Name: combining double fluorescence in situ hybridization with immunolabelling for detection of the expression of three genes in mouse brain sections
Uploaded: 2016-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections at JoVE.com

Work in the authors' laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, "Ideas" Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.

أخلاقيات الإعلان: الماوس تربية والتعامل معها هي وفقا للوائح المملكة المتحدة وزارة الداخلية والمبادئ التوجيهية لجنة الأخلاقيات كلية لندن الجامعية، والامتثال لقانون 1986 من المملكة المتحدة واللوائح التعديل لعام 2012 الحيوانات (الإجراءات العلمية). ملاحظة: يجب أن تكون جميع الحلول مع اثيل pyrocarbonate (DEPC) - المياه المعالجة لتدمير أي ريبونوكلياز المتبقية. لتلقي العلاج DEPC، إضافة DEPC (1 مل لكل لتر)، يهز بقوة حتى اختفت جميع الكريات DEPC ثم الأوتوكلاف إلى تدهور DEPC. 1. RNA التحقيق التجميعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنبيه: عند التعامل مع الفورماميد، وارتداء معدات الوقاية الشخصية (PPE) واستخدام خزانة السلامة. إعداد العازلة التهجين: الماء منزوع الأيونات مع 50٪ (ت / ت) منزوع الأيونات الفورماميد، 200 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي EDTA، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، المعالجة DEPC 5 ملي ناه 2 ص 4 و 5 ملي نا 2 هبو 4، 0.01 ملغ / الحمض الريبي النووي النقال الخميرة مل، 1 × soluti دينهارت لعلى، و 10٪ ث / ت ديكستران كبريتات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار استنساخ الحمض النووي الذي يحتوي على تسلسل كدنا] من الجين من الفائدة في البلازميد مع المروجين بوليميريز الحمض النووي الريبي. على سبيل المثال، استخدم نسخة pCMV-SPORT6، IRAVp968C0654D (بنك الجينات accessionBC024934)، مع T7 وSP6 RNA المروجين البلمرة لالإقليمين (الشكل التكميلي 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البلازميد خطي كقالب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو استنساخ الحمض النووي، واستخراج البلازميد مع نطاق صغير عدة تنقية البلازميد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة والتسلسل مع T7 والاشعال عالمية SP6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هضم 1020 ميكروغرام DNA البلازميد مع انزيم التقييد الذي يمر في نهاية 5 &#39;من حبلا معنى كدنا]. على سبيل المثال، استخدم 100 وحدة سال أنا لهضم البلازميد pCMV-SPORT6- الإقليمين. احتضان لمدة 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل قسامة صغيرة على هلام الاغاروز للتأكد من أن البلازميد هو خطي تماما. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقيةالبلازميد خطي باستخدام الفينول الكلوروفورم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10/01 حجم 3 M خلات الصوديوم، وحجم واحد من 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0) - الفينول معايرتها وحجم واحد من كلوروفورم / كحول أيزو أميلي (IAA) (24: 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة في RT (20 - 25 درجة مئوية، RT) واستخراج المرحلة المائية العليا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مجلد واحد من كلوروفورم / IAA، الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة، واستخراج المرحلة المائية العليا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 1.4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مجلدات من الايثانول وترك في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة أو O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 16000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه مع الايثانول البارد 70٪ وإعادة تعليق في تقريبي 1 ميكروغرام [كدنا في 2.5 ميكرولتر في TE (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 1 ملم EDTA 7.5 درجة الحموضة). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع تحقيقات اثنين، واحد المسمى مع Digoxigenin (DIG) والآخر مع ثيوسيانات فلوريسئين (FITC). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد البلمرة RNA المناسب لجعل مكافحة حد ذاتهاالتحقيق NSE (مكمل لهدف مرنا). على سبيل المثال، استخدام T7 RNA البلمرة لجعل ASPA التحقيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد في المختبر رد فعل النسخ: إضافة 1 ميكروغرام من الحمض النووي خطي، 4.0 ميكرولتر 5 العازلة النسخ س، 6.0 ميكرولتر من 100 ملي DTT، 2.0 ميكرولتر من 10X DIG أو FITC RNA وضع العلامات مزيج يحتوي على dNTPs، 1 ميكرولتر ريبونوكلياز المانع، و20 - 40 وحدات البلمرة RNA. جعل الحجم النهائي يصل إلى 20 ميكرولتر مع المياه المعالجة DEPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميكرولتر Run1 من رد فعل النسخ على هلام الاغاروز 1.0٪ للتحقق من أن رد الفعل عملت. يجب أن تظهر هلام القالب الخطي والفرقة مشرق لجنة التحقيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حجم ما يصل الى 100 ميكرولتر مع العازلة التهجين وتخزين 10 مكل في -80 درجة مئوية. </li></ol> 2. الإرواء، التثبيت ومجموعة الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنبيه: عند التعامل مع بارافورمالدهيد (PFA)، على حد سواء الصلبة ومائي، وارتداء معدات الوقاية الشخصية واستخدام خزانة السلامة. يعد حل الفورمالديهايد عن طريق إذابة 4٪ (ث / ت) PFA في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل باستخدام الحرارة (55 درجة مئوية). تصفية حل الفورمالديهايد مع ورق الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول السكروز عن طريق إذابة 20٪ (ث / ت) السكروز في الماء المقطر وإضافة 0.1٪ (ت / ت) الحل DEPC. ترك O / N في RT مع غطاء فضفاض ثم الأوتوكلاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الميؤوس تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من بنتوباربيتون (50 ملغ / كلغ). تقييم عمق التخدير عن طريق قرصة أخمص قدميها، وغياب المنعكس انسحاب يشير التخدير العميق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبمجرد أن الفأر هو تحت التخدير العميق، وجعل شق تحت القفص الصدري وقطع طريق القفص الصدري على كلا الجانبين، ورفعه لفضح القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال ابرة 25-G إلى البطين الأيسر للقلب. إجراء شق صغير في الأذين الأيمن من القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي هذا الحيوان مع 20 مل PBS ثم حل الفورمالديهايد 40 مل. لP30 وكبار السنالفئران، استخدام معدل نضح من 12 مل / دقيقة ولكن للحيوانات الشابة استخدام معدل أقل (7-10 مل / دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الدماغ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الفأر مع مقص جراحي عن طريق جعل الخلفي قطع من الأذنين. جعل شق خط الوسط الذيلية في الجلد والعمل rostrally لإزالة الجلد من الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدءا من الجزء الذيلية، وقطع من خلال الجزء العلوي من الجمجمة على طول خط الوسط وبين العينين مع مقص القزحية. إزالة الجدارية واللوحات العظام الأمامية عن طريق إمالة جانب واحد من لوحة العظام في كل مرة والعض تشغيله مع ملاقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إمالة بلطف الدماغ أعلى من الجزء الأمامي مع ملاقط وقطع الأعصاب البصرية وغيرها من أعصاب في الجمجمة. رفع بلطف الدماغ من الجمجمة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الدماغ في الماوس الاكليلية مصفوفة الدماغ. شريحة الدماغ إلى 3 حوالي 4 قطع ملم بشفرة الحلاقة ريشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشرائح في 4٪ حل PFA واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الدماغشرائح لDEPC المعالجة 20٪ محلول السكروز واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل شريحة الدماغ إلى cryomould الجافة، تحيط مع أفضل درجة حرارة القطع (أكتوبر) المتوسطة وتجميد الثلج الجاف. تخزين في -80 درجة مئوية. </li></ol> 3. Cryosectioning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 15 ميكرومتر أقسام الأنسجة المجمدة في ناظم البرد وجمع المقاطع على الشرائح المجهر. إذا لزم الأمر، والرطب الأقسام مع المعالجة DEPC برنامج تلفزيوني وتسحقهم مع الفرشاة الجميلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الشرائح لتجف لمدة حوالي 1 ساعة للتأكد من أن الأنسجة تلتزم الشريحة. </li></ol> 4. التهجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 65 ° C غسل العازلة: 150 مم كلوريد الصوديوم، و 15 ملي نا 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= 1X المالحة الصوديوم سترات)، 50٪ (ت / ت) الفورماميد و 0.1٪ (ت / ت) Tween- 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد MABT عازلة: 100 ملم حمض الماليك، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0.1٪ (ت / ت) توين-20، ودرجة الحموضة 7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع تحقيقات اثنين (DIG-وصفت وFITC-ابيلد) 1/1000 في المخزن التهجين قبل تحسنت إلى 65 درجة مئوية، وتخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 300 ميكرولتر من خليط التهجين على كل شريحة، coverslipwith (C 200 س) coverslips فرن خبز واحتضان O / N عند 65 درجة مئوية في غرفة ترطيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشرائح في جرة Coplin تحتوي على غسل العازلة قبل تحسنت. تغسل الشرائح لمدة 30 دقيقة مرتين في 65 درجة مئوية مع غسل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات مع MABT في RT. </li></ol> 5. التصور FITC التحقيق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عازلة تمنع ISH: MABT مع 2٪ عرقلة كاشف و 10٪ الحرارة المعطل مصل الأغنام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: استخدام قلم مسعور لرسم الدوائر حول أقسام الأنسجة على الشريحة للحد من حجم الحلول الأجسام المضادة المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح لمدة 1 ساعة على RT مع ISH حظر عازلة في غرفة ترطيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح O / N عند 4 درجات مئوية مع البيروكسيديز الفجل (POD) - المترافقةد مكافحة FITC الأجسام المضادة المخفف 1/500 (ت / ت) عازلة في ISH الحجب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشرائح في وعاء Coplin تحتوي على برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ (ت / ت) توين-20 (PBST). يغسل 3 مرات لمدة 10 دقيقة في PBST واستبدالها مع PBST جديد في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة قبل الاستعمال، وإعداد tyramide الفلورسنت من خلال تمييع 100 مرة في مخفف التضخيم. على سبيل المثال، استخدام FITC-tyramide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذا إضافة إلى الشرائح وتترك لمدة 10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشرائح في وعاء Coplin ويغسل 3 مرات في PBST لمدة 10 دقيقة. </li></ol> 6. التصور DIG التحقيق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 0.1 M Tris- حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح العازلة مع ISH حجب لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح O / N عند 4 درجات مئوية مع الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) -conjugated-DIG مكافحة الأجسام المضادة المخفف 1/1500 (ت / ت) عازلة في ISH الحجب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع MABT لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرتين مع 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.2 لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">مباشرة قبل الاستعمال، وإعداد حل الأحمر السريع عن طريق إذابة أقراص في 0.1 م تريس درجة الحموضة 8.2. تصفية حل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية مع حل سريع الأحمر في غرفة ترطيب. كما يختلف الوقت للنماء، والتحقق من الشرائح بانتظام مع المجهر الفلورسنت لمراقبة تشكيل راسب. على سبيل المثال، والتوقف عن رد الفعل بعد 2-3 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل PBST لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات. </li></ol> 7. المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد IHC عازلة حظر: 10٪ (ت / ت) في مصل الدم (من الأنواع المختلفة لاستضافة الأجسام المضادة الأولية) في PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح مع IHC عازلة تمنع لمدة 1 ساعة على RT في غرفة ترطيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأجسام المضادة الأولية: تمييع الأجسام المضادة الأولية في التخفيف المناسبة في PBST مع 5٪ مصل (من الأنواع المختلفة لاستضافة الأجسام المضادة الأولية). على سبيل المثال، استخدام أرنب مكافحة Olig2 الأجسام المضادة في 1/400 (/ ت ت) التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">احتضان في حل الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل PBST لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأجسام المضادة الثانوية: تمييع الضد الثانوي fluorophore مترافق في التخفيف المناسبة في PBST مع 5٪ (ت / ت) في مصل الدم (من الأنواع المختلفة لاستضافة الأجسام المضادة الأولية) و 0.1٪ (ت / ت) هويشت 33258. على سبيل المثال ، استخدم حمار المضادة للأرنب Alexa647 الضد الثانوية في 1/1000 (/ ت ت) التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في حل الضد الثانوية في RT لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل PBST لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات. </li></ol> 8. تركيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجف جزئيا الشرائح في RT، وجبل مع تصاعد المتوسط ​​مضان. ترك الشرائح لتجف ثم الصورة في المجهر متحد البؤر تحت 10X، 20X و63X الأهداف باستخدام 4 قنوات مختلفة مع موجات الإثارة التالية: 570 نانومتر للأحمر سريع، 488 نانومتر لFITC، 647 نانومتر لOlig2 immunolabelling و 350 نانومتر للهويشت . </li></ol>

<ol>
