The authors would like to thank Autumn Peterson for assistance with mouse photography, Daniel Thoresen for assistance with mice, and Drs. Nicole Ward and Abdelmadjid Belkadi for assistance with surgical denervation. These studies were supported by funding from the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (grants R00AR059796 and R01AR065409); the University of Michigan Department of Dermatology; the Biological Sciences Scholars Program; the Center for Organogenesis; the University of Michigan Comprehensive Cancer Center; and the John S. and Suzanne C. Munn Cancer Fund. S.C.P. was supported by funding from the National Institute of General Medical Sciences (grant T32 GM007315). This work was also supported by the NIH Intramural Research Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute.

כל הנהלים המתואר בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם לתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת מישיגן היחידה לרפואת חיות מעבדה. 1. להשרות שחלוף עכברים הערה: Gli1 TM3 (cre / ERT2) Alj / J זן העכבר (Gli1-CreERT2) 13 מאפשר מיקוד של שחלוף הנגרמת טמוקסיפן כדי TD epithelia. לחצות זן זה עם B6.129S4-GT (ROSA) 26Sor tm1Sor / עכברים הכתב J (LacZ) 22 כדי ליצור Gli1; ​​חיות LacZ לדמיין תאים TD ידי כל הר מכתים להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון טמוקסיפן לריכוז של 12.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בשמן תירס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 1.5 מ&quot;ל, להוסיף עד 20 מ&quot;ג טמוקסיפן גבישי, ולאחר מכן 1 מ&quot;ל של שמן תירס. בתוקף ידביק את הצינור כדי מערבל מערבולת, מערבולת ברציפות על ההגדרה הגבוהה ביותר ב RT עד טמוקסיפן נמס לגמרי (2-4 שעות), כפיאושר על ידי בחינת הצינור תחת מיקרוסקופ לנתח עבור בהעדר חלקיקי טמוקסיפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון צינור 15 מ&quot;ל ו לדלל את טמוקסיפן לריכוז סופי של 12.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​עם שמן תירס נוספים. מערבב על ידי vortexing הפתרון הצמיג עבור 30 שניות נוספות. אחסן את הפתרון הזה עד 1 שבוע ב 4 ° C בחושך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את הפתרון טמוקסיפן intraperitoneally לתוך Gli1; ​​עכברים LacZ, בהיקף של 200 μl לכל 20 גרם של משקל גוף העכבר עבור מנה טמוקסיפן יעיל של 2.5 מ&quot;ג משקל העכבר 20 גר &#39;. </li></ol> 2. ביופסיות עור קציר הערה: בהתאם הניסוי, ביופסיות עור הקציר כמה ימים עד שבועות לאחר אינדוקציה טמוקסיפן. לכל הניתוחים, בצע פרוטוקולים סטנדרטיים לניתוח מכרסם, כולל שימוש בכפפות סטריליות, לובש נטו מסכה או שיער כירורגית, ומכסה את החיה עם וילון ניתוח סטרילי במהלך ההליך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10x ההרדמה המניות על ידי ערבוב 90 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קטמין ו -6.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​xylazine במים. לדלל זה פתרון המניות 01:10 לתוך PBS סטרילי רק לפני השימוש, ולאחסן ב RT בחושך במשך עד 8 חודשים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להרדים עכברי משאיפת isoflurane, החל ריכוז גז של 4% עם חמצן כדי להרדים את החיה באופן מלא, ולאחר מכן לאחר מכן הורדה זה ל 1-2% למשך ההליך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את חומר ההרדמה intraperitoneally במינון של 200 μl לכל משקל גוף 20 גרם העכבר. בדוק כי בעל החיים הגיעו המטוס התקין של הרגעה ידי assay קמצוץ בוהן, ולאשר כי לב ושיעורי נשימה הם נורמליות (כ 600 פעימות ו -160 נשימות לדקה, בהתאמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש גוזז חשמלי להסרת השיער מהאתר של ביופסיה על הגב בחזרה העור, נזהר שלא ניק או ניזק לעור הבסיסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את האתר כירורגית על ידי מנגב את הגילוחתחום ד בכיוון הקדמי אל האחורי באמצעות מגבונים בבטאדין ואלכוהול. ודא כי כל קטעי השיער יוסרו מהאתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התווה את אתר הביופסיה באמצעות טוש שחור, למקם את החיה על כרית חימום באזור כירורגית ספטית, ומכסי וילון ניתוח סטרילי (למטרות הדגמה, וילון סטרילי הושמט כדי להגדיל את נראות). הערה: כדי להשיג סעיפים אורכים של זקיקי שיער, בקצה הארוך יותר של הביופסיה (לקצה להיות מחולק עבור היסטולוגיה, ~ 1 סנטימטר) צריך לרוץ לכיוון קדמי-אחורי (במקביל לכיוון של זקיקי שיער), parasagital כדי קו האמצע הגבה (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אזמל # 11 סטרילי לבצע כריתה בעובי מלאה לאורך האזור המסומן מבלי לפגוע fascia שהרירי הבסיסי. הערה: רקמת העור נכרת כולל את האפידרמיס, הדרמיס, שומן תת עורי ו מִרפָּד carnosus. הדימום הוא בדרך כלל מינימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרדד tהוא נכרת מדגם עור על מגבת נייר יבשה, הדרמיס בצד למטה, לקצץ משם מגבת נייר העודפת, ולאחסן את המדגם בקור PBS עד שעה 1 אם מדגמים אחרים צריכים להיאסף. כאשר מוכן, המשך צעדים 3.1 או 3.2 לעבד דגימות היסטולוגיה, או שלב 4 עבור מכתים כל הר β-galactosidase (LacZ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר לסגור את אתר הביופסיה באמצעות 6-0 תפרי ניילון, דפוס קטע פשוט במרווחים בערך זה מזה 3 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תחזרו עכברים שעברו ניתוח לתוך באותו הכלוב כמו בעלי חיים אחרים עד לאחר החלמה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג חיות מיד לאחר הניתוח עד שהם להכרתו, וגם על בסיס יומי עד אזור הניתוח הגליד, בדרך כלל תוך שבוע 1. השתמש במשככי כאבים על פי הנחיות לטיפול ולשימוש חיה מוסדיות המיועדות אם עכברים להפגין סימנים של כאב או מצוקה. סר תפרים בתוך 7-10 ימים לאחר ניתוח. הערה: במידת הצורך, להכין פתרון כאבים על ידי דילול carprofen (50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​solut המניותיון) 1: 100 במים סטריליים. להזריק את תת עורי פתרון בין השכמות ליד בעורפו, במינון של 200 μl לכל משקל גוף 20 גרם (5 מ&quot;ג / משקל גוף העכבר ק&quot;ג). </li></ol> 3. דוגמאות תהליך עבור היסטולוגיה הערה: כדי לתקן ולעבד את רקמת נכרת, השתמש באחת השיטות שלהלן, בהתאם ליישום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור דגימות היסטולוגית-מוטבע פרפין, לתקן את העור בפורמלין 3.7% ב PBS O / N ב RT ולאחסן באתנול 70% לתקופה של עד 2 שבועות. הסר את מגבת נייר לפני להטבעה לתוך פרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפקת דגימות היסטולוגית קפוא, להטביע את הרקמה paraformaldehyde 4% קר PBS ולנער בעדינות במשך שעה 1. הסר את הפתרון ולשטוף את המדגם עם 3 שינויים של PBS, בערך 5 דקות כל אחד. לאחר מכן, להטביע את המדגם ב סוכרוז 30% ב PBS cryoprotect הרקמה ( &quot;טביעת סוכרוז&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם רעד O / N עדין על 4 מעלות צלזיוס. למחרת, להסיר את גרר נייראל לקצץ משם רקמת שומן עודף מצד העור של העור. הטמע הרקמה ישירות לתוך אוקטובר ולאחסן את הגוש הקפוא ב -80 מעלות צלזיוס. הערה: לאחר חתך, או פרפין או דגימות קפואות יכול להיות מוכתם על ידי אימונוהיסטוכימיה לזהות TDS, תאי מרקל והעצבים באמצעות נוגדנים נגד קראטין 17, קראטין 8 ו neurofilament, בהתאמה, כפי שתואר לעיל 5,19. </li></ol> 4. דוגמאות דמיינו ידי כל הר LacZ מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון מכתים X-gal. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב monobasic פוספט 0.94 גרם נתרן, ו dibasic פוספט נתרן 2.6 גרם ב 250 מ&quot;ל של מים סטריליים. התאם ל- pH 7.3. כדי זה, להוסיף 0.5 מ&quot;ל של 1 M מגנזיום כלוריד, 0.528 גרם של פרוציאני אשלגן, ו 0.412 גרם של ferricyanide אשלגן. הוסף 250 μl של גליקול octylphenyl-פוליאתילן 125 מ&quot;ג של deoxycholate. פתרון הבסיס יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 50x המנייה X-gal solutiעל ידי הוספת dimethylformamide לבקבוק X-gal המניות לייצר פתרון 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל. אחסן את הפתרון הזה ב -20 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני השימוש, לדלל המניה X-gal פתרון 1:50 לתוך פתרון בסיס X-gal לייצר פתרון מכתים. עבור ביופסיות קטנות (&lt;1 סנטימטר 2), aliquot 1-2 מיליליטר של תמיסת מכתים לדגימה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן במדגם העור שנאספו שלב 2.7 בתמיסה המכילה glutaraldehyde 2% paraformaldehyde / 0.2% ב PBS קר למשך 30 דקות, רועד בעדינות על הקרח. עבור ביופסיות קטנות (&lt;1 סנטימטר 2), להשתמש 1-2 מיליליטר של תמיסה מקבעת לדגימה. הערה: לחילופין, לתקן דגימות paraformaldehyde 2-4% בלבד, או ב glutaraldehyde 0.5% בלבד. תנאי קיבעון אופטימלי תלוי הרקמה, מידת הביטוי LacZ ויישום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון מקבע, ולשטוף דגימות עם 3 שינויים של PBS, 5 דקות כל אחד, על שייקר ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מגבת נייר מתחת מדגם וחותכים ממנו excesזה רקמה שומן מצד העור של העור על ידי אחיזת השומן עם מלקחיים בוטים הזמירה במספריים לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול המדגם בתמיסה מכתים X-gal, לדגור על 37 מעלות CO / N. LacZ הביטוי יהיה גלוי כמו כתם כחול תחת מיקרוסקופ לנתח (איור 1 ב). הערה: אם עוצמת האות חלשה, להחליף את הפתרון המכתים למחרת וחזור על דגירת O / N. אם מכתים הרקע הוא אינטנסיבי מדי, לצמצם את הזמן של מכתים, או דגירה המדגמת ב RT במקום 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון מכתים ולשטוף את דגימות 3 שינויים של PBS המכיל DMSO 3% למשך כ 5 דקות, רועד בעדינות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות 2-3 שינויים של אתנול 70% במשך 5 דקות כל אחד. חנות דגימות באתנול 70%. </li></ol> 5. denervation כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיה כמו בשלב 2.2 ו לגלח את עור הגב כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את אזור הניתוח of העור בחזרה את השימוש במגבונים בבטאדין ואלכוהול, ולכסות את חיה עם וילון ניתוח סטרילי (למטרות הדגמה, הושמט וילון סטרילי כדי להגדיל את הנראות). שמור על חמי החיה באמצעות כרית חימום תוך שפעל באזור כירורגית ספטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים חתך באמצעות אזמל # 11 סטרילי לאורך קו האמצע הגב מבסיס הצוואר בערך 0.5 ס&quot;מ מעל הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בוטים, לשקף את העור בעדינות בצד השמאל מן האגף לדמיין את הרקמה הבסיסית מן רפידות שומן גלימה ליד הצוואר כדי בדיוק מעל הגפיים האחוריים. הערה: עצבי עורית הגבו להופיע שערות לבנות כמו זה לנסוע caudally דרך fascia השקוף של הקיר בתא המטען לפני ביצוע עיקולים חדים והזנת רקמת החיבור הרופפת מתחת לפני העור (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים Ultra- בסדר תחת מיקרוסקופ אור לנתח, להסיר את העצבים באופן בלעדי מצד שמאל של אנימהl ממוקם באתרים אנטומיים T3-12 ידי מריטת מאיפה העיקול מגזרים בכותל המטען לאתרים כניסתם לתוך העור (איור 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחי אוריינט אנכיים ולהסיר את העצבים תוך כדי אחיזה כ 0.5 סנטימטרים מתחת לאתרי העיקול שלהם ומושכים כלפי מעלה, גורם חוצפה למתוח ולהפריד מן הרקמה הסובבת (איור 2 ג - ה). היזהר, כדי למנוע פקיעת כלי דם סמוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עד שכל העצבים המשתרעים קיר בתא המטען על העור יוסרו. אין לשבש את העצבים בתוך fascia הצפופה של הקיר בתא המטען. שמור על הרקמות לחות לאורך כל ההליך על ידי יישום טיפות התקופתי של תמיסת מלח סטרילית 0.9%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להסיר עצבים ידי אחיזת קצוות הפרוקסימלי ליד הקיר בתא המטען עם מלקחיים הוא גזרה במספריים בסדר. לאחר מכן, לנתק את הקצוות הדיסטלי ליד העור (איורים 2F - H). לבסוף, להסיר את intervening מגזרים עצבים (2I איור). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל העצבים מן דש העור נחשף שלב 5.4. סיבים אלו מהווים סניפים המרוחקים של עצבים עורית הגבה ומופיעים כמו שערות לבנות הסתעפות הממוקמת באופן ספוראדי בתוך רקמת חיבור בצד העור של דש העור (2J ומספרים - K). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר אלה סניפים בסדר, למקם את המלקחיים בסדר בערך במקביל אל פני שטח עורי, לתפוס את העצבים למרוט כלפי מעלה כדי למנוע שיבוש כלי דם ניקוב העור. המשך עד שכל העצבים הגלויים הוסרו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות דיסקציה בוטה, לשקף את העור בצד ימין של חתך קו אמצע הגב, אבל לא להסיר את העצבים. זה ישמש את שליטת דמה מופעלים הנגדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר לאורך קו האמצע הגב בדפוס קטע פשוט כדי לסגור את החתך. לפקח על בעלי חיים בזמן תהליך ההחלמה-אופר פוסטatively כפי שהוכח בעבר (שלבים 2.8-10). סר תפרים בתוך 7-10 ימים לאחר ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי תפקודי להעריך עד denervation יציבה עד מספר שבועות לאחר ניתוח, להסיר את השיער מן העור הגבה באמצעות גוזז חשמלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לדקור את שטח העור denervated באמצעות מחט המזרק, ושים לב אם מגיבה החיה, בדרך כלל על ידי רעדה או לסובב את הראש שלה. אם אזור העור כבר denervated ביציבות, החיה תפגין נמוכה, אם בכלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות טוש שחור, המתאר את השטח של תשובה, כמו גם שטח של גודל ומיקום דומים בצד הדמה הנגדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף ביופסיות מאתרים אלה כמו שלבים 2.1-2.9 לניתוח. הערה: לחלופין, הגבה כולו בחזרה העור, כוללים אזורי denervated ו דמה מופעל, ניתן להסיר כסיד יחיד עבור מכתים כל הר, בדומה כמתואר שלב 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Magnon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomic+nerve+development+contributes+to+prostate+cancer+progression.">Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression.</a> Science. 341, 1236361 (2013).</li><li>Zhao, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Denervation+suppresses+gastric+tumorigenesis.">Denervation suppresses gastric tumorigenesis.</a> Sci Transl Med. 6, 115 (2014).</li><li>Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenic+inflammation+and+the+peripheral+nervous+system+in+host+defense+and+immunopathology.">Neurogenic inflammation and the peripheral nervous system in host defense and immunopathology.</a> Nat Neurosci. 15, 1063-1067 (2012).</li><li>Gautron, L., Elmquist, J. K., Williams, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+control+of+energy+balance:+translating+circuits+to+therapies.">Neural control of energy balance: translating circuits to therapies.</a> Cell. 161, 133-145 (2015).</li><li>Peterson, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinoma+preferentially+arises+from+stem+cells+within+the+hair+follicle+and+mechanosensory+niches.">Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within the hair follicle and mechanosensory niches.</a> Cell Stem Cell. 16, 400-412 (2015).</li><li>Ostrowski, S. M., Belkadi, A., Loyd, C. M., Diaconu, D., Ward, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+denervation+of+psoriasiform+mouse+skin+improves+acanthosis+and+inflammation+in+a+sensory+neuropeptide-dependent+manner.">Cutaneous denervation of psoriasiform mouse skin improves acanthosis and inflammation in a sensory neuropeptide-dependent manner.</a> J Invest Dermatol. 131, 1530-1538 (2011).</li><li>Ward, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Botulinum+neurotoxin+A+decreases+infiltrating+cutaneous+lymphocytes+and+improves+acanthosis+in+the+KC-Tie2+mouse+model.">Botulinum neurotoxin A decreases infiltrating cutaneous lymphocytes and improves acanthosis in the KC-Tie2 mouse model.</a> J Invest Dermatol. 132, 1927-1930 (2012).</li><li>Roggenkamp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fibers+modulate+keratinocyte+growth+via+neuropeptide+signaling+in+an+innervated+skin+model.">Epidermal nerve fibers modulate keratinocyte growth via neuropeptide signaling in an innervated skin model.</a> J Invest Dermatol. 133, 1620-1628 (2013).</li><li>Riol-Blanco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+sensory+neurons+drive+interleukin-23-mediated+psoriasiform+skin+inflammation.">Nociceptive sensory neurons drive interleukin-23-mediated psoriasiform skin inflammation.</a> Nature. 510, 157-161 (2014).</li><li>Zanchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Botulinum+toxin+type-A+for+the+treatment+of+inverse+psoriasis.">Botulinum toxin type-A for the treatment of inverse psoriasis.</a> J Eur Acad Dermatol Venereol. 22, 431-436 (2008).</li><li>Farber, E. M., Lanigan, S. W., Rein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+psychoneuroimmunology+in+the+pathogenesis+of+psoriasis.">The role of psychoneuroimmunology in the pathogenesis of psoriasis.</a> Cutis. 46, 314-316 (1990).</li><li>Dewing, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remission+of+psoriasis+associated+with+cutaneous+nerve+section.">Remission of psoriasis associated with cutaneous nerve section.</a> Arch Dermatol. 104, 220-221 (1971).</li><li>Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve-derived+sonic+hedgehog+defines+a+niche+for+hair+follicle+stem+cells+capable+of+becoming+epidermal+stem+cells.">Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 552-565 (2011).</li><li>Liao, X. H., Nguyen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+expression+of+Lgr6+is+dependent+on+nerve+endings+and+Schwann+cells.">Epidermal expression of Lgr6 is dependent on nerve endings and Schwann cells.</a> Exp Dermatol. 23, 195-198 (2014).</li><li>Lumpkin, E. A., Marshall, K. L., Nelson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+touch.">The cell biology of touch.</a> J Cell Biol. 191, 237-248 (2010).</li><li>Maricich, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cells+are+essential+for+light-touch+responses.">Merkel cells are essential for light-touch responses.</a> Science. 324, 1580-1582 (2009).</li><li>Reinisch, C. M., Tschachler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+touch+dome+in+human+skin+is+supplied+by+different+types+of+nerve+fibers.">The touch dome in human skin is supplied by different types of nerve fibers.</a> Ann Neurol. 58, 88-95 (2005).</li><li>Doucet, Y. S., Woo, S. H., Ruiz, M. E., Owens, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+touch+dome+defines+an+epidermal+niche+specialized+for+mechanosensory+signaling.">The touch dome defines an epidermal niche specialized for mechanosensory signaling.</a> Cell Reports. 3, 1759-1765 (2013).</li><li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Hedgehog+signaling+maintains+stem+cell+renewal+in+the+sensory+touch+dome+epithelium.">Neural Hedgehog signaling maintains stem cell renewal in the sensory touch dome epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112, 7195-7200 (2015).</li><li>English, K. B., Van Norman, D. K. -. V., Horch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chronic+denervation+in+type+I+cutaneous+mechanoreceptors+(Haarscheiben).">Effects of chronic denervation in type I cutaneous mechanoreceptors (Haarscheiben).</a> Anat Rec. 207, 79-88 (1983).</li><li>Burgess, P. R., English, K. B., Horch, K. W., Stensaas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+in+the+regeneration+of+type+I+cutaneous+receptors.">Patterning in the regeneration of type I cutaneous receptors.</a> J Physiol. 236, 57-82 (1974).</li><li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain.">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-71 (1999).</li><li>Wright, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atoh1++progenitors+maintain+the+Merkel+cell+population+in+embryonic+and+adult+mice.">Atoh1+ progenitors maintain the Merkel cell population in embryonic and adult mice.</a> J Cell Biol. 208, 367-379 (2015).</li><li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+dependence+in+tissue,+organ,+and+appendage+regeneration.">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends Neurosci. 35, 691-699 (2012).</li><li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+reveals+nerve-dependent+and+independent+roles+on+mammalian+hind+limb+tissue+maintenance+and+regeneration.">Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111, 9846-9851 (2014).</li><li>Ueno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+corneal+stem/progenitor+cells+on+ocular+surface+innervation.">Dependence of corneal stem/progenitor cells on ocular surface innervation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 867-872 (2012).</li><li>Westphalen, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+intestinal+tuft+cells+serve+as+colon+cancer-initiating+cells.">Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells.</a> J Clin Invest. 124, 1283-1295 (2014).</li><li>Uhmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hedgehog+receptor+Patched+controls+lymphoid+lineage+commitment.">The Hedgehog receptor Patched controls lymphoid lineage commitment.</a> Blood. 110, 1814-1823 (2007).</li><li>Lau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+gene+deletion+in+sensory+ganglia+using+a+tamoxifen-inducible+Advillin-Cre-ERT2+recombinase+mouse.">Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse.</a> Mol Pain. 7, 100 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

