Name: combining double fluorescence in situ hybridization with immunolabelling for detection of the expression of three genes in mouse brain sections
Uploaded: 2016-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections at JoVE.com

Work in the authors' laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, "Ideas" Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.

משפט ואתיקה: בעלי וטיפול Mouse הם בהתאם לתקנות משרד הפנים בבריטניה והנחיות ועדת האתיקה UCL, עולות בקנה אחד עם בעלי חיים (הליכים מדעיים) Act 1986 של הממלכה המאוחדת ותקנות תיקון ל -2012. הערה: כל הפתרונות צריכה להיעשות עם diethyl pyrocarbonate (DEPC) - מים מטופלים להרוס כל RNase שיורית. לטיפול DEPC, להוסיף DEPC (1 מ&quot;ל לליטר), לנער במרץ עד שכל כדוריות DEPC נעלמו אז החיטוי כדי לבזות את DEPC. סינתזה 1. RNA Probe <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות: בעת טיפול לפוראמיד, ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) ולהשתמש בארון בטיחות. הכן חיץ הכלאה: מים ללא יונים DEPC שטופלו עם 50% (v / v) לפוראמיד deionized, 200 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 מ&quot;מ לאא 2 4 PO, 5 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 0.01 מ&quot;ג / tRNA שמרים מיליליטר, 1 × soluti של Denhardtעל, ו -10% w / v סולפט dextran. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שיבוט DNA המכיל את רצף cDNA של הגן של עניין פלסמיד עם היזמים RNA פולימראז. בדוגמה זו, השתמש שיבוט pCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (GenBank accessionBC024934), עם T7 ומקדמי פולימראז SP6 רנ&quot;א עבור Aspa (איור 1 משלים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה- DNA פלסמיד לינארית כתבנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את שיבוט DNA, לחלץ את הפלסמיד עם ערכת טיהור פלסמיד בקנה מידה קטן פי פרוטוקול ורצף של היצרן עם T7 ו פריימרים אוניברסלי SP6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקציר פלסמיד דנ&quot;א 1,020 מיקרוגרם עם אנזים הגבלה שחותך בסוף &#39;5 של גדיל תחושה של cDNA. בדוגמה זו, השתמש 100 יחידת סאל לי לעכל את הפלסמיד Aspa pCMV-SPORT6-. דגירה של 1.5 שעות ב 37 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל aliquot קטן על ג&#39;ל agarose לבדוק כי פלסמיד לינארית לגמרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר אתהפלסמיד לינארית באמצעות כלורופורם פנול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1/10 נפח של נתרן אצטט M 3, כרך אחד של 10 מ&quot;מ טריס HCl (pH 8.0) - פנול equilibrated ונפח אחד של כלורופורם / isoamyl אלכוהול (רש&quot;ת) (24: 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 16,000 דקות 1 ב RT (20 - 25 ° C, RT) ולחלץ בשלב מימי עליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נפח אחד של כלורופורם / רשות עתיקה, צנטריפוגות ב XG 16,000 דקות 1 ולחלץ בשלב מימי עליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 2 כרכים של אתנול ולהשאיר ב -20 o צלזיוס במשך שעה 1. או O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 16,000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הכדור עם אתנול קר 70% מחדש להשעות ב cDNA approximatively 1 מיקרוגרם לכל 2.5 μl ב TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7.5). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז את שתי בדיקות, אחת שכותרתו עם Digoxigenin (DIG) והשני עם isothiocyanate והעמסת (FITC). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את RNA פולימראז המתאימה לעשות את-se אנטיחללית NSE (משלימה היעד mRNA). בדוגמה זו, השתמש RNA פולימראז T7 לעשות בדיקה Aspa. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בתגובה שעתוק במבחנה: להוסיף 1 מיקרוגרם של ה- DNA לינארית, 4.0 μl 5 חיץ שעתוק x, 6.0 μl של 100 מ&quot;מ DTT, 2.0 μl של 10x תערובת תיוג RNA DIG או FITC dNTPs המכיל, 1 מעכב RNase μl, ו 20 - 40 יחידות של RNA פולימראז; להפוך את עוצמת הקול הסופי עד 20 μl במים שטופלו DEPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלסיוס במשך 1.5 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> μl Run1 של תגובת השעתוק על ג&#39;ל agarose 1.0% לבדוק שהתגובה עבדה. הג&#39;ל צריך להראות את התבנית לינארית להקה בהירה של החללית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את עוצמת הקול עד 100 μl עם חיץ הכלאה ולאחסן 10 aliquots μl ב -80 ° C. </li></ol> 2. זלוף, קיבוע אוסף רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות: בעת טיפול paraformaldehyde (PFA), הן מוצקותמימית, ללבוש PPE ולהשתמש בארון בטיחות. כן פתרון פורמלדהיד ידי המסת 4% (w / v) PFA לתוך 1x בופר פוספט (PBS) פתרון באמצעות חום (55 מעלות צלזיוס). סנן פתרון פורמלדהיד עם נייר סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תמיסת סוכרוז על ידי המסת 20% (w / v) סוכרוז במים מזוקקים ולהוסיף 0.1% (v / v) פתרון DEPC. השאר O ​​/ N ב RT עם מכסה רופף ולאחר מכן חיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סופני לטשטש עכבר ידי הזרקה תוך הצפק של pentobarbitone (50 מ&quot;ג / ק&quot;ג). להעריך את עומק ההרדמה על ידי צביטת בוהן והיעדר רפלקס נסיגה מצביע הרדמה עמוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העכבר הוא בהרדמה עמוקה, עושה חתך מתחת לבית החזה וחתך דרך כלוב הצלעות משני הצדדים, להרים אותו כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט 25-G לתוך החדר השמאלי של הלב. ביצוע חתך קטן העלייה הימנית של הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse החיה עם 20 מ&quot;ל PBS ולאחר מכן 40 בתמיסת פורמלדהיד מ&quot;ל. עבור P30 ומעלהעכברים, השתמש שיעור זלוף של 12 מ&quot;ל / דקה אלא גם לבעלי חיים צעירים להשתמש בשיעור נמוך יותר (7 - 10 מ&quot;ל / דקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנתח את המוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את ראש העכבר עם מספרי כירורגיות על ידי יצירה אחורית לחתוך מהאוזניים. ביצוע חתך קו אמצע זנב בעור ולעבוד rostrally להסיר את העור מפני גולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מחלק הזנב, לחתוך דרך החלק העליון של הגולגולת לאורך קו אמצע בין העיניים עם מספרי איריס. הסר את הקודקודית וצלחות עצם הפרונטלית ידי הטיית