The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.

실험은 텔 아비브 대학의 동물 연구위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 하였다. 마우스의 췌장 조직의 1. 분리 <ol><li> 성인 마우스의 경우 : <ol><li> 0.4 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제 P 0.1 NG / I는 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 (HBSS)에 용해 mL의 DNase의 : 소화 버퍼를 준비합니다. 갓 15 ML 원뿔 튜브에 마우스 당 버퍼의 5 mL를 준비하고 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오. </li><li> 제도적 지침에 따라 쥐를 안락사. </li><li> 췌장을 제거하는 각 마우스 해부 (교육하기를 참조 (18)를 참조하십시오) HBSS를 포함하는 배양 접시에 넣습니다. 4 개 -이 실체 현미경 하에서이 단계를 수행하고, 소화 효율을 높일 2로 조직을 절단 할 수있다. </li><li> (1.1.1에서 준비) 소화 버퍼를 포함하는 튜브에 췌장 조직을 놓습니다. 모든 마우스를 해부하고 췌장 조직 될 때까지 얼음에 튜브를 유지모은. </li><li> 나머지 마우스와 1.1.4 - 반복 1.1.2 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 태아 및 신생아 마우스의 경우 : <ol><li> 0.4 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제 P 0.1 NG / I는 HBSS에 용해 mL의 DNase의 : 소화 버퍼를 준비합니다. 15 ML 원뿔 튜브에 마우스 당 버퍼의 2 mL의 - 출생 후 하루 7 (P7) 이하에서 배아와 새끼를 들어, 갓 1.5을 준비합니다. 15 ML 원뿔 튜브에 마우스 당 버퍼 4 mL의 - P7 이상 새끼를 들어, 3을 준비합니다. 얼음에 사용할 때까지 보관하십시오. </li><li> 제도적 지침에 따라 쥐를 안락사. 배아를 들어, 자신의 어머니의 자궁에서 모든 배아를 제거하고 PBS를 포함하는 10 mm 배양 접시에 배치합니다. 한번에 한 배아를 해부. </li><li> 머리가 떨어져 조사에서 가리키는, 그 뒷면에 마우스를 놓습니다. 미세 집게를 사용하여 마우스 다이어프램 (18)까지 복강을 노출하는 중간 선에서 복부 피부와 개방을 당깁니다. </li><li> 미세 집게를 사용하면, 간 FR를 분리다시 복부 벽을 옴. 마우스 꼬리 방향으로 연속 동작으로, (간, 위, 비장, 창자, 신장, 췌장 포함) 내부 장기를 특종과 HBSS를 포함하는 배양 접시에 배치합니다. </li><li> 실체 현미경 하에서, 간 및 췌장을 노출 신장 (그림 1)를 제거합니다. 미세 핀셋을 사용하여, 비장, 마지막 위장, 십이지장, 췌장으로부터 분리하고. </li><li> (단계 1.2.1에서 제조) 소화 버퍼를 포함하는 튜브에 췌장 조직을 놓습니다. P14 이상 새끼를 들어, 소화 효율을 높이기 위해 2 개 세트로 조직을 절단. 모든 마우스를 해부하고 췌장 조직이 수집 될 때까지 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> 나머지 마우스와 1.2.6 - 반복 1.2.2 단계를 반복합니다. </li></ol></li></ol> 2. 췌장 소화 <ol><li> agitat 30 분 동안 37 ℃ 가열 블록 (분해 완충액) 췌장 조직을 포함하는 튜브를 부화700 rpm에서 이온. 15 분 후, 수동으로 3 반전 튜브를 흔들어 - 4 회 다시 가열 블록에 배치합니다. 교반 기능이없는 가열 블록을 사용하는 경우, 튜브마다 5 반전 - 10 분 : 주. 