עצבים לשרת פונקציות חיוניות לא רק תחושה, אלא גם בפיתוח איבר יונק, בשמירה ובחידוש 13,24-27. כפי עצבים היו מעורבים לאחרונה בהפרעות עור מגוונות, הטכניקות המתוארות כאן יכולות לשמש כדי לחקור את דרישת העצבוב במגוון דגמי המחלה בבעלי החיים. למעשה הטכניקה denervation חד-צדדית מאפשרת השוואה ישירה של העור או עם העצבים שלא ניזוקו או שיבשו מאותו עכבר. זה מספק בקרה פנימית אידיאלית כדי לפצות על הבדלים חי אל-חיה, עם הנתונים הבאים מנתחת עשיית שימוש של מבחן t מזווג. בעוד בהתאם לנוהל המתואר בעיקר לנצל את הגן הכתב LacZ, ניסויים אלה ניתן להתאים כך אלל Gli1-CreERT2 בשילוב עם אללים הכתב או מותנה ניאון אחרים כדי לשנות ביטוי גנים TD. למשל, עכברי Gli1-CreERT2 ניתן חצועם חיות מחסה אללים מותנה של Patched1 (B6N.129-Ptch1 tm1Hahn / J) 28 כדי ליצור עכברים יוצרים גידולים שמקורם TD לאחר אינדוקציה טמוקסיפן 5. חשוב לציין כי המתח Gli1-CreERT2 גם גורם רקומבינציה משנה של תאי גזע זקיק השיער Gli1 + כי מופרדים פיזית מאלו TD 13. בעקבות denervation, עצבים בעור להישאר ablated ביציבות במשך כמה חודשים (איור 3 ג) 5,19. במחקרים אחרים, לעומת זאת, קצת מחדש עצבוב דווח להתרחש לאורך זמן 6. Perdurance של פנוטיפ denervated תלוי היסודי של הסרת עצב, כפי שהוא קריטי שיחתכו מגזרים עצבים בין היציאה שלהם מקיר החזה עד לנקודה בקרבת האתרים של כניסה לתוך הדרמיס של העור. לגמרי removing השיער מהעור לפני ביופסיה יכול לשפר את היכולת מכן לדמיין TDs ידי מכתים כל הר (איור 1B). מטרה זו מושגת על ידי החלת קרם מקריח לעור מקוטע למשך 2 דקות, ולאחר מכן לנגב את השיער משם לכיוון הקדמי אל האחורי באמצעות כדורי צמר גפן. שימו לב: אפילציה יכול להשפיע קינטיקה מחזור השיער באמצעות קידום כניסתו שלב הצמיחה anagen. לחלופין, שיער ניתן להסיר לחלוטין באמצעות סכין גילוח. בנוסף, הר שלם אימונוהיסטוכימיה ניתן לבצע כדי להמחיש TDs ותאי מרקל על יריעות אפיתל מופרד הדרמיס, כפי שתואר קודם לכן 23. אך יש סבירות גבוהה כי denervation כירורגי עשוי לגרום לדלקת באתר כירורגית, פוטנציאל בלבול כלשהו פנוטיפים שנצפו. מניסיוננו, שלא הבחנו דלקת משמעותית לאחר denervation, סביר להניח כי הנזק האגבי רקמות שהתהוו במהלך skב הוא קל אם הפרוצדורה מבוצעת כראוי. כדי למזער את האפשרות כי דלקת עלולה להשפיע על תוצאותיו, בקרות נוספות ניתן לשלב הניסוי. לדוגמא, צפינו כי denervation עכבות במיוחד גידולים שמקורם TD, אבל לא שיער סמוך זקיק הקשורים נגעים בדגימות העור אותו, בטענה כי denervation-ולא דלקתי כללי נגרם פצע tumorigenesis עכבות תגובה-הנראה על TD 5. חשוב לציין כי denervation כירורגית ablates כל העצבים עורית, כוללים סיבים חושיים ואוהד 5, ובכך מספק הערכה כוללת כללי בהשפעת העצבים אלה על עור או נורמלי או חולה. גישות ניסיוניות אחרות, למשל באמצעות pharmacologics כגון עצבי הבוטוליזם חוסמים עצביות, עשוי להניב תובנה מכניסטית מפורטות יותר 7, אם כי לא ברור אם תכשירים אלו מעכבים מדרדריםהפרשת ציטוקינים כגון הליגנדים קיפוד. לחלופין, תרכובות כגון 6-hydroxydopamine שימשו לקטוע העצבים הסימפתטית בעור 9. בנוסף, המיקוד הקולטנים לגורמי נגזרות עצבים כגון פפטיד גן הקשורות קלציטונין ו- P ואלכוהול עשוי להיות שימושי עבור לחקור אינטראקציות ספציפיות בין עצבים והתאים המקיפים בתוך הנישה שלהם 6. בסופו של דבר, אסטרטגיות מרובות עשויים להיות מנוצלות בשילוב לזהות, או לפחות לשלול, מנגנוני איתות פוטנציאליים. לבסוף, ממוקד מחיקה גנטית של גורמי נגזרות עצבים בשושלת העצבית או באמצעות Wnt1-Cre או Advillin-Cre עשוי לייצג את תקן הזהב עבור הבהרת האותות שמועברים בין עצבי הנישה שלהם 19. כפי שאף אחד הזנים אלה הם טמוקסיפן-מושרים, לעומת זאת, קצת זהירות צריכה לנקוט כדי להבטיח שיבוש של האותות הללו אינם פוגע פיתוח עצב או ta הנאהrgeting של afferents העצבי. השתמש של Cre טמוקסיפן-מושרה כגון Advillin-CreERT2 עשוי לעזור לעקוף בעיות אלה 29. בסך הכל, הטכניקות מתוארות כאן-שילוב של מעקב שושלת, להדמית תא וגישות עצמה כירורגית denervation-הצעה לחקר השפעת העצבים על עור בריא וחולה. עם ניסיון, נהלים אלה ניתן לבצע באופן שיגרתי ובאמינות, תוך גרימת מצוקה מינימאלית לחיה-או החוקר.

