gen ekspresyonunu ve proteomik analizlerini gerçekleştirmek için pankreastan bu hücrelerin izole edilmesi bağlıdır. Burada, floresan proteinleri ifade immunofluorescently-işaretli hücrelerin veya hücre ya sıralama doku, enzimatik sindirim ve floresans ile aktive edilmiş hücre (FACS) kullanılarak pankreas mikro mezenşimsel hücrelerde izole etmek için bir yöntem önerilmektedir. Bu protokol, başarılı bir şekilde, oluşum safhasındaki neonatal ve yetişkin pankreas 5, 17, mezenkimal hücreler izole ve sarı floresan protein (YFP) -expressing analiz gerçekleştirilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche</td><td>11213865001</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td>The effective units should be at least 2,000 unitz/mL protein</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt solution (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>01-862-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Goat IgG serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>RNAse inhibitor</td><td>Invitrogen</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride</td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72 690</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Round Bottom Polystyrene 5 mL tube</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>FACS tube. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands</td></tr><tr><td>5 mL tube with 35 &amp;mu;m cell strainer Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>FACS tube</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m cell strainer&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>Heating block with agitation&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>ThermoMixer C</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ThermoFisher</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td>Steromicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td></td></tr><tr><td>Cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria IIu</td><td></td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>Gallios&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating and analyzing cells of the pancreas mesenchyme by flow cytometry

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.

Pankreas mezenşimin gelişimi ve yetişkinlik döneminde gereklidir. Burada anlatılan yöntemi embriyonik, yenidoğan ve yetişkin pankreastan mezenkimal hücrelerin izolasyonu sağlar. Mezenkimal hücreler, ancak başka bir hücre tipi, Nkx3.2 -Cre pankreaslarında sarı floresan protein (YFP) ifade; R26R -YFP fareleri 5, 11, 17, 19. Gelişimi sırasında, (aynı zamanda BapX1 olarak da bilinir) Nkx3.2 embriyonik pankreas, mide ve bağırsak mezenşimin, hem de iskelet somitlerinden 19, 20, 21 bir alt kümesi ile ifade edilir. Bu gen, E9.5 5&#39;ten Nkx3.2 -Cre kontrolü altında gen ekspresyonunu sağlayan, E11.5 kadar E9.5 pankreatik mezenşimin ifade edildi </sup&gt; 19, 20. Bu etiketleme göre, hücreler, akış sitometrik kullanarak toplu pankreas dokusundan saflaştırılabilir. Şekil 2, burada açıklandığı gibi izole edilmiş, oluşum safhasındaki neonatal ve yetişkin pankreas dokularından tek hücreler bir akış sitometri analizini göstermektedir. Transgenik olmayan pankreas dokuları floresan hücreleri içermiyordu Oysa, Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP tüm analiz yaştan pankreas dokusu ayrı bir YFP etiketli hücre popülasyonu (; kapıları ile işaretlenmiş Şekil 2) içerir. Burada tarif edilen yöntem izlenerek, floresan proteinleri ifade eden hücreler, saflaştırılmış ya da ya da fazla immün olmaksızın akış sitometrisi ile analiz olabilir. Şekil 3A&#39;da gösterildiği gibi, örneğin, floresan etiketleme göre sıralama sonra, mezenkimal hücreler, (en az beş geçişleri için) hücre hattı oluşturmak için kültürlenebilir. Not t<html> O mezenkimal hücreler tipik kültürlü hücrelerin morfolojisi fibrocytic. Buna ek olarak, bu sistem kriteri hücrelerin gen ekspresyonunu analiz etmek için kullanıldı. Bu amaçla, RNA, cDNA sentezlemek için kriteri mezenkimal hücrelerden ekstre edildi, ve gen ekspresyon düzeyleri, QPCR kullanılarak analiz edilmiştir. Böyle bir analiz sıralı hücrelerin pan-mezenkimal işaretleyici vimentin (Şekil 3B) ifade ortaya koymuştur. Son olarak, pankreas hücrelerinin yüzey markör ifade akış sitometrisi ile analiz edilebilir. Örneğin, Nkx3.2 -Cre pankreas dokusundan izole edilen hücreler; R26R -YFP burada açıklanan ve fibroblastların 22 ile ifade olduğu bildirilmiştir CD9 glikoproteini hücre yüzeyi, ile boyanmış yöntemi kullanılarak yetişkin fareler. Şekil 3C&#39;de gösterildiği gibi, tüm Nkx3.2 -Cre hücreler floresan etiketli; R26R -YFP pankreas BS9 ifade eder. tp_upload / 55344 / 55344fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1: Embriyonik ve yenidoğan pankreas dokusu. Bir E15.5 embriyo (A) ve P4 pup (B), mide, dalak, bağırsak ve pankreas da dahil olmak üzere izole bütün mide-bağırsak sistemi,. pankreas dokusu mavi çizgi ile çizilmiş olan. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55344/55344fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig2.jpg" /> Şekil 2: Mezenkimal hücreler floresan Nkx3.2 -Cre etiketlenmiştir; R26R -YFP pankreas dokusudur. Transgenik olmayan (paneller sol) ve Nkx3.2 -Cre izole pankreas hücrelerinin akış sitometri analizi; R26R -YFP çeşitli yaşlarda transgenik (sağ paneller) fareler: embriyonik (A), neonatal (B), ve reklamULT (C). Hücreler, yan dağılım (y-ekseni) ve sarı floresan (x-ekseni) için analiz edilmiştir. ( &quot;D&quot; işaretli) Kapı transjenik olmayan kontrol transjenik farelerde bir YFP + hücre popülasyonunun varlığı değil göstermektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55344/55344fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55344/55344fig3.jpg" /> Şekil 3: İzole pankreas hücrelerinin Analizleri. Nkx3.2 -Cre pankreas dokusundan kriteri (A) hücreleri; R26R -YFP (Şekil 2B&#39;de tarif edildiği gibi), neonatal farelerde hücre hattı oluşturmak için kültürlendi. (; Sağ ve sol paneller yeşil) ve faz kontrast kültürlü hücreler floresan görüntülendi (gri; sağ panel). (B) Vimentin1 (Vim1) gösteren Bar şemasıNkx3.2 -Cre pankreas dokusundan YFP + -sorted hücreler tarafından ifade seviyeleri; Sıralanmamış pankreas dokusu (siyah) ile karşılaştırıldığında, R26R -YFP yetişkin fare (yeşil Şekil 1C&#39;de tarif edildiği gibi). RNA ekstre edildi ve gen ekspresyonu qPCR ile analiz edilmiştir; ifadesi siklofiline normalize edildi. K = 4 *** p &lt;0.001. Veriler ± SD ortalamasını temsil etmektedir. (C) Nkx3.2 -Cre dağılmış pankreas hücrelerinin akış sitometri analizi; R26R -YFP yetişkin farenin bağışıklık lekeli allofikosiyanin (APC), anti-CD9 antikoru ile konjüge edilmiş ve APC (y-ekseni) ve sarı floresan (x-ekseni) için analiz edilmiştir. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55344/55344fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry at JoVE.com