צד אחד של לוחית עצם בכל פעם ומאכל את זה עם פינצטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להטות את המוח כלפי מעלה מהחלק הקדמי עם פינצטה וחותכי עצבי הראייה ואת עצבי גולגולת אחרים. הרם בעדינות את המוח מתוך הגולגולת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את המוח לתוך מטריצת מוח עטרת עכבר. פורסים את המוח לחתיכות 3 כ 4 מ&quot;מ עם סכין גילוח נוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את פרוסות לתוך פתרון 4% PFA דגירה O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוח העברהפרוסות DEPC שטופלו 20% תמיסת סוכרוז דגירה O / N ב 4 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח כל פרוסת מוח לתוך cryomould יבש, להקיף עם מדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלי (אוקטובר) ו הקפאת קרח יבש. חנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. Cryosectioning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 15 מיקרומטר חלקים של הרקמה הקפואה בתוך cryostat ולאסוף את החלקים על גבי שקופיות מיקרוסקופ. במידת הצורך, להרטיב את החלקים עם PBS DEPC שטופלו ולשטח אותם עם מכחול בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את השקופיות להתייבש במשך כ 1 hr על מנת להבטיח כי הרקמה שומרת על השקופית. </li></ol> הכלאה 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 65 ° C לשטוף חיץ: 150 מ&quot;מ NaCl, 15 מ&quot;מ Na 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= נתרן ציטרט מלוחים 1x), 50% (v / v) לפוראמיד ו -0.1% (v / v) Tween- 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ MABT: 100 חומצה maleic מ&quot;מ, 150 מ&quot;מ NaCl, 0.1% (v / v) Tween-20, pH 7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את שתי חלליות (DIG שכותרתו FITC-Labelleד) 1 / 1,000 במאגר הכלאה מחומם מראש ל 65 מעלות צלזיוס ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בסביבות 300 μl של תערובת הכלאה על כל שקופית, coverslipwith אפויים בתנור (200 מעלות צלסיוס) coverslips דגירה O / N ב 65 מעלות צלזיוס בתא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות לתוך צנצנת Coplin המכיל חיץ לשטוף מחומם מראש. שטפו את השקופיות למשך 30 דקות פעמיים ב 65 מעלות צלזיוס עם חיץ לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות עבור 10 דקות שלוש פעמים עם MABT ב RT. </li></ol> ויזואליזציה 5. של החללית FITC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין חיץ חסימה שאני עורך: MABT עם מגיב חסימת 2% ו -10% בסרום כבשי חום מומת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: להשתמש בעט הידרופובי לצייר עיגולים סביב קטעי רקמה בשקופית כדי לצמצם את היקף פתרונות נוגדנים הנדרשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות במשך שעה 1 ב RT עם ISH חיץ חסימת בתא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות O / N ב 4 ° C עם peroxidase חזרת (POD) - המצומדנוגדן אנטי FITC ד בדילול 1/500 (v / v) ב ISH חסימת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות לתוך צנצנת Coplin המכיל PBS עם 0.1% (v / v) Tween-20 (PBST). לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות ב PBST ולהחליף PBST טרי בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני השימוש, להכין את tyramide ניאון על ידי דילול 100 פעמים לתוך diluent הגברה. בדוגמה זו, השתמש FITC-tyramide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את זה את השקופיות ולהשאיר למשך 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות לתוך צנצנת Coplin לשטוף 3 פעמים ב PBST במשך 10 דקות. </li></ol> ויזואליזציה 6. של החללית DIG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 0.1 M כמה העצוב HCl pH 8.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת השקופיות עם חיץ חסימה שאני עורך עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות O / N ב 4 ° C עם phosphatase אלקליין (AP), מצומדות נוגדן אנטי DIG בדילול 1/1500 (v / v) ב ISH חסימת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם MABT במשך 10 דקות שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם 0.1 M Tris-HCl pH 8.2 במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">מייד לפני השימוש, להכין פתרון אדום מהיר על ידי המס את הטבליות 0.1 M טריס pH 8.2. סנן את הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת השקופיות ב 37 ° C עם פתרון אדום מהיר בתא humidified. ככל שהזמן לפיתוח אופטימלי משתנה, לבדוק את השקופיות באופן קבוע באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח על היווצרות של המשקע. בדוגמה זו, לעצור את התגובה לאחר 2 - 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBST במשך 10 דקות שלוש פעמים. </li></ol> 7. אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ חסימת IHC: 10% (V / V) בסרום (מזן אחר לארח נוגדן ראשוני) ב PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות עם IHC חסימת חיץ במשך שעה 1 ב RT בתא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין נוגדן ראשוני: לדלל את הנוגדן הראשוני על דילול מתאים ב PBST עם 5% בסרום (מזן אחר לארח נוגדן ראשוני). בדוגמה זו, השתמש נוגדן אנטי Olig2 הארנב 1/400 (v / v) דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">מדגירים את הפתרון נוגדן ראשוני על 4 מעלות CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBST במשך 10 דקות שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן נוגדנים משני: לדלל נוגדנים משני fluorophore מצומדות ב דילול מתאים ב PBST עם 5% (v / v) בסרום (מזן אחר לארח נוגדן ראשוני) ו -0.1% (v / v) Hoechst 33258. לדוגמה זה , להשתמש חמור ארנבת אנטי Alexa647 נוגדנים משני ב 1 / 1,000 (v / v) דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגירים את הפתרון נוגדנים משני ב RT עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBST במשך 10 דקות שלוש פעמים. </li></ol> שמה 8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקית לייבש את השקופיות ב RT, ולעגן עם הרכבה בינוני קרינה. השאירו את השקופיות להתייבש ואז התמונה מיקרוסקופ confocal תחת 10X, 20X ו 63X מטרות באמצעות 4 ערוצים שונים עם אורכי גל עירור הבאים: 570 ננומטר עבור Fast האדום, 488 ננומטר עבור FITC, 647 ננומטר עבור immunolabelling Olig2 ו -350 ננומטר עבור Hoechst . </li></ol>