Over the past few years, there has been a widening appreciation for the influence of nerves on diseases not typically regarded as classical neuropathies1-4. In the skin, recent experimental evidence has suggested that sensory nerves can modulate diverse pathologies ranging from psoriasis to cancer5-9. This has been demonstrated using techniques such as surgical denervation and pharmacological inhibition of neural function in rodents. In the case of psoriasis, these studies have provided a mechanistic framework for understanding why human psoriatic plaques regress following loss of neural function7,10-12.
Cutaneous nerves can also affect gene expression13,14 and are critical for mechanosensing in normal skin15. In particular, touch dome (TD) epithelia are comprised of a patch of columnar epidermal cells in juxtaposition with neuroendocrine Merkel cells innervated by slowly adapting type 1 (SA1) nerve fibers16-18. TDs mediate light touch sensation and have been shown to display Hedgehog pathway activity5,19. TD maintenance depends on innervation20,21, as nerves secrete Hedgehog ligands to sustain normal TDs and their associated Merkel cells19. In addition, innervation promotes Hedgehog-dependent tumor formation from TD epithelia5. Together, these studies reinforce the notion that intricate molecular interactions occurring between nerves and the surrounding cells in their niche are crucial for normal TD physiology as well as disease.
To interrogate the nature of these interactions, we describe here a series of in vivo techniques for manipulating gene expression in the TD, as well as for harvesting skin biopsies for TD visualization after lineage tracing. Finally, we describe procedures for performing unilateral surgical denervation, wherein nerves are removed from one side of the mouse dorsal skin, while leaving the contralateral side intact as a sham internal control. Several weeks after surgery, denervated and sham control skin are compared to assess changes that occur when nerves are ablated. Although these techniques are described in the context of normal TDs, the denervation procedure has been used to examine the requirement for nerves in mouse models of psoriasis6, wound healing13 and tumorigenesis5. Finally, since the skin is amenable to repeated biopsies, this provides an opportunity to monitor the long-term fates of labeled cells or to assess disease progression over multiple time points.