	<li>Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+as+intrinsic+components+of+non-cell-autonomous+neurodegenerative+disease.">Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).</li><li>Baslow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylaspartate+in+the+vertebrate+brain:+metabolism+and+function.">N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function.</a> Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).</li><li>Hoshino, H., Kubota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canavan+disease:+clinical+features+and+recent+advances+in+research.">Canavan disease: clinical features and recent advances in research.</a> Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).</li><li>Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+the+human+aspartoacylase+cDNA+and+a+common+missense+mutation+in+Canavan+disease.">Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease.</a> Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).</li><li>Divry, P., Mathieu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartoacylase+deficiency+and+N-acetylaspartic+aciduria+in+patients+with+Canavan+disease.">Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease.</a> Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).</li><li>Bartalini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+diagnosis+of+Canavan+disease.">Biochemical diagnosis of Canavan disease.</a> Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).</li><li>Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylaspartate+in+the+CNS:+from+neurodiagnostics+to+neurobiology.">N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology.</a> Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).</li><li>D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occurrence+of+N-acetylaspartate+amidohydrolase+(aminoacylase+II)+in+the+developing+rat.">The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat.</a> J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).</li><li>Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+regional+distribution+of+aspartoacylase+in+rat+brain+tissue.">Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue.</a> J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).</li><li>Sommer, A., Sass, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+aspartoacylase+(ASPA)+and+Canavan.">Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan.</a> Gene. 505 (2), 206-210 (2012).</li><li>Klugmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+distribution+of+aspartoacylase+in+the+postnatal+rat+brain.">Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain.</a> Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).</li><li>Madhavarao, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+aspartoacylase+in+the+rat+central+nervous+system.">Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system.</a> J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).</li><li>Hershfield, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartoacylase+is+a+regulated+nuclear-cytoplasmic+enzyme.">Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme.</a> Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).</li><li>Moffett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+aspartoacylase+expression+in+the+rat+central+nervous+system.">Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system.</a> Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).</li><li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartoacylase+is+restricted+primarily+to+myelin+synthesizing+cells+in+the+CNS:+therapeutic+implications+for+Canavan+disease.">Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease.</a> Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).</li><li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+increase+of+aspartoacylase+in+oligodendrocytes+parallels+CNS+myelination.">Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination.</a> Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia,+neurons,+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex.">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