조직이 제대로 소화되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 부화하기 전에 작은 조각으로 조직을 잘라내거나 교반을 증가시킨다. </li><li> , 조직 소화를 중지 얼음에 튜브를 배치하고 각 튜브에 차가운 HBSS의 10 ㎖를 추가합니다. 4 ° C에서 튜브를 원심 분리기 5 분 동안 300 XG와 뜨는을 대기음. </li><li> 다시 서스펜션 : <ol><li> 성인 쥐 및 P14 이상 새끼를 들어, PBS 6 mL를 펠렛을 다시 일시 중지하고 새로운 15 mL의 원추형 수집 프로필렌 튜브의 상부에 배치 된 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 스트레인. 최대 세포 회복을 위해, PBS의 추가 6 mL로 일본어 튜브를 세척하고, 포집 관 상 셀 스트레이너를 통해 스트레인. </li><li> 배아와 새끼 젊은 t에 대한한족 P14는, PBS 2 mL를 펠릿을 다시 중지하고 5 ㎖의 둥근 바닥 폴리스티렌 포집 관 (FACS 튜브)의 상부에 배치 된 35 μm의 셀 스트레이너를 통해 스트레인. 최대 세포 회복을 위해, PBS를 추가로 2 ml로 일본어 튜브를 세척하고, 포집 관 상 셀 스트레이너를 통해 스트레인. </li></ol></li><li> 4 ° C에서 튜브를 원심 분리기 5 분 동안 300 XG와 뜨는을 대기음. 세포가 느슨하게 폴리스티렌 튜브에 부착 될 때, 조심스럽게 액체를 제거합니다. </li></ol> 3. 단일 셀 레이블 시스템 준비 <ol><li> 완충 제제 : FACS에 의한 세포 분리를 들어, 5 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 5 mM의 EDTA (칼슘, 염화 마그네슘)없이 PBS을 혼합하여 정렬 버퍼 준비한다. 유세포 분석을 위해, 0.05 % 아 지드 화 나트륨으로 정렬 버퍼를 보충하여 분석 버퍼를 준비한다. 두 버퍼는 최대 2 개월 동안 4-8 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 정렬 또는 아나 세포를 다시 일시 중지용해 버퍼. P8 1.5 ㎖의 이전 일개월 사이의 새끼에서 배아 및 1 ㎖의 P7 미만의 새끼에서 분리 된 각각의 췌장을 다시하면 일시 중지, 3 mL를 1 개월 이상 마우스의 나이. 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브 (FACS 튜브)의 상부에 배치 된 35 μm의 세포 여과기를 통하여 세포 스트레인. </li><li> 제어 염색 이전 단계 (총 샘플 부피의 5 % 이하)로 만든 샘플의 100 μL 분취 액을 50 꺼내 새로운 FACS 튜브로 배치; DAPI 및 형광 단백질을 포함하여 사용 된 각각의 형광을위한 튜브뿐만 아니라에 대한 흠없는 제어를 포함한다. 주 : 형광 단백질을 발현하는 세포와 트랜스 제닉 마우스를 사용하는 경우 셀 수가 제한되는 경우, 또는 염색 제어와 같은 비 - 형질 전환 된 조직을 포함한다. 형광 단백질을 발현하는 세포가 더 얼룩없이 사용하는 경우 3.8 단계로 진행합니다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 300 XG에 세포를 다운 스핀과 뜨는을 대기음. </li><li> 블록의 경우왕이 (염소 IgG를 1 μL 보충 정렬 100 μL 또는 분석 버퍼) 솔루션을 차단와 세포를 다시 일시 중지하고 얼음에 30 분 동안 품어. </li><li> 세포 표면 마커를 얼룩, 샘플 당 100 μL의 볼륨에 원하는 모든 형광 접합 된 항체를 포함하는 혼합물을 제조한다. 분류 또는 분석 완충액에 2 배 희석 된 항체를 준비 (즉, 두 필요한 농도를 얻을 수있는 항체를 희석 1의 최종 희석 경우 : 100 : 200이 바람직하고, 1 항체 희석). 블로킹 용액을 세척없이, 200 μL의 최종 염색 볼륨을 달성하기 위해 샘플 셀에 상기 혼합물을 100 μL를 추가한다. 얼음에 30 ~ 60 분 동안과 어둠 속에서 품어. </li><li> 하나의 (염색 제어)를 사용하는 항체를 포함하는 추가 튜브를 준비, 분석 또는 정렬 매개 변수를 (단계 4.3 및 5.2 참조)를 설정합니다. (단계 3.6에 설명 된대로) 분류 또는 분석 버퍼에 2 배 항체 희석을 준비합니다. 