<table><tbody><tr><td>Alcohol prep pads</td><td>PDI</td><td>B339</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed (Xylazine)</td><td>Lloyd</td><td>NADA 139-236</td><td></td></tr><tr><td>Antibody, anti-Keratin 8</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>TROMA-I</td><td>rat antibody, use at 1:500 concentration</td></tr><tr><td>Antibody, anti-Keratin 17</td><td>Cell Signaling</td><td>#4543</td><td>rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration</td></tr><tr><td>Antibody, anti-Neurofilament</td><td>Cell Signaling</td><td>C28E10</td><td>rabbit antibody, use at 1:500 concentration</td></tr><tr><td>Betadine prep pads</td><td>Medline</td><td>MDS093917</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl)</td><td>Zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cordless rechargable clipper</td><td>Wahl</td><td>trimmer model 8900</td><td></td></tr><tr><td>Corn Oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>use at 1:1,000 concentration</td></tr><tr><td>Deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Depilatory Cream</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylforamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319937</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCl</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glass</td><td>VWR</td><td>48404-454</td><td></td></tr><tr><td>Micro Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>VWR</td><td>BDH0502-4LP</td><td></td></tr><tr><td>6-0 nylon sutures</td><td>DemeTECH</td><td>NL166012F4P</td><td></td></tr><tr><td>Octylphenyl-polyethylene glycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Sakura Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Pottasium ferrocyanide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Pottasium ferricyanide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ultra fine forceps</td><td>Dumont</td><td>0103-5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Roche</td><td>10 651 745 001</td><td>Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use</td></tr></tbody></table>

cutaneous surgical denervation:  a method for testing the requirement for nerves in mouse models of skin disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