يوفر هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة لRNA المزدوج في الموقع التهجين تليها المناعية. وقد استخدمنا هذا البروتوكول لتأكيد أن الإقليمين يعبر عنه قليلة التغصن ناضجة في العديد من مناطق الدماغ. هذا الإجراء متعددة الخطوات لديها كثير من المزالق المحتملة التي يمكن أن تؤثر على الحساسية ويجب تجنبها. أولا، يجب أن تكون خالية ريبونوكلياز كل الحلول ومخازن تخزين للتفاعل النسخ. الثانية، واختيار القوالب [كدنا مهم ونحن نفضل القوالب حوالي 1KB في الطول. فمن الضروري لتنظيف القوالب [كدنا مع الفينول / استخراج الكلوروفورم وإعادة يعجل لهم قبل النسخ في المختبر. بالإضافة إلى ذلك، النسخ لجنة التحقيق يجب أن يكون الأمثل. إذا لم يتم إنتاجها التحقيق بكميات كافية، وسوف يقلل من جودة ISH. نوعية التحقيق ويمكن التحقق من خلال دراسة على هلام الاغاروز وذات نوعية جيدة ستكونيتضح من سطوع قوي من الفرقة التحقيق بالمقارنة مع الفرقة قالب (الشكل 2). لISH المزدوج، وتستخدم تحقيقين صفت بشكل مختلف، عادة واحدة وصفت مع DIG والآخر مع FITC. يعتبر التحقيق FITC المسمى ليكون الأقل كشفها ويجب أن يتم اختياره حيث من المتوقع أن يكون أعلى في أنسجة مرنا الهدف. هذا التحقيق هو عادة أول من طور وضعت المسبار المسمى DIG الثانية. خطوة حاسمة أخرى هي إعداد الأنسجة. و perfused الفئران مع برنامج تلفزيوني DEPC معاملة تليها PFA 4٪، وظيفة ثابتة في 4٪ PFA O / N ثم cryoprotected في 20٪ حلول السكروز التي تم التعامل DEPC لتدمير أي ريبونوكلياز المتبقية. وقت التثبيت مهم جدا؛ الإفراط أو تحت تثبيت يمكن أن يؤدي إلى إشارة أضعف، وربما يرجع ذلك إلى انخفاض نسبة انتشار التحقيق (أكثر من التثبيت) أو تدهور مرنا (تحت تثبيت). ثم يتم cryosectioned الأنسجة، وتهجين تحقيقين O / N. والفورماميدالمستخدمة في المخزن المؤقت التهجين يجب المتأينة. وهناك اعتبار مهم جدا أثناء O / N التهجين في 65 ج هو تجنب التبخر وتركيز الخليط التهجين كما يمكن أن يقلل من حساسية. في تجربة وصفها أجرينا التهجين في 65 CO / N، ولكن قد يكون من المفيد محاولة درجات حرارة منخفضة للتحقيقات مختلفة لو أنه يبدو أن من الصعب الكشف عن مرنا الهدف. هناك خيار من الكواشف للكشف عن تحقيقات المهجنة. سريع الأحمر هو كاشف الفلورسنت حساس ولكن ليس كل دفعات من الأحمر سريع تعطي نفس النتيجة. انها تحتاج AP للتنمية ويعطي مضان مع الإثارة رودامين. في تجربتنا، فمن المهم لجعله جديدة مع 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.2 وتصفية قبل الاستخدام. وثمة خيار غير فلوري هو التنمية اللون مع نيترو الأزرق نتروبلو (NBT) و 5-برومو-4-كلورو-3&#39;-indolyphosphate (BCIP) الذي يعمل مع نفس الأجسام المضادة AP-مترافق. آنوالخيار ذر هو استخدام tyramide الفلورية للكشف. على الرغم من أن أنظمة tyramide الفلورسنت ليست هي الأساليب الأكثر حساسية، فإن رد الفعل النامية البيروكسيديز الفجل هو سريع جدا، وهناك على الأقل ثلاثة ألوان الفلورسنت (FITC، Cyanine 3 و Cyanine 5) التي يمكن استخدامها. وجود قيود على هذا البروتوكول هو أن بعض المستضدات الهدف (أو الحواتم)، وخاصة البروتينات وفرة منخفضة، قد لا يكون اكتشافها بعد عملية ISH، وبالتالي ليست مناسبة للIHC بعد ISH. في المناعية لدينا، والكشف عن الأجسام المضادة من Olig2 يبدو غير متأثر. سوف يحتاج المستخدم لاختيار الأجسام المضادة المناسب لimmunolabelling ISH التالية. تستخدم IHC وISH عادة تقنيات للدراسات نمط التعبير الجيني، وكلاهما إيجابيات وسلبيات. IHC هو طريقة حساسة للغاية للكشف عن التعبير الخلوية من الجينات في أقسام الدماغ، ولكن اعتمادها على الأجسام المضادة يؤثر على خصوصيته ويحد من استخدامه. على النقيض من ذلك، ISH لديها مواصفات عاليةificity والتحقيق في أي الجينات يمكن بسهولة أن تصنع عن طريق النسخ في المختبر باستخدام الجينات [كدنا محدد كقالب. البروتوكول الذي وضعنا يستفيد من كلتا الطريقتين، والجمع بين ISH المزدوج مع IHC إلى تحقيق كشف الثلاثي في ​​التعبير الجيني مع خصوصية عالية. وباختصار، فإن البروتوكول وصفنا هنا يمكن تلطيخ وقت واحد من اثنين من mRNAs واحد من البروتين، لذلك يوفر أداة مفيدة لتوضيح التعبير الجيني المترجمة التعاون. على الرغم من أن التعبير مرنا لا تتطابق دائما مع تعبير البروتين، ISH هي تقنية قوية تسمح لنا لدراسة التعبير الجيني مع خصوصية عالية. وقد ثبت لدينا بروتوكول للISH مضان مزدوج جنبا إلى جنب مع IHC أن يكون النجاح في الكشف عن التعبير الإقليمين في مجموعة فرعية من الخلايا قليلة التغصن في أنسجة المخ من فئران بالغة، وأنه يمكن أن تتكيف بسهولة لمجموعة متنوعة من الأنسجة من أصول مختلفة ومراحل النمو. وبالإضافة إلى ذلك، هذا البروتوكولويمكن أيضا أن تستخدم للكشف عن التعبير من الرنا الصغيرة مثل ميرنا.