확인시를 포함해야사용 된 각각의 형광체뿐만 아니라 흠 제어 ngle 염색 제어 희석. 블로킹 용액을 세척없이, 200 μL의 최종 염색 볼륨을 달성하기 위해 (단계 3.3에서 제조)를 세포에 항체 혼합물의 100 μL를 추가한다. 얼음과 어둠 속에서 60 분 - 30 품어. </li><li> 분석 각각의 튜브를 채우거나 4 mL의의 최대 볼륨으로 버퍼를 정렬하여 씻으십시오. (단계 3.2에 설명 된대로) 선택적으로, 35 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 재 - 변형. </li><li> 4 ° C에서 5 분 300 XG에 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. </li><li> 분석 또는 버퍼를 정렬에 샘플을 다시 일시 중지합니다. 2 ㎖의 이전 3 개월 및 3가 3 개월 용액보다 오래된 마우스에서 - 1, 1 mL의 1 개월 미만의 새끼에서 500 μL의 배아에서 분리 된 세포를 다시하면 일시 중지합니다. 오염 제어 장치는 버퍼 300 μL에 재현 탁 될 수있다. </li><li> 200 ng의 추가 / DAPI mL의 죽은 세포를 식별하는 세포를 재현 탁합니다. 확인 튜브 공동을 포함해야사이토 설정에 대한 DAPI없이 흠없는 세포를 ntaining. 셀 정렬 (4 단계) 또는 분석 (5 단계)로 넘어갑니다. </li></ol> 4. 셀 정렬 <ol><li> 준비: <ol><li> 된 RNase와 RNA 추출 전에 코트 1.5 mL를 수집 튜브를 정렬 셀 억제제 즉시 정렬 전에. 이를 위하여, 멸균 1.5 ㎖의 수집 튜브에 0.01 U / ㎖의 RNase 억제제를 함유하는 완충액을 선별 1 mL를 넣어. 5 분 후, 튜브를 와동 액체를 제거한다. </li><li> 세포 배양에 앞서 정렬 셀 멸균 배양 배지 중 3 mL의 추가 멸균 15 ㎖의 수집 튜브로 (둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 20 % FBS, 1 % L 글루타민, 페니실린 - 스트렙토 마이신 1 %) . </li></ol></li><li> FACS 분류기에 튜브를 넣기 전에, 소용돌이는 간단히 세포를 다시 일시 중지합니다. 얼음에 남아있는 튜브를 유지합니다. </li><li> 예 (분류 파라미터를 결정하기 위해 염색 통제를 분석하여 시작 </em&gt; 전압 및 보상) 및 정렬 게이트 (예를 들어, 전체 세포 인구, 라이브 DAPI 음성 세포 및 세포 집단)이 분류된다. </li><li> 정렬 매개 변수 및 게이트가 설정되면, 샘플을로드하고 수집 튜브에 정렬 셀을 시작합니다. 참고 : 정렬 조건은 악기에 크게 의존한다. 우리는 100 ㎛의 노즐 폭 23.1 psi의 압력 및 5의 최대 정렬 속도를 사용한다. </li><li> RNA 추출하거나 정렬 세포의 배양을 진행합니다. 참고 : RNA 추출의 경우, 5 분 동안 2,000 XG에서 세포를 원심 분리 및 표준 추출 프로토콜을 계속하기 전에 물기를 제거합니다. 세포를 비 - 멸균 조건으로 정렬 한 경우, 세포 배양, 배양 배지로 튜브를 작성 및 오염을 최소화하기 위해 배양 이전 7 분 동안 300 XG 그것을 원심 회 씻는다. </li></ol> 유동 세포 계측법 5. 세포 분석 <ol><li> 리터 전사이토, 소용돌이에 각 튜브를 oading하면 간단히 세포를 다시 일시 중지합니다. 얼음에 남아있는 튜브를 유지합니다. </li><li> 분석 파라미터 (예를 들면, 전압 및 보상)를 결정하기 위해 염색 및 단일 염색 된 샘플을 분석하여 시작한다. </li><li> 분석 매개 변수가 설정되면, 오염 제어를 포함하여, 각 샘플을 로딩하고, 그 결과를 기록한다. 분석 소프트웨어 유세포 분석기를 사용하여 수득 된 결과를 분석한다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