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Burada, mezenkimal hücrelerin izolasyonu odaklanan embriyo, neonatal ve yetişkin fare doku pankreas mikro-hücrelerin izolasyonu için bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, pankreas gelişimi, fonksiyon ve kanser oluşumunda düzenleyen dış sinyaller aydınlatmak için hücre gen ekspresyonu ve protein salgılanmasının profil sağlar.

Yalıtımlı ve Akış Sitometrisi ile Pankreas mezenkim ve Hücreler Analizi

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

isolating-analyzing-cells-pancreas-mesenchyme-flow

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.1K Görüntüleme.  Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University.  Burada, mezenkimal hücrelerin izolasyonu odaklanan embriyo, neonatal ve yetişkin fare doku pankreas mikro-hücrelerin izolasyonu için bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, pankreas gelişimi, fonksiyon ve kanser oluşumunda düzenleyen dış sinyaller aydınlatmak için hücre gen ekspresyonu ve protein salgılanmasının profil sağlar. 

Video: Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly its immune-components, is vital to the prognosis and prediction of treatment outcomes, especially those of immunotherapy. TME immune-components are composed of different subsets of tumor-infiltrating immune cells assessable by multi-color FACS. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is among the deadliest malignances lacking good treatment options, thus an urgent and unmet medical need. One important reason for its non-responsiveness to various therapies (chemo-, targeted, I/O) has been its abundant TME, consisting of fibroblasts and leukocytes that protect tumor cells from these therapies. Orthotopically implanted PDAC is believed to more accurately recapture the TME of human pancreatic cancers than conventional subcutaneous (SC) models.
Homograft tumors (KPC) are transplants of mouse spontaneous PDAC originating from genetically engineered KPC-mice (KrasG12D/+/P53-/-/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). The primary tumor tissue is cut into small fragments (~2 mm3) and transplanted subcutaneously (SC) to the syngeneic recipients (C57BL/6, 7&#8211;9 weeks old). The homografts were then surgically orthotopically transplanted onto the pancreas of new C57BL/6 mice, along with SC-implantation, which reached tumor volumes of 300&#8211;1,000 mm3 by 17 days. Only tumors of 400&#8211;600 mm3 were harvested per approved autopsy procedure and cleaned to remove the adjacent non-tumor tissues. They were dissociated per protocol using a tissue dissociator into single-cell suspensions, followed by staining with designated panels of fluorescently-labeled antibodies for various markers of different immune cells (lymphoid, myeloid and NK, DCs). The stained samples were analyzed using multi-color FACS to determine numbers of immune cells of different lineages, as well as their relative percentage within tumors. The immune profiles of orthotopic tumors were then compared to those of SC tumors. The preliminary data demonstrated significantly elevated infiltrating TILs/TAMs in tumors over the pancreas, and higher B-cell infiltration into orthotopic rather than SC tumors.