על ידי עכברי יצירה להביע טמוקסיפן-מושרת Gli1-CreERT2 ו אלל כתב LacZ, אפשר לדמיין epithelia TD ולעקוב אחר גורלם של תאים אלה לאורך זמן. הליך denervation כולו בדרך כלל ניתן להשלים בתוך 1 hr לכל עכבר וצריך לגרום למצוקה מינימאלית לחיה. המחקרים הקודמים שלנו הראו כי עצבים חיוניים לשמירה הן TDs רגיל וכן תאי קרטין 8 + מרקל הקשורים בהם (איורים 3 א - ג) 5,19. עצבים הם גם קריטי בקידום ביטוי Gli1 ב TD (איור 3D). בהתחשב המראה נדיר יחסית של אשכולות TD ברחבי העור (איור 1B), הוא הכרחי כדי לדגום חלקים קפואים מרובים כדי לכמת תדירות TD במדויק. בדרך כלל, אנו מעריכים 15-שמרנים שאינםסעיפים ecutive (כל 10 מיקרומטר עבה ~ 1 ס&quot;מ אורך) משני דמה והעור denervated מכל חיה. בעקבות denervation, אובדן יציבה של עצבים, הן TD וברחבי העור, יכול להיות מאושרת על ידי בהעדר מכתים immunohistochemical עבור סמנים הפאן עצביות סטנדרטיים כגון neurofilament או בסעיפים קפוא או פרפין (איורים 3 א ו -3 ג, ו כמו בעבר דווח 5). לחלופין, עצבים ניתן לזהות גם על ידי ביטוי של β3 טובולין או PGP9.5 6,9. באמצעות Gli1; ​​עכברים LacZ, אפשר גם לאשר הן את הדרישה עצבים בהפעלת ה- Hedgehog signaling של TD ו בשמירה גורל התא TD על ידי שינוי רצף של רקומבינציה-induced טמוקסיפן ו denervation. אם denervation מתבצע לפני רקומבינציה, למשל, זה היה לבדוק את הדרישה עצבה בהפעלת pathwa הקיפודy, כמו פיקוח על ידי Cre recombinase פעילות ורמות, אשר מתואמים עם הביטוי Gli1 אצל בעלי חיים אלה. מצד השני, אם denervation מבוצעת לאחר רקומבינציה, זה היה להעריך את הדרישה עצבה בשמירת תאים כבר שכותרתו ב TD. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54050/54050fig1.jpg" /> איור 1. ביופסית סקין כל הר מכתים LacZ של TD epithelia. (א) (למעלה) תצלום של עכבר לאחר ביופסיה לפני התפירה. (למטה משמאל) תמונה מוגדלת של אתר ביופסיה. (בפינה הימנית התחתונה) עור מדגם המתקבל ביופסיה עם הצד הדרמיס שלה רחב ושטוח על מגבת נייר יבש. (ב) כל הר LacZ מכתים של העור מפני Gli1; ​​העכבר LacZ, 7 ימים לאחר אינדוקציה טמוקסיפן, מקולף רק לפני ביופסיה כדי לשפר להדמיה העור. Gli1 + / LacZ + TDs מתויגת אשכולות כחולים עזים.סרגל קנה מידה = 1 ס&quot;מ. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54050/54050fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54050/54050fig2.jpg" /> איור 2. שתי גישות denervating הגבה עור. (א) קריקטורה דיאגרמה של עור עכבר מעוצבבים. קווים מקווקווים אדומים מצביעים על כריתה יחידה עשתה לאורך קו האמצע גב לחשוף את השרירים הבסיסיים על הקיר בתא המטען (סגול) כמו גם בדרמיס (אפור, כוכבי) מתחת לעור המשתקף. גב עצבי עורית נסיעת caudally להופיע &quot;לכופף&quot; כפי שהם עוזבים את הקיר בתא המטען (החץ השחור מציין לכופף אחד כזה). עצב מגזרים להיות ניכרים מתוחמים על ידי קווים מקווקווים שחורים. (ב) תצלום של עצבים שלא ניזוקו עם אתרים של כיפוף מצוין (חיצים). חצים כחולים מצביעים על 2 מגזרים עצבים יהיה remעובד. תמונות - (D C) מראה טכניקה denervation. בעזרת מלקחיים Ultra- בסדר, אחיזה העצבים 0.5 ס&quot;מ מתחת האתרים שלהם של כיפוף ומשוך כלפי חוץ. (ה) תמונה בה נראית חלל הגוף לאחר הסרת 2 מגזרים עצבים (חיצים כחולים). העצבים הנותרים צריך גם להסירו. (F - I) גישה חלופית להסרת עצב מתוארת, שבו עצבים גזזו את הפרוקסימלי שלהם מסתיים ממש מתחת למקום שבו הם לכופף (ראשי חץ) (G), וגם distally, קרוב לאתר של כניסתם לתוך העור (ראשי חץ) (H). ראוי לציין, כי חתך קו אמצע התמונות האלה הוא יותר טיפוסיים לצורך ויזואליזציה טובה יותר. (J) תצלום של צד העור של דש העור לידי ביטוי לצד אחד של קו האמצע. עצבים (K) מפורטים (קווים שחורים), עם כלי דם גדולים המצוין אדום. העצבים הממוקמים בצדו הדרמיס של הסקידש n גם צריך להיות ניכר. אסטריסק, שבבסיס הדרמיס מן דש העור לידי ביטוי. סרגל קנה מידה = 1 מ&quot;מ. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54050/54050fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54050/54050fig3.jpg" /> איור 3. אובדן יציב של עצבי הידרדרות TDs לאחר denervation. (א) אימונוהיסטוכימיה מראה epithelia TD עם קראטין 8 + תאי מרקל (K8, ירוק) neurofilament + עצבים (NF, אדום) בעור המופעל באמצעות אחיזת עיניים. (ב) תיאור קריקטורה, עם epithelia TD מודגש תאים סגולים, מרקל בירוק, עצבי תחושה בכחול. (C) אימונוהיסטוכימיה מראה העור denervated (den) חסר מתחמי neurite תאי מרקל בתחום TD. קווים צהובים מקווקוים, האפיתל זקיק שיער. אסטריסק, backgrounמכתים ד. (ד) כל הר LacZ מכתים של הגב בחזרה העור מפני Gli1 LacZ / + עכבר 2 שבועות לאחר denervation העור חד-צדדית. בתיבה משמאל חתך קו האמצע הבריא (חץ), epithelia TD שכותרתו בשפע הם נצפו עור דמה מופעל. מימין לקו האמצע, TDS אינו גלוי בעור denervated. בר סולם = 10 מיקרומטר עבור (א), (ג); ו 1 מ&quot;מ עבור (D). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54050/54050fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease at JoVE.com

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

Denervation כירורגי עורית: שיטה לבדיקת הדרישה עצבה בעכברי מודל של מחלת עור

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

cutaneous-surgical-denervation-method-for-testing-requirement-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

9.7K Views.  University of Michigan. This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount β-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

Video: Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

The Spared Nerve Injury (SNI) Model of Induced Mechanical Allodynia in Mice

Peripheral neuropathic pain is a severe chronic pain condition which may result from trauma to sensory nerves in the peripheral nervous system. The spared nerve injury (SNI) model induces symptoms of neuropathic pain such as mechanical allodynia i.e. pain due to tactile stimuli that do not normally provoke a painful response [1]. 
The SNI mouse model involves ligation of two of the three branches of the sciatic nerve (the tibial nerve and the common peroneal nerve), while the sural nerve is left intact [2]. The lesion results in marked hypersensitivity in the lateral area of the paw, which is innervated by the spared sural nerve. The non-operated side of the mouse can be used as a control. The advantages of the SNI model are the robustness of the response and that it doesn&#x2019;t require expert microsurgical skills.
The threshold for mechanical pain response is determined by testing with von Frey filaments of increasing bending force, which are repetitively pressed against the lateral area of the paw [3], [4]. A positive pain reaction is defined as sudden paw withdrawal, flinching and/or paw licking induced by the filament. A positive response in three out of five repetitive stimuli is defined as the pain threshold. 
As demonstrated in the video protocol, C57BL/6 mice experience profound allodynia as early as the day following surgery and maintain this for several weeks.