여기서는 분리하고 췌장 세포의 미세 환경을 분석하는 방법을 설명한다. 이 방법은 배아 및 성체 췌장 조직으로부터 간엽 세포를 분리하는데 사용될 수있다. 또한, 성공적 성인 및 신생아 췌장 5 (17)으로부터 내피 세포를 분리하기 위해 프로토콜을 사용 하였다. 그러나, (다른 프로토콜 (24)을 참조하는 (18), 23에 설명되어) 췌장 상피 세포의 재생 가능한 단일 세포 현탁액을 수득하기에 적합하지 않을 수있다. 이 방법에있어서, 형광 표지 된 세포를 사용하여, 어느 형광 단백질을 발현 또는 표면 마커에 대한 면역 염색, FACS 그래피 또는 유동 세포 계측법에 의해 분석 될 수있다. RNA는 유전자 발현 패턴 프로파일 정제 된 세포로부터 추출 될 수있다. 대안 적으로, 정제 된 세포는 후속 프로테옴 분석 세포주를 확립 배양 할 수있다. 이 방법은 요소 (E)의 특성화를 가능하게그 기관 형성, 생리학 및 병태 생리를 지배하는 췌장의 미세 환경에 의해 xpressed. 췌장 중간 엽는 전구체 및 분화 세포 5, 9의 증식을 촉진하여 조직의 기관 형성을 지원합니다. 이러한 세포는 인간 배아 줄기 세포의 확장을 지원하는 것으로 나타났다 (hESC의)는 췌장 전구 세포를 17, 25, 26 - 유래. 따라서, 배아 중배엽 요소의 ID를 서술하면 hESCs는 당뇨병에 대한 잠재적 치료제로서 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)에서 인슐린 - 생산 베타 세포를 생성하기 위해 현재의 활동을 촉진한다. 마우스 유전자 연구는 췌장 개발의 초기 단계에서 췌장 상피 확장을 촉진하는 간엽에 의해 생성되는 이러한 Fgf10 같은 성장 인자의 식별을 허용3 구. 배아 간엽 표현 추가 요소를 식별하기위한 목적으로, 우리는 레이저 캡처 미세 절제를 사용하여 이러한 세포를 격리 그들의 RNA를 추출하고, 유전자 발현 분석 (26)을 수행 하였다. 그러나, 노동 집약적 인 것에 더하여,이 방법은 종래 주변 간엽 (즉, E12.5)에 상피의 분지에 발달 단계에 사용을 제한하고 그 형태 적 특징에 기초하여 셀 식별에 의존한다. 나중 개발 단계에서 중간 엽 세포를 특성화하기 위해, 우리는 여기서 5, 17에 기재된 방법을 채용. 우리는 신생아 췌장 중간 엽 (5)에 의해 표면 마커의 발현을 분석하기 위해이 방법을 사용했다. 또한, 중간 엽 세포 Nkx3.2 -Cre의 태아 및 신생아의 췌장 조직에서 분리 하였다 R26-EYFP 쥐에 기초그 형광이 마우스 라인 라벨링 및 세포주 (17)을 설정할 배양 하였다. hESC의 유래의 췌장 전구 세포 (17)을 촉진하는 기능 간엽 췌장 분비 인자의 동정 허용 이들 세포의 프로테옴 분석. 우리는 또한 RNA 추출 및 유전자 발현 해석 17 성인 췌장 조직으로부터 간엽 세포를 정제하기 위해 세포 분리 방법을 사용 하였다. 따라서,이 방법은 췌장 세포의 개발을 지원하는 능력, 췌장 간엽 의해 발현 유전자와 단백질을 식별하기 위해 사용될 수있다. 췌장 중배엽 세포는 또한 췌장 종양 발생에 중요한 역할을하는 것으로 하였다. PDAC은 섬유 아세포, 면역 세포로 이루어진 섬유 아세포 풍부한 기질 결합 조직의 형성과 ECM (27)을 특징으로한다. 기질은 많은 발전을 촉진하는 것으로 생각 동안암 유형은 그것의 진행 PDAC (15, 16), (28)을 억제하는 것으로 하였다. 이는 췌장 기질의 구성 요소가 종양을 억제 인자를 분비하는 것이 좋습니다. 또한, 간질 세포 조성물뿐만 아니라, 세포의 표현형의 변화는 상피 세포 (15, 16), (28)에 미치는 영향을 기초 할 수있다. 여기에 기재된 방법에 따라서, 건강한 췌장 조직에 비해 PDAC 기질을 구성하는 다양한 세포 유형 특성화 지원할 수있다. 그것은 또한 다른 간질 세포 유형의 정제 PDAC 진행 중에 그 유전자 발현 프로파일의 전위의 변화를 특성화하도록 허용한다. 그러나, 종양 27 일 동안 췌장 ECM 조성의 변화 등을 포함 되어온 같은 조직 소화 파라미터 조정콜라게나하는 ional 종류 또는 배양 시간을 증가 요구 될 수있다.