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

The experimental procedure on the immunophenotyping of murine orthotopic PDAC homografts aims at profiling the tumor immuno-microenvironment. Tumors are orthotopically implanted via surgery. Tumors of 200&#8211;600 mm3 in size were harvested and dissociated to prepare single-cell suspensions, followed by multi-immune marker FACS analysis using different fluorescently-labeled antibodies.

Orthotopic Homogref (Syngeneic) fare birincil KPC pankreas duktal adenokarsinom, akış sitometresi tarafından Immunophenotyping

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Kanser Araştırmaları

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Gelişim Biyolojisi

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological conditions including parasitic infection, inflammation, traumatic stress, graft-versus-host disease, diabetes and cancer1-7. In mice, MDSC express Mac-1 (CD11b) and Gr-1 (Ly6G and Ly6C) surface antigens7. It is important to note that MDSC are well studied in various tumor-bearing hosts where they are significantly expanded and suppress anti-tumor immune responses compared to na&iuml;ve counterparts7-10. However, depending on the pathological condition, there are different subpopulations of MDSC with distinct mechanisms and targets of suppression11,12. Therefore, effective methods to isolate viable MDSC populations are important in elucidating their different molecular mechanisms of suppression in vitro and in vivo.
Recently, the Ghansah group has reported the expansion of MDSC in a murine pancreatic cancer model. Our tumor-bearing MDSC display a loss of homeostasis and increased suppressive function compared to na&iuml;ve MDSC 13. MDSC percentages are significantly less in lymphoid compartments of na&iuml;ve vs. tumor-bearing mice. This is a major caveat, which often hinders accurate comparative analyses of these MDSC. Therefore, enriching Gr-1+ leukocytes from na&iuml;ve mice prior to Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enhances purity, viability and significantly reduces sort time. However, enrichment of Gr-1+ leukocytes from tumor-bearing mice is optional as these are in abundance for quick FACS sorting. Therefore, in this protocol, we describe a highly efficient method of immunophenotyping MDSC and enriching Gr-1+ leukocytes from spleens of na&iuml;ve mice for sorting MDSC in a timely manner. Immunocompetent C57BL/6 mice are inoculated with murine Panc02 cells subcutaneously whereas na&iuml;ve mice receive 1XPBS. Approximately 30 days post inoculation; spleens are harvested and processed into single-cell suspensions using a cell dissociation sieve. Splenocytes are then Red Blood Cell (RBC) lysed and an aliquot of these leukocytes are stained using fluorochrome-conjugated antibodies against Mac-1 and Gr-1 to immunophenotype MDSC percentages using Flow Cytometry. In a parallel experiment, whole leukocytes from na&iuml;ve mice are stained with fluorescent-conjugated Gr-1 antibodies, incubated with PE-MicroBeads and positively selected using an automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator. Next, an aliquot of Gr-1+ leukocytes are stained with Mac-1 antibodies to identify the increase in MDSC percentages using Flow Cytometry. Now, these Gr1+ enriched leukocytes are ready for FACS sorting of MDSC to be used in comparative analyses (na&iuml;ve vs. tumor- bearing) in in vivo and in vitro assays.

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

This is a rapid and comprehensive method of immunophenotyping Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) and enriching Gr-1+ leukocytes from mouse spleens. This method uses flow cytometry and AutoMACS Cell Sorting to enrich for viable Gr-1+ leukocytes prior to FACS sorting of MDSC for use in vivo and in vitro assays.

Akım Sitometri ve Otomatik Manyetik Aktif Hücre Sıralama (AutoMACS) kullanarak Naive ve Pankreas Tümör taşıyan fareler ile myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) hazırlanması

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

Tıp

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The isolation of these cells offers the possibility of studying their involvement in cardiac diseases, and, in addition, provides a useful primary cell model to investigate biological mechanisms.
Here, the method for the isolation of C-MSC from arrhythmogenic cardiomyopathy patients&#39; bioptic samples is described. The endomyocardial biopsy sampling is guided in the right ventricular areas adjacent to the scar visualized by electro-anatomical mapping. The digestion of the biopsies in collagenase and their plating on a plastic dish in culture medium to allow C-MSC growth is described. The isolated cells can be expanded in culture for several passages. To confirm their mesenchymal phenotype, the description of immuno-phenotypical characterization is provided. C-MSC are able to differentiate into several cell types like adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts: in the context of ACM, characterized by adipocyte deposits in patients&#39; hearts, the protocols for the adipogenic differentiation of C-MSC and the characterization of lipid droplet accumulation are described.