<ol>
	<li>Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+as+intrinsic+components+of+non-cell-autonomous+neurodegenerative+disease.">Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).</li><li>Baslow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylaspartate+in+the+vertebrate+brain:+metabolism+and+function.">N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function.</a> Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).</li><li>Hoshino, H., Kubota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canavan+disease:+clinical+features+and+recent+advances+in+research.">Canavan disease: clinical features and recent advances in research.</a> Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).</li><li>Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+the+human+aspartoacylase+cDNA+and+a+common+missense+mutation+in+Canavan+disease.">Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease.</a> Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).</li><li>Divry, P., Mathieu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartoacylase+deficiency+and+N-acetylaspartic+aciduria+in+patients+with+Canavan+disease.">Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease.</a> Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).</li><li>Bartalini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+diagnosis+of+Canavan+disease.">Biochemical diagnosis of Canavan disease.</a> Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).</li><li>Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylaspartate+in+the+CNS:+from+neurodiagnostics+to+neurobiology.">N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology.</a> Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).</li><li>D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occurrence+of+N-acetylaspartate+amidohydrolase+(aminoacylase+II)+in+the+developing+rat.">The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat.</a> J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).</li><li>Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+regional+distribution+of+aspartoacylase+in+rat+brain+tissue.">Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue.</a> J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).</li><li>Sommer, A., Sass, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+aspartoacylase+(ASPA)+and+Canavan.">Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan.</a> Gene. 505 (2), 206-210 (2012).</li><li>Klugmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+distribution+of+aspartoacylase+in+the+postnatal+rat+brain.">Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain.</a> Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).</li><li>Madhavarao, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+aspartoacylase+in+the+rat+central+nervous+system.">Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system.</a> J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).</li><li>Hershfield, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartoacylase+is+a+regulated+nuclear-cytoplasmic+enzyme.">Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme.</a> Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).</li><li>Moffett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+aspartoacylase+expression+in+the+rat+central+nervous+system.">Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system.</a> Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).</li><li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartoacylase+is+restricted+primarily+to+myelin+synthesizing+cells+in+the+CNS:+therapeutic+implications+for+Canavan+disease.">Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease.</a> Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).</li><li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+increase+of+aspartoacylase+in+oligodendrocytes+parallels+CNS+myelination.">Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination.</a> Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia,+neurons,+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex.">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