에너지 항상성과 포유 동물에서 음식을 소화 적절한 췌장 기능에 따라 달라집니다. 외분비 및 내분비 : 성인 췌장은 두 가지 세포 구획으로 구성되어 있습니다. 생산 및 분비하는 소화 효소 및 소화관에 이들 효소를 운반 덕트 세포를 췌장의 총 질량 (1)의 80 % 이상을 포함 선포 세포를 포함 외분비 세포. 인슐린 - 생산 베타 세포의 제조 및 글루카곤 알파 세포를 포함하는 내분비 세포는 외분비 조직에 삽입 및 혈당이 조절 호르몬을 분비된다 랑게르한스섬이 구성된다. 췌장 세포가 고도로 규제, 다단계 과정 3을 통해 차별화 된 운명을 획득. 증거는 신경 세포, 내피 세포 및 중간 엽 세포에 의해 제공 외적 단서가 t의 췌장 세포 분화 및 증식을 유도 제안그 배아 3, 4, 5. 일 예는 이른 췌장 전구체 (6)의 사양 대동맥의 요구 사항이다. 나중에 개발, 내피 세포는 모두 췌장 내분비와 외분비 세포의 발달에서 중요한 역할을하는 베타 세포 분화 4, 6, 7을 촉진하기 위해 도시 하였다. 간엽 세포는 주로 성장 인자 Fgf10 (8, 9)의 분비를 통해 생존과 공통 췌장 전구 세포의 확장을 지원하기 위해 도시 하였다. 우리는 또한이 세포는 배아 췌장 5 내분비와 외분비 전구체의 증식뿐 아니라의 (소엽 및 베타 세포 포함)에 분화 세포를 지원하는 것을 보여준다. 최근, 중간 엽 세포는 더 있었다내분비 세포 분화 (10)를 규제하는 도시. 성인에있어서, 베타 세포 기능 및 질량 면역 신경 세포, 내피 세포,뿐만 아니라 혈관 주위 세포 11,12,13 포함한 미세 세포에 의존하는 것으로 나타났다. 부상하는 동안, 내피 세포는 베타 세포 복제 (13)을 촉진하기 위해 췌장에 면역 세포를 모집 것으로 나타났다. 내피 세포는 또한 인슐린 발현과 베타 세포 기능 (14)을지지하는 세포 외 기질 (ECM) 성분을 생성하기 위해 도시 하였다. 우리는 최근 베타 세포 기능 11 섬 혈관 주위 세포의 요구 사항을 보여 주었다. 마지막으로, 췌장 실질 세포는 췌장 선암 도관 (PDAC) (15, 16)의 진행을 조절하는 것으로 나타났다. 그러나, 아이디췌장 개발, 기능 및 종양 안내 외인성 큐 엔티티는 대부분 알려져 있지 않다. 췌장 미세 세포에 의해 제공되는 신호를 식별하는 것은 이들 세포에서 발현되는 유전자와 단백질의 특성을 필요로한다. 이러한 및 / 또는 세포주를 확립에서 유전자 발현 및 단백질 체학 분석을 수행하기 위해, 췌장에서 이들 세포를 분리에 달려있다. 여기서는 형광 단백질을 발현 immunofluorescently 표지 된 세포 또는 세포 중의 정렬 조직 효소 분해 형광 - 활성화 된 세포 (FACS)를 사용하여 췌장 미세의 중간 엽 세포를 분리하는 방법을 제안한다. 이 프로토콜은 성공적 배아 신생아 및 성인 췌장 (5), (17)의 중간 엽 세포를 분리 및 옐로우 형광 단백질 (YFP) 발현을 분석 하였다.