In this article, a method to isolate cardiac mesenchymal stromal cells from endomyocardial bioptic samples of arrhythmogenic cardiomyopathy patients is provided. Their characterization and the protocol to boost their adipogenic differentiation are described.

Yalıtım ve Endomyocardial Bioptic örnekleri Aritmojenik kardiyomiyopati hasta kardiyak Mezenkimal Stromal hücrelerden karakterizasyonu

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Pancreatic Tissue Dissection to Isolate Viable Single Cells

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for approximately 90% of the pancreas and includes cells that produce and secrete digestive enzymes. The digestive enzymes are produced in the pancreatic acinar cells, stored in vesicles called zymogens, and are then released into the duodenum via the pancreatic duct to initiate metabolic processes. The enzymes produced by the acinar cells can kill cells or degrade cell-free RNA. In addition, acinar cells are fragile, and common dissociation protocols result in a large number of dead cells and cell-free proteases and RNases. Therefore, one of the biggest challenges in pancreatic tissue digestion is recovering intact and viable cells, especially acinar cells. The protocol presented in this article shows a two-step method that we developed to meet this need. The protocol can be used to digest normal pancreata, pancreata that include pre-malignant lesions, or pancreatic tumors that include a large number of stromal and immune cells.

Pancreatic metaplastic cells are precursors of malignant cells that give rise to pancreatic tumors. However, isolating intact viable pancreatic cells is challenging. Here, we present an efficient method for pancreatic tissue dissociation. The cells can then be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) or for two- or three-dimensional co-culturing.

Canlı Tek Hücreleri İzole Etmek için Pankreas Doku Diseksiyonu

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

İnsan Pankreas Kanseri Xenografts Kök Hücre İzolasyonu

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Biyoloji

Fare Uzuv Kaslarından Uydu Hücre İzolasyonu ve Akış Sitometrisi Analizi

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of satellite cells from the limb muscle, a tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice were mechanically disrupted by mincing in medium supplemented with dispase and type I collagenase. Upon digestion,&#160;the homogenate was filtered through cell strainers, and cells were suspended in FACS buffer. Viability was determined with fixable viability stain, and immunostained satellite cells were isolated by FACS. Cells were lysed with Triton X-100 and released nuclei were bound to concanavalin A magnetic beads. Nucleus/bead complexes were incubated with antibodies against the transcription factor or histone modifications of interest. After washes, nucleus/bead complexes were incubated with protein A-micrococcal nuclease, and chromatin cleavage was initiated with CaCl2. After DNA extraction, libraries were generated and sequenced, and the profiles for genome-wide transcription factor binding and covalent histone modifications were obtained by bioinformatic analysis. The peaks obtained for the various histone marks showed that the binding events were specific for satellite cells. Moreover, known motif analysis unveiled that the transcription factor was bound to chromatin via its cognate response element. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in adult mice limb muscle satellite cells.

Yazar Spotlight: Fare Kas Kök Hücrelerinde Sistrom Analizi 

Presented here is an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of mouse limb muscle satellite cells adapted to the study of transcription regulation in muscle fibers by cleavage under targets and release using nuclease (CUT&amp;RUN).

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&amp;RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

Murin bağırsak mezenkiminin izolasyonu yüksek telosit verimi ile sonuçlanır

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Yalıtımlı ve Akış Sitometrisi ile Pankreas mezenkim ve Hücreler Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Orthotopic Homogref (Syngeneic) fare birincil KPC pankreas duktal adenokarsinom, akış sitometresi tarafından Immunophenotyping

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

Akım Sitometri ve Otomatik Manyetik Aktif Hücre Sıralama (AutoMACS) kullanarak Naive ve Pankreas Tümör taşıyan fareler ile myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) hazırlanması

Yalıtım ve Endomyocardial Bioptic örnekleri Aritmojenik kardiyomiyopati hasta kardiyak Mezenkimal Stromal hücrelerden karakterizasyonu

Canlı Tek Hücreleri İzole Etmek için Pankreas Doku Diseksiyonu

İnsan Pankreas Kanseri Xenografts Kök Hücre İzolasyonu

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

Murin bağırsak mezenkiminin izolasyonu yüksek telosit verimi ile sonuçlanır