פרוטוקול זה מספק הליך צעד-אחר-צעד עבור RNA כפול הכלאה באתרו ואחריו immunostaining. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לאשר Aspa מתבטא oligodendrocytes בוגרת בכמה אזורים במוח. יש הליך רב שלבים זה בעיות פוטנציאליות רבות שיכולים להשפיע רגישות וכן יש להימנע. ראשית, כל הפתרונות ואת מאגרים לאחסון התגובה שעתוק צריך להיות RNase חינם. שנית, הבחירה של תבניות cDNA חשובה ואנחנו מעדיפים תבניות כ 1KB באורך. יש צורך לנקות את תבניות cDNA עם מיצוי פנול / כלורופורם מחדש לזרז אותם לפני שעתוק במבחנה. בנוסף, התעתיק של החללית צריך להיות אופטימלי; אם החללית אינה מיוצרת בכמות מספקת, היא תפחית את האיכות שאני עורך. האיכות של החללית ניתן לבדוק על ידי בחינה אותו על ג&#39;ל agarose ואיכות טובה תהיהשמעיד הבהירות החזקה של להקת הבדיקה לעומת להקת התבנית (איור 2). לקבלה שאני עורך כפול, שתי בדיקות שכותרתו שונה משמשות, בדרך כלל אחד שכותרתו עם DIG ושני עם FITC. החללית שכותרתו FITC נחשבת המעטה לגילוי ו צריך להיבחר שבו mRNA היעד צפוי להיות גבוה ביותר בתוך הרקמה. בדיקה זו היא בדרך כלל פתחה לראשונה את החללית שכותרתו DIG מפותחת שנייה. עוד צעד קריטי הוא הכנה רקמות. עכברים הם perfused עם DEPC שטופלו PBS ואחריו PFA 4%, שלאחר קבוע PFA 4% O / N ואז cryoprotected בפתרונות סוכרוז 20% כי כבר DEPC שטופלו להרוס כל RNase שיורית. זמן קיבוע חשוב מאוד; יתר או תת-קיבעון יכול להוביל אות חלשה, אולי בגלל חדירת בדיקה מופחתת (יתר הקיבוע) או שפלה של mRNA (תחת קיבוע). הרקמה היא cryosectioned אז שתי חלליות הם כלת O / N. לפוראמידהשתמש במאגר הכלאה צריך להיות לא מיונן. שיקול חשוב מאוד במהלך כלת O / N ב 65 C הוא כדי למנוע אידוי וריכוז של תערובת ההכלאה כיוון שהוא עלול לסכן רגישות. בניסוי המתואר ביצענו הכלאה ב 65 CO / N, אבל זה יכול להיות שווה לנסות בטמפרטורות נמוכות יותר עבור בדיקות שונות אם זה נראה קשה לזהות את ה- mRNA היעד. יש בחירה של חומרים כימיים לגילוי חלליות ההכלאה. אדום מהיר הוא מגיב ניאון רגיש אבל לא כל אצוות של אדום מהיר יביא לתוצאה הזהה. הוא זקוק AP לפיתוח ונותן קרינה עם עירור rhodamine. מניסיוננו, חשוב לעשות את זה טרי עם 0.1 M Tris-HCl pH 8.2 ולסנן אותו לפני השימוש. כתב אופציה לא ניאון הוא פיתוח צבע עם ניטרו-כחול tetrazolium (NBT) ו 5-bromo-4-כלורו-3&#39;-indolyphosphate (BCIP) אשר עובד עם אותו נוגדן AP מצומדות. Anoאפשרות יס היא באמצעות tyramide פלורסנט לגילוי. בעוד שמערכות tyramide פלורסנט אינן השיטות הרגישות ביותר, תגובת הפיתוח עם peroxidase חזרת מאוד מהירה ויש לפחות שלושה צבעי ניאון (FITC, Cyanine 3 ו Cyanine 5), שניתן להשתמש בם. הגבלה של פרוטוקול זה היא שחלק אנטיגנים היעד (או אפיטופים), במיוחד חלבונים שפע נמוך, ייתכן שלא ניתן יהיה לקלוט לאחר תהליך שאני עורך ומכאן אינם מתאימים IHC לאחר שאני עורך. בשנת immunostaining שלנו, זיהוי הנוגדן של Olig2 מופיע מעושה. המשתמש יצטרך לבחור את הנוגדן המתאים immunolabelling שאני ערך הבא. IHC ו שאני עורך משמשים טכניקות נפוצות ללימודי דפוס ביטוי גנים, ושניהם יש יתרונות וחסרונות. IHC היא שיטה רגישה מאוד לזיהוי הביטוי התאי של גנים חלקים במוח, אבל הסתמכותו על הנוגדן משפיע הספציפיות שלו ומגביל את תחולתו. בניגוד לכך, שאני עורך יש spec גבוהificity ואת החללית של כל גן יכול להיות מסונתז בקלות על ידי שעתוק במבחנה באמצעות cDNA גן ספציפי כתבנית. הפרוטוקול שפתחנו מנצל בשתי השיטות, שילוב שאני עורך כפול עם IHC להשיג זיהוי משולש של ביטוי גנים עם סגוליות גבוהות. בקיצור, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר מכתים במקביל של שני תעתיקים וחלבון אחד, כך שהוא מספק כלי שימושי אשר ימחיש ביטוי גנים-מקומי שיתוף. למרות העובדה כי ביטוי mRNA לא תמיד לתאם עם ביטוי חלבון, שאני עורך היא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת לנו לבחון ביטוי גנים עם סגוליות גבוהה. הפרוטוקול שלנו של ISH קרינה הכפולה משולבת עם IHC הוכיח להיות הצלחה באיתור ביטוי Aspa משנה של oligodendrocytes ברקמת המוח של עכברים בוגרים, וזה יכול בקלות להיות מותאם עבור מגוון רחב של רקמות ממוצא שונה שלב התפתחות. בנוסף, פרוטוקול זהגם יכול לשמש לזיהוי ביטוי RNA הקטן כגון מירנה.