The Spared Nerve Injury SNI Model of Induced Mechanical Allodynia in Mice

The Spared Nerve Injury animal model is described here as a mouse model of peripheral neuropathic pain following partial denervation of the sciatic nerve by lesioning the tibial and common peroneal nerve branches, leaving the remaining sural nerve intact. Behavioral modification resulting from mechanical allodynia is quantified by von Frey filaments.

פגיעה ניצלו עצב (SNI) דגם Allodynia מכונות המושרה עכברים

Peripheral neuropathic pain is a severe chronic pain condition which may result from trauma to sensory nerves in the peripheral nervous system. The spared ...

Tibial Nerve Transection - A Standardized Model for Denervation-induced Skeletal Muscle Atrophy in Mice

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. Although originally developed and used extensively in the rat due to its larger size, the tibial nerve in mice is big enough that it can be easily manipulated with either crush or transection, leaving the peroneal and sural nerve branches of the sciatic nerve intact and thereby preserving their target muscles. Thus, this model offers the advantages of inducing less morbidity and impediment of ambulation than the sciatic nerve transection model and also allows investigators to study the physiologic, cellular and molecular biologic mechanisms regulating the process of muscle atrophy in genetically engineered mice. The tibial nerve supplies the gastrocnemius, soleus and plantaris muscles, so its transection permits the study of denervated skeletal muscle composed of fast twitch type II fibers and/or slow twitch type I fibers. Here we demonstrate the tibial nerve transection model in the C57Black6 mouse. We assess the atrophy of the gastrocnemius muscle, as a representative muscle, at 1, 2, and 4 weeks post-denervation by measuring muscle weights and fiber type specific cross-sectional area on paraffin-embedded histologic sections immunostained for fast twitch myosin.

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of skeletal muscle atrophy. The model surgical protocol is described and demonstrated in C57Black6 mice. &#160;

חיתוך רוחב עצב הטיביאלי - מודל סטנדרטי לניוון שרירים שלד מושרה denervation בעכברים

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. ...

Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and either cut or crush it to induce peripheral nerve injury. Advantages of this surgery are its simplicity, high reproducibility, and the lack of effect on vital functions or mobility from the subsequent facial paralysis, thus resulting in a relatively mild surgical outcome compared to other nerve injury models. A major advantage of using a cranial nerve injury model is that the motoneurons reside in a relatively homogenous population in the facial motor nucleus in the pons, simplifying the study of the motoneuron cell bodies. Because of the symmetrical nature of facial nerve innervation and the lack of crosstalk between the facial motor nuclei, the operation can be performed unilaterally with the unaxotomized side serving as a paired internal control. A variety of analyses can be performed postoperatively to assess the physiologic response, details of which are beyond the scope of this article. For example, recovery of muscle function can serve as a behavioral marker for reinnervation, or the motoneurons can be quantified to measure cell survival. Additionally, the motoneurons can be accurately captured using laser microdissection for molecular analysis. Because the facial nerve axotomy is minimally invasive and well tolerated, it can be utilized on a wide variety of genetically modified mice. Also, this surgery model can be used to analyze the effectiveness of peripheral nerve injury treatments. Facial nerve injury provides a means for investigating not only motoneurons, but also the responses of the central and peripheral glial microenvironment, immune system, and target musculature. The facial nerve injury model is a widely accepted peripheral nerve injury model that serves as a powerful tool for studying nerve injury and regeneration.

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

Axotomy פנים עצב של עכברים: דגם לחקר תגובת Motoneuron לפגיעה

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and ...

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to degeneration and injury of small-diameter sensory neurons, referred to as small fiber neuropathy. Present animal models of small fiber neuropathy affect both large- and small-diameter sensory fibers and thus create a neuropathology too complex to properly assess the effects of injured small-diameter sensory fibers. Therefore, it is necessary to develop an experimental model of pure small fiber neuropathy to adequately examine these issues. This protocol describes an experimental model of small fiber neuropathy specifically affecting small-diameter sensory nerves with resiniferatoxin (RTX), an ultrapotent agonist of transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1), through a single dose of intraperitoneal injection, referred to as RTX neuropathy. This RTX neuropathy showed pathological manifestations and behavioral abnormalities that mimic the clinical characteristics of patients with small fiber neuropathy, including intraepidermal nerve fiber (IENF) degeneration, specifically injury in small-diameter neurons, and induction of thermal hypoalgesia and mechanical allodynia. This protocol tested three doses of RTX (200, 50, and 10 &#181;g/kg, respectively) and concluded that a critical dose of RTX (50 &#181;g/kg) is required for the development of typical small fiber neuropathy manifestations, and prepared a modified immunostaining procedure to investigate IENF degeneration and neuronal soma injury. The modified procedure is fast, systematic, and economic. Behavioral evaluation of neuropathic pain is critical to reveal the function of small-diameter sensory nerves. The evaluation of mechanical thresholds in experimental rodents is particularly challenging and this protocol describes a customized metal mesh that is suitable for this type of assessment in rodents. In summary, RTX neuropathy is a new and easily established experimental model to evaluate the molecular significance and intervention underlying neuropathic pain for the development of therapeutic agents.

This study establishes an experimental model of pure small fiber neuropathy with resiniferatoxin (RTX). A unique dose of RTX (50 &#181;g/kg) is optimal for developing a small fiber neuropathy model that mimics patient characteristics and could help investigate the nociceptive molecular significance underlying neuropathic pain.

הקמת מודל העכבר של נוירופתיה סיבים קטנים טהור עם אגוניסט Ultrapotent פוטנציאלי קולטן ארעי Vanilloid סוג 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Neuroscience

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ~6.5M people and cost ~$40B/year in the US alone. Although a significant effort has been invested in understanding how chronic wounds develop in humans, fundamental questions remain unanswered. Recently, we developed a novel mouse model for diabetic chronic wounds that have many characteristics of human chronic wounds. Using db/db-/- mice, we can generate chronic wounds by inducing high levels of oxidative stress (OS) in the wound tissue immediately after wounding, using a one-time treatment with inhibitors specific to the antioxidant enzymes catalase and glutathione peroxidase. These wounds have high levels of OS, develop biofilm naturally, become fully chronic within 20 days after treatment and can remain open more for more than 60 days. This novel model has many features of diabetic chronic wounds in humans and therefore can contribute significantly to advancing fundamental understanding of how wounds become chronic. This is a major breakthrough because chronic wounds in humans cause significant pain and distress to patients and result in amputation if unresolved. Moreover, these wounds are very expensive and time-consuming to treat, and lead to significant loss of personal income to patients. Advancements in this field of study through the use of our chronic wound model can significantly improve health care for millions who suffer under this debilitating condition. In this protocol, we describe in great detail the procedure to cause acute wounds to become chronic, which has not been done before.