<table><tbody><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche</td><td>11213865001</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td>The effective units should be at least 2,000 unitz/mL protein</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt solution (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>01-862-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Goat IgG serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>RNAse inhibitor</td><td>Invitrogen</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride</td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72 690</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Round Bottom Polystyrene 5 mL tube</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>FACS tube. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands</td></tr><tr><td>5 mL tube with 35 &amp;mu;m cell strainer Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>FACS tube</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m cell strainer&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>Heating block with agitation&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>ThermoMixer C</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ThermoFisher</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td>Steromicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td></td></tr><tr><td>Cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria IIu</td><td></td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>Gallios&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating and analyzing cells of the pancreas mesenchyme by flow cytometry

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.

췌장 중간 엽는 개발 및 성인기 필요합니다. 여기에 기재된 방법은 배아 신생아 및 성인 췌장에서 중간 엽 세포를 분리 할 수있다. 중간 엽 세포,하지만 다른 종류의 세포는 Nkx3.2 -Cre의 췌장에서 노란색 형광 단백질 (YFP)을 표현; R26R -YFP 마우스 5, 11, 17, 19. 개발하는 동안, (또한 BapX1라고도 함) Nkx3.2 배아 췌장, 위, 창자 및 간엽뿐만 아니라, 골격 somites 19, 20, 21의 서브 세트에 의해 표현된다. 이 유전자는, E9.5을 5 Nkx3.2 -Cre의 제어에 의해 유전자 발현을 허용 E11.5까지 E9.5에서 췌장에서 발현되었다 간엽 </sup&gt; 19, 20. 이 표시에 기초하여, 세포를 유동 세포 계측법을 사용하여 벌크 췌장 조직으로부터 정제 될 수있다. 그림 2는 여기에 설명 된대로 절연, 배아 신생아, 성인 췌장 조직에서 단일 세포의 유동 세포 계측법 분석을 보여줍니다. 비 형질 전환 췌장 조직 형광 세포를 포함하지 않은 반면, Nkx3.2 -Cre; R26R는 -YFP 분석 된 모든 연령대에서 췌장 조직은 별개의 YFP 표지 세포 인구 (; 게이트로 표시된 그림 2)가 포함되어 있습니다. 여기에 설명 된 방법에 따라서, 형광 단백질을 발현하는 세포는 정제되거나 또는 추가적인 면역없이 유동 세포 계측법에 의해 분석 될 수있다. 도 3a에 도시 된 바와 같이 예를 들어, 형광 표지에 기초하여 분류 한 후, 중간 엽 세포, (적어도 다섯 계대) 세포주를 확립 배양 할 수있다. 참고 t<html> 그는 중간 엽 세포에 전형적인 배양 된 세포의 형태를 fibrocytic. 또한,이 시스템은 정렬 된 세포의 유전자 발현을 분석 하였다. 이를 위해, RNA는 cDNA를 합성하기 위해 정렬 된 중간 엽 세포로부터 추출하고, 유전자 발현 수준은 qPCR에 의해 분석 하였다. 이러한 분석은 정렬 된 세포가 팬 - 중간 엽 마커 멘틴 (그림 3B)를 표현하는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 췌장 세포의 표면 마커의 발현은 유동 세포 계측법으로 분석 될 수있다. 예를 들어, 우리는 Nkx3.2 -Cre의 췌장 조직으로부터 세포를 격리; R26R -YFP 여기서 설명 및 섬유 아세포 (22)에 의해 표현되는 것으로보고되었다 CD9 당 단백질 세포 표면로 염색 방법을 사용하여 성인 마우스. 도 3c에 도시 된 바와 같이, 모든 Nkx3.2 -Cre 세포를 형광 표지; R26R -YFP 췌장은 CD9을 표현한다. tp_upload / 55344 / 55344fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 : 배아 및 신생아 췌장 조직. E15.5 태아 (A) 및 P4 강아지 (B)의 위, 비장, 소장, 췌장, 포함한 절연 전체 위장관. 췌장 조직이 청색 선으로 경계가된다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55344/55344fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig2.jpg" /> 그림 2 : 중간 엽 세포를 형광 Nkx3.2 -Cre에 표시되어 있습니다; R26R -YFP 췌장 조직. 비 형질 전환 (패널 왼쪽)와 Nkx3.2 -Cre에서 분리 된 췌장 세포의 유동 세포 계측법 분석; R26R -YFP 다양한 연령대에서 유전자 변형 (오른쪽 패널) 마우스 : 배아 (A), 신생아 (B), 및 광고ULT (C). 세포는 측면 분산 (y 축)과 노란색 형광 (x 축)에 대해 분석 하였다. ( &quot;D&quot;로 표시) 게이트는 비 - 트랜스 제닉 대조군 트랜스 제닉 마우스에서 YFP + 세포 집단의 존재하지만을 나타냈다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55344/55344fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig3.jpg" /> 그림 3 : 격리 된 췌장 세포의 분석. Nkx3.2 -Cre의 췌장 조직에서 분류 (A) 셀; R26R -YFP (도 2b에 설명 된 바와 같이) 신생아 마우스 세포주를 확립 배양 하였다. (우측과 좌측 패널 녹색)과 위상차 배양 된 세포는 형광을 위해 몇 군데 있었다 (회색, 오른쪽 패널). (B) Vimentin1 (Vim1)를 보여주는 바도Nkx3.2 -Cre의 췌장 조직에서 YFP + -sorted 세포의 발현 수준; 정렬되지 않은 췌장 조직 (블랙)에 비해, R26R -YFP 성인 쥐 (녹색도 1C에 기술 된 바와 같이). RNA를 추출하고, 유전자 발현을 qPCR에 의해 분석 하였다; 표현은 시클로 필린에 정상화되었다. N = 4 *** P &lt;0.001. 데이터는 SD ± 평균을 나타냅니다. (C) Nkx3.2 -Cre에서 분산 된 췌장 세포의 흐름 - 세포 계측법 분석; R26R -YFP 성인 쥐의 면역 염색 된 알로 피코시 아닌 (APC)와 안티 CD9 항체를 π 공역 계와 APC (y 축)과 노란색 형광 (x 축)에 대해 분석 하였다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55344/55344fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

여기서, 우리는 중간 엽 세포의 분리에 초점 배아 신생아 및 성인 마우스 조직에서 췌장 미세 세포의 분리 방법을 설명한다. 이 방법은 췌장 개발, 기능 및 종양 형성을 조절하는 외부 신호를 명료하게하기 위하여 세포 유전자 발현 및 단백질 분비를 프로파일 링 할 수있다.

분리 및 유동 세포 계측법에 의해 췌장 중간 엽 세포 분석

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.1K 조회수.  Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University.  여기서, 우리는 중간 엽 세포의 분리에 초점 배아 신생아 및 성인 마우스 조직에서 췌장 미세 세포의 분리 방법을 설명한다. 이 방법은 췌장 개발, 기능 및 종양 형성을 조절하는 외부 신호를 명료하게하기 위하여 세포 유전자 발현 및 단백질 분비를 프로파일 링 할 수있다. 