תאי גלייה, אשר הוא התאים הנפוצים ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS), מהווים oligodendrocytes (תאי myelinating של CNS), מבשרי oligodendrocytes (OPS, הידוע גם בשם &quot;תאי NG2&quot;), האסטרוציטים ו microglia. יש עניין הולך וגובר את הפונקציות של תאי גלייה ותפקידים הפוטנציאל שלהם במחלות נוירולוגיות 1. לדוגמה, מחלת קנבן (CD) היא הפרעה תורשתית ניוונית של מערכת העצבים מתחיל מוקדם בינקות עם leukodystrophy ע&quot;ש וכן אובדן מתמשך של נוירונים, המובילה למוות בדרך כלל לפני גיל 10 2,3. מוטציות בגן Aspartoacyclase (ASPA) שמובילות באופן דרסטי פעילות ASPA 4 ב CD זוהה. ASPA הוא אנזים catalysing deacetylation של N-acetylaspartate (NAA), מולקולה מאוד מרוכז במוח, אצטט שהניבו ו aspartate 5-7. חולי CD רבים מראים רמות גבוהות יותר של NAA בשל חוסר ASPA activity. כמה מחקרים משער כי יצטט נגזרות NAA יכול להיות מקור עיקרי של חומצות שומן / שומנים במוח במהלך פיתוח CD לנבוע ירד סינתזה המיאלין במהלך ההתפתחות שנגרמה על ידי הכישלון של NAA להיות מפורק 3,5,6. ASPA נמצא בעיקר בכליות, בכבד בחומר הלבן של המוח, ולנוכח התפקיד החשוב של ASPA ב CD, הביטוי התאי של אנזים זה במוח נחקרה על ידי מספר מעבדות. על ידי הסתכלות על הפעילות האנזימטית ASPA במוח, מחקרים קודמים מצאו כי העלייה בפעילות ASPA במהלך התפתחות המוח מקביל את מהלך הזמן של מעטפת המיאלין 8-10. ברמה התאית, מבחני עבור הפעילות האנזימטית וכן הכלאה באתרו (שאני עורך) אימונוהיסטוכימיה (IHC) ניתוחי מראים כי ASPA מתבטאת בעיקר oligodendrocytes במוח אבל לא בנוירונים או האסטרוציטים 11-16. מספר מחקרים מצאו כי ASPA אולי גםלהתבטא microglia במערכת העצבים המרכזית 12,14. אז נתונים כה על הביטוי ASPA ב OPS מוגבלים. על פי מחקר שנערך לא מכבר ובו transcriptomes של תאים מסוגים שונים בקליפת המוח העכבר כולל נוירונים, האסטרוציטים, OPS, oligodendrocytes שהוקמה זה עתה, oligodendrocytes myelinating, microglia, תאי אנדותל, ואת pericytes נותחו על ידי רצף RNA 17, ASPA מתבטא באופן בלעדי oligodendrocytes , בפרט ב myelinating oligodendrocytes (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). למרות המחקרים הללו על דפוס הביטוי ASPA במוח, מספר הוודאות להישאר. ניתן להשתמש בטכניקות שונות כדי ללמוד דפוסי ביטוי גנים. IHC היא שיטה נפוצה לאיתור המוצר הפונקציונלי (כלומר, חלבון) של ביטוי גנים בסעיפי רקמות. למרות השירות שלה גדול, טכניקה זו יש מגבלות כיישום והספציפי שלה כפופה to הזמינה הספציפי של הנוגדן הצורך. לשם השוואה, שאני עורך יש את היתרון של להיות מסוגל לחשוף את הביטוי של כל גן ברמת mRNA. עם זאת, זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית להשתמש כמה בדיקות בו זמנית על מנת למקם ביטוי גני סוגי תאים ספציפיים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול המשלב RNA קרינה הכפולה הכלאה באתרו עם הקרינה immunolabelling של חלבון. השתמשנו זו קבוצה של טכניקות כדי לבחון את דפוס הביטוי של Aspa במוח העכבר. שיטה זו מאפשרת המחקר המדויק של ביטוי גנים באמצעות מיקרוסקופ confocal.