Chronic wounds are developed from acute wounds on a diabetic mouse model by inducing high levels of oxidative stress after a full-thickness cutaneous wound. The wound is treated with inhibitors for catalase and glutathione peroxidase, resulting in impaired healing and biofilm development by bacteria present in the skin microbiome.

פרוטוקול יצירת פצעים כרוניים עכברים סוכרתית

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Modified Spared Nerve Injury Surgery Model of Neuropathic Pain in Mice

Spared nerve injury (SNI) is an animal model that mimics the cardinal symptoms of peripheral nerve injury for studying the molecular and cellular mechanism of neuropathic pain in mice and rats. Currently, there are two types of SNI model, one to cut and ligate the common peroneal and the tibial nerves with intact sural nerve, which is defined as SNIs in this study, and another to cut and ligate the common peroneal and the sural nerves with intact tibial nerve, which is defined as SNIt in this study. Because the sural nerve is purely sensory whereas the tibial nerve contains both motor and sensory fibers, the SNIt model has much less motor deficit than the SNIs model. In the traditional SNIt mouse model, the common peroneal and the sural nerves are cut and ligated separately. Here a modified SNIt surgery method is described to damage both common peroneal and sural nerves with only one ligation and one cut with a shorter procedure time, which is easier to perform and reduces the potential risk of stretching the sciatic or tibial nerves, and produces similar mechanical hypersensitivity as the traditional SNIt model.

<meta charset="utf8"></head><body>מודל שונה של פגיעה עצבית ניצלת של כאב נוירופתי בעכברים

The modified surgery is a simplified method for mouse or rat spared nerve injury model that requires only one ligation and one cut to injure both common peroneal and sural nerves.

מודל שונה של פגיעה עצבית ניצלת של כאב נוירופתי בעכברים

Spared nerve injury (SNI) is an animal model that mimics the cardinal symptoms of peripheral nerve injury for studying the molecular and cellular ...

Partial Sciatic Nerve Ligation: A Mouse Model of Chronic Neuropathic Pain to Study the Antinociceptive Effect of Novel Therapies

Management of chronic pain remains challenging to this day, and current treatments are associated with adverse effects, including tolerance and addiction. Chronic neuropathic pain results from lesions or diseases in the somatosensory system. To investigate potential therapies with reduced side effects, animal pain models are the gold standard in preclinical studies. Therefore, well-characterized and well-described models are crucial for the development and validation of innovative therapies. 
Partial ligation of the sciatic nerve (pSNL) is a procedure that induces chronic neuropathic pain in mice, characterized by mechanical and thermal hypersensitivity, ongoing pain, and changes in limb temperature, making this model a great fit to study neuropathic pain preclinically. pSNL is an advantageous model to study neuropathic pain as it reproduces many symptoms observed in humans with neuropathic pain. Furthermore, the surgical procedure is relatively fast and straightforward to perform. Unilateral pSNL of one limb allows for comparison between the ipsilateral and contralateral paws, as well as evaluation of central sensitization. 
To induce chronic neuropathic hypersensitivity, a 9-0 non-absorbable nylon thread is used to ligate the dorsal third of the sciatic nerve. This article describes the surgical procedure and characterizes the development of chronic neuropathic pain through multiple commonly used behavioral tests. As a plethora of innovative therapies are now being investigated to treat chronic pain, this article provides crucial concepts for standardization and an accurate description of surgeries required to induce neuropathic pain.

Partial sciatic nerve ligation induces long-lasting chronic neuropathic pain, characterized by exaggerated responses to thermal and mechanical stimuli. This mouse model of neuropathic pain is commonly used to study innovative therapies for pain management. This article describes in detail the surgical procedure to improve standardization and reproducibility.

קשירת עצבים סיאטית חלקית: מודל עכברי של כאב נוירופתי כרוני לחקר ההשפעה האנטינוסיצפטיבית של טיפולים חדשניים

Management of chronic pain remains challenging to this day, and current treatments are associated with adverse effects, including tolerance and addiction. ...

התמקדות בנוירונים סימפתטיים של עכברים: גישה לכריתת סימפתטומיה מותנית

Surgical Lumbar Sympathectomy in Mice

Peripheral nerve injuries are common, and full functional recovery after injury is achieved in only 10% of patients. The sympathetic nervous system plays many critical roles in maintaining bodily homeostasis, but it has rarely been studied in the context of peripheral nerve injury. The extent of postganglionic sympathetic neuronal functions in distal targets in the periphery is currently unclear. To better explore the role of sympathetic innervation of peripheral targets, a surgical &#34;knock-out&#34; model provides an alternative approach. Although this can be achieved chemically, chemical destruction of postganglionic sympathetic neurons can be nonspecific and dose-dependent. The use of a surgical lumbar sympathectomy in mice, once thought to be &#34;virtually not practicable&#34; in small animals, allows for specific targeting of postganglionic sympathetic neurons that innervate the hind limbs. This manuscript describes how to surgically remove the L2-L5 lumbar sympathetic ganglia from a mouse as a survival surgery, which reliably decreases the hind paw sweat response and the number of sympathetic axons in the sciatic nerve.

מחבר Spotlight: Exploring Plasticity of Sympathetic Neurons

This manuscript presents a protocol for surgically removing the postganglionic lumbar sympathetic neurons from a mouse. This procedure will facilitate a multitude of studies aimed at investigating the role of sympathetic innervation in distal tissue targets.

כריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית בעכברים

Peripheral nerve injuries are common, and full functional recovery after injury is achieved in only 10% of patients. The sympathetic nervous system plays ...

Denervation כירורגי עורית: שיטה לבדיקת הדרישה עצבה בעכברי מודל של מחלת עור

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

פגיעה ניצלו עצב (SNI) דגם Allodynia מכונות המושרה עכברים

חיתוך רוחב עצב הטיביאלי - מודל סטנדרטי לניוון שרירים שלד מושרה denervation בעכברים

Axotomy פנים עצב של עכברים: דגם לחקר תגובת Motoneuron לפגיעה

הקמת מודל העכבר של נוירופתיה סיבים קטנים טהור עם אגוניסט Ultrapotent פוטנציאלי קולטן ארעי Vanilloid סוג 1

פרוטוקול יצירת פצעים כרוניים עכברים סוכרתית

מודל שונה של פגיעה עצבית ניצלת של כאב נוירופתי בעכברים

מודל שונה של פגיעה עצבית ניצלת של כאב נוירופתי בעכברים

קשירת עצבים סיאטית חלקית: מודל עכברי של כאב נוירופתי כרוני לחקר ההשפעה האנטינוסיצפטיבית של טיפולים חדשניים

כריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית בעכברים

כריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית בעכברים