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Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly its immune-components, is vital to the prognosis and prediction of treatment outcomes, especially those of immunotherapy. TME immune-components are composed of different subsets of tumor-infiltrating immune cells assessable by multi-color FACS. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is among the deadliest malignances lacking good treatment options, thus an urgent and unmet medical need. One important reason for its non-responsiveness to various therapies (chemo-, targeted, I/O) has been its abundant TME, consisting of fibroblasts and leukocytes that protect tumor cells from these therapies. Orthotopically implanted PDAC is believed to more accurately recapture the TME of human pancreatic cancers than conventional subcutaneous (SC) models.
Homograft tumors (KPC) are transplants of mouse spontaneous PDAC originating from genetically engineered KPC-mice (KrasG12D/+/P53-/-/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). The primary tumor tissue is cut into small fragments (~2 mm3) and transplanted subcutaneously (SC) to the syngeneic recipients (C57BL/6, 7&#8211;9 weeks old). The homografts were then surgically orthotopically transplanted onto the pancreas of new C57BL/6 mice, along with SC-implantation, which reached tumor volumes of 300&#8211;1,000 mm3 by 17 days. Only tumors of 400&#8211;600 mm3 were harvested per approved autopsy procedure and cleaned to remove the adjacent non-tumor tissues. They were dissociated per protocol using a tissue dissociator into single-cell suspensions, followed by staining with designated panels of fluorescently-labeled antibodies for various markers of different immune cells (lymphoid, myeloid and NK, DCs). The stained samples were analyzed using multi-color FACS to determine numbers of immune cells of different lineages, as well as their relative percentage within tumors. The immune profiles of orthotopic tumors were then compared to those of SC tumors. The preliminary data demonstrated significantly elevated infiltrating TILs/TAMs in tumors over the pancreas, and higher B-cell infiltration into orthotopic rather than SC tumors.

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

The experimental procedure on the immunophenotyping of murine orthotopic PDAC homografts aims at profiling the tumor immuno-microenvironment. Tumors are orthotopically implanted via surgery. Tumors of 200&#8211;600 mm3 in size were harvested and dissociated to prepare single-cell suspensions, followed by multi-immune marker FACS analysis using different fluorescently-labeled antibodies.

Immunophenotyping Orthotopic Homograft (Syngeneic) Murine 기본 KPC 췌 장 Ductal 선 암의 Cytometry로의

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

연구

암 연구학

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

발생학

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological conditions including parasitic infection, inflammation, traumatic stress, graft-versus-host disease, diabetes and cancer1-7. In mice, MDSC express Mac-1 (CD11b) and Gr-1 (Ly6G and Ly6C) surface antigens7. It is important to note that MDSC are well studied in various tumor-bearing hosts where they are significantly expanded and suppress anti-tumor immune responses compared to na&iuml;ve counterparts7-10. However, depending on the pathological condition, there are different subpopulations of MDSC with distinct mechanisms and targets of suppression11,12. Therefore, effective methods to isolate viable MDSC populations are important in elucidating their different molecular mechanisms of suppression in vitro and in vivo.
Recently, the Ghansah group has reported the expansion of MDSC in a murine pancreatic cancer model. Our tumor-bearing MDSC display a loss of homeostasis and increased suppressive function compared to na&iuml;ve MDSC 13. MDSC percentages are significantly less in lymphoid compartments of na&iuml;ve vs. tumor-bearing mice. This is a major caveat, which often hinders accurate comparative analyses of these MDSC. Therefore, enriching Gr-1+ leukocytes from na&iuml;ve mice prior to Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enhances purity, viability and significantly reduces sort time. However, enrichment of Gr-1+ leukocytes from tumor-bearing mice is optional as these are in abundance for quick FACS sorting. Therefore, in this protocol, we describe a highly efficient method of immunophenotyping MDSC and enriching Gr-1+ leukocytes from spleens of na&iuml;ve mice for sorting MDSC in a timely manner. Immunocompetent C57BL/6 mice are inoculated with murine Panc02 cells subcutaneously whereas na&iuml;ve mice receive 1XPBS. Approximately 30 days post inoculation; spleens are harvested and processed into single-cell suspensions using a cell dissociation sieve. Splenocytes are then Red Blood Cell (RBC) lysed and an aliquot of these leukocytes are stained using fluorochrome-conjugated antibodies against Mac-1 and Gr-1 to immunophenotype MDSC percentages using Flow Cytometry. In a parallel experiment, whole leukocytes from na&iuml;ve mice are stained with fluorescent-conjugated Gr-1 antibodies, incubated with PE-MicroBeads and positively selected using an automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator. Next, an aliquot of Gr-1+ leukocytes are stained with Mac-1 antibodies to identify the increase in MDSC percentages using Flow Cytometry. Now, these Gr1+ enriched leukocytes are ready for FACS sorting of MDSC to be used in comparative analyses (na&iuml;ve vs. tumor- bearing) in in vivo and in vitro assays.

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

This is a rapid and comprehensive method of immunophenotyping Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) and enriching Gr-1+ leukocytes from mouse spleens. This method uses flow cytometry and AutoMACS Cell Sorting to enrich for viable Gr-1+ leukocytes prior to FACS sorting of MDSC for use in vivo and in vitro assays.