<table><tbody><tr><td>QIAprep Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Deionized formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>for ISH blocking buffer</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>VWR International</td><td>20252.290</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td><td>Sigma</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA</td><td>Roche</td><td>10109495001</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhardt&#039;s solution</td><td>Life Technologies</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Aspa cDNA clone</td><td>Source Bioscience</td><td>IRAVp968C0654D</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Equilibrated phenol</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl alcohol</td><td>Aldrich</td><td>496200</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR International</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>Promega</td><td>P4074</td><td></td></tr><tr><td>Transcription buffer</td><td>Promega</td><td>P118B</td><td></td></tr><tr><td>100 mM DTT</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>UTP-DIG NTP mix</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Fisher scientific</td><td>005479470</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>59378</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbitone</td><td>Animalcare Ltd</td><td>BN43054</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>25 gauge needle</td><td>Terumo</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Cole-Parmer Instrument Co. Ltd</td><td>WZ-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors</td><td>Weiss</td><td>103227</td><td></td></tr><tr><td>No.2 tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>500230</td><td></td></tr><tr><td>Coronal Brain Matrix</td><td>World Precision Instruments</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Personna Medical</td><td>PERS60-0138</td><td></td></tr><tr><td>OCT medium</td><td>Tissue tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat/microtome</td><td>Bright</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>for 65 &amp;deg;C wash buffer</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR International</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Smith Scientific Ltd</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Heat-inactivated sheep serum</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic pen</td><td>Cosmo Bio</td><td>DAI-PAP-S</td><td>1:500</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-FITC POD-conjugated antibody</td><td>Roche</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>TSA&amp;trade; Plus Fluorescein System</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>1:1,500</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-DIG AP-conjugated</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Fast red tablets</td><td>Roche</td><td>11496549001</td><td></td></tr><tr><td>.22 &amp;micro;M filter</td><td>Millex</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Olig2 Rabbit antbody</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 647-conjugated &amp;alpha;-rabbit antibody</td><td>Life technologies</td><td>A-31573</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33258</td><td>sigma</td><td>B2883</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 confocal microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combining double fluorescence in situ hybridization with immunolabelling for detection of the expression of three genes in mouse brain sections

איתור של ביטוי גני סוגים שונים של תאים במוח למשל, נוירונים, האסטרוציטים, oligodendrocytes, מבשרי oligodendrocyte ו microglia, ניתן הקשה על ידי חוסר נוגדנים ספציפיים ראשוניים או משניים עבור immunostaining. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזהות את הביטוי של שלושה גנים שונים באותו סעיף המוח באמצעות קרינה כפולה הכלאה באתרו עם שתי חלליות גן ספציפי ואחריו immunostaining עם נוגדן של סגוליות גבוהות המכוונות נגד החלבון מקודד על ידי גן שלישי. Aspartoacyclase (ASPA) הגן, מוטציות של מה שעלולות להוביל מחל חומר לבנה אנושית נדירה - מחלת קנבן - נחשב להתבטא oligodendrocytes ו microglia אבל לא האסטרוציטים ונוירונים. עם זאת, את דפוס הביטוי המדויק של ASPA במוח טרם הוקם. פרוטוקול זה אפשר לנו לקבוע כי ASPA מתבטא קבוצת משנה של oligodendrocytes הבוגרתnd זה יכול להיות מיושם בדרך כלל מגוון רחב של מחקרי דפוס ביטוי גנים.