유동세포계측법 및 자동화된 마그네틱 활성화 셀 정렬 (AutoMACS)를 사용 나이브 및 췌장 종양 베어링 마우스에서 골수양 파생 억제 세포 (MDSC)의 작성

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

의학

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The isolation of these cells offers the possibility of studying their involvement in cardiac diseases, and, in addition, provides a useful primary cell model to investigate biological mechanisms.
Here, the method for the isolation of C-MSC from arrhythmogenic cardiomyopathy patients&#39; bioptic samples is described. The endomyocardial biopsy sampling is guided in the right ventricular areas adjacent to the scar visualized by electro-anatomical mapping. The digestion of the biopsies in collagenase and their plating on a plastic dish in culture medium to allow C-MSC growth is described. The isolated cells can be expanded in culture for several passages. To confirm their mesenchymal phenotype, the description of immuno-phenotypical characterization is provided. C-MSC are able to differentiate into several cell types like adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts: in the context of ACM, characterized by adipocyte deposits in patients&#39; hearts, the protocols for the adipogenic differentiation of C-MSC and the characterization of lipid droplet accumulation are described.

In this article, a method to isolate cardiac mesenchymal stromal cells from endomyocardial bioptic samples of arrhythmogenic cardiomyopathy patients is provided. Their characterization and the protocol to boost their adipogenic differentiation are described.

절연 및 Endomyocardial Bioptic 샘플의 Arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 중간 엽 기질 세포의 특성

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Pancreatic Tissue Dissection to Isolate Viable Single Cells

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for approximately 90% of the pancreas and includes cells that produce and secrete digestive enzymes. The digestive enzymes are produced in the pancreatic acinar cells, stored in vesicles called zymogens, and are then released into the duodenum via the pancreatic duct to initiate metabolic processes. The enzymes produced by the acinar cells can kill cells or degrade cell-free RNA. In addition, acinar cells are fragile, and common dissociation protocols result in a large number of dead cells and cell-free proteases and RNases. Therefore, one of the biggest challenges in pancreatic tissue digestion is recovering intact and viable cells, especially acinar cells. The protocol presented in this article shows a two-step method that we developed to meet this need. The protocol can be used to digest normal pancreata, pancreata that include pre-malignant lesions, or pancreatic tumors that include a large number of stromal and immune cells.

Pancreatic metaplastic cells are precursors of malignant cells that give rise to pancreatic tumors. However, isolating intact viable pancreatic cells is challenging. Here, we present an efficient method for pancreatic tissue dissociation. The cells can then be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) or for two- or three-dimensional co-culturing.

생존 가능한 단일 세포를 분리하기 위한 췌장 조직 해부

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

인간 췌장암의 Xenografts에서 줄기 세포의 분리

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

생물학

Satellite Cell from Mouse Limb Muscles and Flow Cytometry Analysis (마우스 사지 근육에서 위성 세포 분리 및 유세포 분석)

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of satellite cells from the limb muscle, a tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice were mechanically disrupted by mincing in medium supplemented with dispase and type I collagenase. Upon digestion,&#160;the homogenate was filtered through cell strainers, and cells were suspended in FACS buffer. Viability was determined with fixable viability stain, and immunostained satellite cells were isolated by FACS. Cells were lysed with Triton X-100 and released nuclei were bound to concanavalin A magnetic beads. Nucleus/bead complexes were incubated with antibodies against the transcription factor or histone modifications of interest. After washes, nucleus/bead complexes were incubated with protein A-micrococcal nuclease, and chromatin cleavage was initiated with CaCl2. After DNA extraction, libraries were generated and sequenced, and the profiles for genome-wide transcription factor binding and covalent histone modifications were obtained by bioinformatic analysis. The peaks obtained for the various histone marks showed that the binding events were specific for satellite cells. Moreover, known motif analysis unveiled that the transcription factor was bound to chromatin via its cognate response element. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in adult mice limb muscle satellite cells.

저자 스포트라이트: 마우스 근육 줄기 세포의 Cistrome 분석 

Presented here is an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of mouse limb muscle satellite cells adapted to the study of transcription regulation in muscle fibers by cleavage under targets and release using nuclease (CUT&amp;RUN).

FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT&amp;RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

쥐 장 중간엽의 분리로 텔로세포의 높은 수율

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

분리 및 유동 세포 계측법에 의해 췌장 중간 엽 세포 분석

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Immunophenotyping Orthotopic Homograft (Syngeneic) Murine 기본 KPC 췌 장 Ductal 선 암의 Cytometry로의

체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

유동세포계측법 및 자동화된 마그네틱 활성화 셀 정렬 (AutoMACS)를 사용 나이브 및 췌장 종양 베어링 마우스에서 골수양 파생 억제 세포 (MDSC)의 작성

절연 및 Endomyocardial Bioptic 샘플의 Arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 중간 엽 기질 세포의 특성

생존 가능한 단일 세포를 분리하기 위한 췌장 조직 해부

인간 췌장암의 Xenografts에서 줄기 세포의 분리

FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT&RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜

FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT&RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜

FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT&RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜

쥐 장 중간엽의 분리로 텔로세포의 높은 수율