מאמר זה מתאר שיטה עבור ISH קרינה כפולה ואחריו immunolabelling בסעיפים במוח עכבר. להלן תיאור קצר של פרוטוקול זה מוצג באיור 1. הצעד הראשון היה לסנתז בדיקות ספציפיות כדי Aspa ו MBP (חלבון המיאלין הבסיסי). כדי לבדוק כי הבדיקות היו מסונתזות, aliquot קטן של כל תגובה נדרס על ג&#39;ל agarose. התבנית ליניארי הקלושה וכמות גדולה של חללית RNA ניתן לראות (איור 2). שאני עורך הקרינה זוגי Aspa ו MBP, ואחריו immunolabelling Olig2 ו Hoechst מכתים גרעיני, בוצע על חלקים במוח העכבר. סרקנו את סעיפי מוח מיקרוסקופ confocal ותפרו את התמונות יחד כדי לחשוף את חלוקת אותות ביטוי גנים במוח. ביטוי Aspa ב -positive MBP (MBP +) תאים נצפו לאורך החזייה<html> ב (איור 3). גם בדקנו ביטוי Aspa במבנים שונים במוח באמצעות גדלה גבוהה. Aspa ביטוי oligodendrocytes ב callosum קליפת קורפוס מוצגים באיור 4. את שיתוף לוקליזציה של MBP, Olig2, ו Aspa עולה כי Aspa מתבטא משנה של oligodendrocytes בוגרת בקליפת ואת כפיס המוח (איור 4). תוצאות אלו מראות כי בפרוטוקול זה יכול לזהות את הביטוי בו זמני של שלושה גנים שונים חלקים במוח. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53976/53976fig1.jpg" /> פרוטוקול באיור 1. לכפיל הקרינה הכלאה באתרו ואחריו Immunostaining. פרוטוקול זה פועל מעל 5 ימים ומזהה את הביטוי של שלושה גנים./files/ftp_upload/53976/53976fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53976/53976fig2.jpg" /> איור 2. בחינת Aspa RNA Probe על Agarose ג&#39;ל. התבנית לינארית כמות גדולה של החללית RNA של משקל מולקולרי נמוך יותר ניתן לצפות. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53976/53976fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53976/53976fig3.jpg" /> איור 3. קרינה זוגית ב כלאה באתרו עבור Aspa ו MBP בסעיפי מוח עכבר. </strong&gt; חלקים במוח נסרקו באמצעות מיקרוסקופ confocal ותמונות נתפרו יחד כדי להראות חלוקת Aspa (אדום) ו MBP (ירוק) במוח. סרגל קנה מידה:. 500 מיקרומטר <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53976/53976fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53976/53976fig4.jpg" /> ביטוי איור 4. Aspa ב Oligodendrocytes בקליפה ואת כפיס המוח. פנלים להציג תמונות נציג שאני עורך עבור Aspa (אדום) ו MBP (ירוק) ואחריו immunostaining של Olig2 (כחול) בשילוב עם מכתים Hoechst. Aspa התבטא בכמה MBP + / Olig2 + תאים בקליפת (A ו- B) ובסופו של כפיס המוח (C ו- D). M<html> נ&quot;ב + / Olig2 + / Aspa + תאים מסומנים עם חצי MBP + / Olig2 + / Aspa - תאים מסומנים עם ראשי חץ של לוחות המוגדלים (B ו- D). ברי סולם: 100 מיקרומטר (A ו- C); 20 מיקרומטר (B ו- D). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53976/53976fig4large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="משלים איור 1" src="/files/ftp_upload/53976/53976supfig1.jpg" /> רצף משלים באיור 1. ומפת Aspa Clone (IRAVp968C0654D). רצף cDNA 1.5KB של Aspa הוכנס לתוך pCMV-Sport6 ​​פלסמיד (א). מפת פלסמיד pCMV-Sport6-Aspa מוצג (B).מ &#39;/ קבצים / ftp_upload / 53,976 / 53976supfig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Watch this Scientific Journal Video about Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections at JoVE.com

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

שילוב קרינה זוגית<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

13.1K Views.  University College London. Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Video: Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

שילוב של צבע lipophilic, באתרו</emהכלאה>, אימונוהיסטוכימיה ו היסטולוגיה

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are expressed in spatial relation to each other in situ. Multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) greatly facilitates the instant comparison of gene expression patterns, as it allows distinctive visualization of different mRNA species in contrasting colors in the same sample specimen. This provides the possibility to relate gene expression domains topographically to each other with high accuracy and to define unique and overlapping expression sites. In the presented protocol, we describe a MC-WISH procedure for comparing mRNA expression patterns of different genes in Drosophila embryos. Up to three RNA probes, each specific for another gene and labeled by a different hapten, are simultaneously hybridized to the embryo samples and subsequently detected by alkaline phosphatase-based colorimetric immunohistochemistry. The described procedure is detailed here for Drosophila, but works equally well with zebrafish embryos.

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

We describe a multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) procedure in intact Drosophila embryos allowing simultaneous and specific detection of three different mRNA distribution patterns by contrasting color precipitates.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Developmental Biology

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

פריימר לאימונוהיסטוכימיה על רקמות Cryosectioned מוח חולדה: דוגמא להכתמת Microglia ונוירונים

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by crossing the &#39;Tet-On&#39; system oTet-Cre mouse with a novel reverse tetracycline transactivator (rtTA) transgene linked to the Tert promoter, which we have demonstrated marks a novel population of adult brain stem cells. Here, administration of the tetracycline derivative doxycycline to mTert-rtTA::oTet-Cre mice will indelibly mark a population of cells that express a 4.4 kb fragment of the promoter region of the gene Tert. When combined the Rosa-mTmG reporter, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mice will express membrane tdTomato (mTomato) until doxycycline treatment induces the replacement of mTomato expression with membrane EGFP (mGFP) in cells that also express Tert. Therefore, when these triple-transgenic lineage tracing mice receive doxycycline (the &#34;pulse&#34; period during which TERT expressing cells are marked), these cells will become indelibly marked mGFP+ cells, which can be tracked for any desirable amount of time after doxycycline removal (the &#34;chase&#34; period), even if Tert expression is subsequently lost. Brains are then perfusion-fixed and processed for immunofluorescence and other downstream applications in order to interpret changes to stem cell activation, proliferation, lineage commitment, migration to various brain niches, and differentiation to mature cell types. Using this system, any rtTA mouse can be mated to oTet-Cre and a Rosa reporter to conduct doxycycline-inducible &#34;pulse-chase&#34; lineage&#160;tracing experiments using markers of stem cells.

The ability to permanently mark stem cells and their progeny with a fluorophore using an inducible transgenic lineage tracing mouse line allows for spatial and temporal analysis of activation, proliferation, migration, and/or differentiation in vivo. Lineage tracing can reveal novel information about lineage commitment, response to intervention(s), and multipotency.

מעקב אחר שושלת של תאי גזע בעלי תווית פלואורסצנטית אינדוקטיבית במוח העכבר הבוגר

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ within a given tissue remain limited. The EASI-FISH protocol described here has been adapted to detect the expression of dozens of genes in the intact adult Drosophila central nervous system (CNS) using commercially available reagents. This protocol includes a new gel formulation that enhances gel robustness, enabling multiple rounds of hybridization and allowing the embedding of multiple brains per gel. This improvement increases throughput, facilitates optimal comparison of experimental conditions, and reduces reagent costs. Additionally, by employing the GAL4-UAS system for co-detection of green fluorescent protein (GFP), gene expression can be visualized in specific neuronal or glial cell types. Notably, the high resolution achieved through expansion microscopy, combined with the sensitivity of the method, allows for the detection of single RNA transcripts. This approach effectively integrates high image quality with high throughput, making it a powerful tool for studying gene expression throughout the intact fly brain.

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) is a robust technique that combines expansion microscopy with fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect the expression of multiple genes in thick tissue. This protocol outlines recent advancements in the method and its adaptation for labeling the intact Drosophila central nervous system..

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative approaches are widely used to handle the tissue sections during the staining procedure, one approach consists of mounting the sections directly on glass slides, while a second approach, the free-floating, allows for fixed sections to be maintained and stained while suspended in solution. Although slide-mounted and free-floating approaches may yield similar results, the free-floating technique allows for better antibody penetration and thus should be the method of choice when thicker sections are to be used for 3D reconstruction of the tissues, for example when the focus of the experiment is to gain information on dendritic and axonal projections in brain regions. In addition, since the sections are kept in solution, a single aliquot can easily accommodate 30 to 40 sections, handling of which is less laborious, particularly in large-scale biomedical studies. Here, we illustrate how to apply the free-floating method to fluorescent immunohistochemistry staining, with a major focus on brain sections. We will also discuss how the free-floating technique can easily be modified to fit the individual needs of researchers and adapted to other tissues as well as other histochemical-based stainings, such as hematoxylin and eosin and cresyl violet, as long as tissue samples are properly fixed, typically with paraformaldehyde or formalin.

The free-floating technique allows researchers to perform histological-based stainings including immunohistochemistry on fixed tissue sections to visualize biological structures, cell type, and protein expression and localization. This is an efficient and reliable histochemical technique that can be useful for investigating a multitude of tissues, such as brain, heart, and liver.

כתמים היסטולוגיים באמצעות קטעי רקמה צפים חופשיים

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

Biology

 Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53976/combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling'>Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (2016).</a>This video demonstrates the use of double fluorescence in situ hybridization to visualize the expression of two RNA targets in mouse brain sections. The protocol involves sequential detection of RNA using probes labeled with fluorescein isothiocyanate and digoxigenin, followed by enzymatic signal amplification to enhance sensitivity. The resulting fluorescence enables co-localization analysis of the target RNAs within the tissue.

Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse ...

שילוב קרינה זוגית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video