تتكون الخلايا الدبقية، وهي الخلايا الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، قليلة التغصن (الخلايا myelinating من CNS)، قليلة التغصن السلائف (مكتب خدمات المشاريع، التي تعرف أيضا باسم &quot;خلايا NG2&quot;)، الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة. هناك اهتمام متزايد في وظائف الخلايا الدبقية وأدوارهم المحتملة في الأمراض العصبية 1. على سبيل المثال، مرض كانافان (CD) هو اضطراب وراثي الاعصاب تبدأ في مرحلة الطفولة مع حثل المادة البيضاء الإسفنجي والفقدان التدريجي للخلايا العصبية في وقت مبكر، مما يؤدي إلى الموت عادة قبل 10 سنة من العمر 2،3. طفرات في الجين Aspartoacyclase (ASPA) التي تؤدي إلى انخفاض شديد في النشاط ASPA 4 في مؤتمر نزع السلاح تم تحديدها. ASPA هو انزيم تحفيز deacetylation من N-acetylaspartate (NAA)، وهو جزيء تتركز بشكل كبير في الدماغ، وتوليد خلات واسبارتاتي 5-7. تظهر العديد من المرضى CD مستويات أعلى من ناه بسبب عدم وجود ASPA ميلانالناقلية. بعض الدراسات أن يخمن خلات المستمدة ناه-يمكن أن تكون مصدرا رئيسيا من الأحماض الدهنية / الدهون في الدماغ أثناء التطور ومؤتمر نزع السلاح قد تنجم عن انخفاض تركيب المايلين خلال تطوير الناجمة عن فشل ناه إلى تقسيمها 3،5،6. ASPA وجدت في الغالب في الكلى والكبد والمادة البيضاء في الدماغ، ونظرا للدور الهام من الإقليمين في مؤتمر نزع السلاح، وقد درس التعبير الخلوية من هذا الانزيم في الدماغ عن طريق عدة مختبرات. من خلال النظر في النشاط الأنزيمي ASPA في الدماغ، وجدت دراسات سابقة أن الزيادة في النشاط ASPA أثناء نمو المخ يوازي مدار الساعة من تكون الميالين 8-10. على المستوى الخلوي، المقايسات للنشاط الأنزيمي وكذلك الموقع التهجين (ISH) والمناعية (IHC) في التحليلات تشير إلى أن ASPA يعبر عنها بشكل رئيسي في الخلايا قليلة التغصن في الدماغ ولكن ليس في الخلايا العصبية أو الخلايا النجمية 11-16. وقد وجدت بعض الدراسات أن ASPA ربما أيضايمكن التعبير عنها في الخلايا الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي 12،14. بيانات حتى الآن على التعبير ASPA في مكتب خدمات المشاريع محدودة. وفقا لدراسة حديثة حيث تم تحليل ترنسكربيتوم من أنواع مختلفة من الخلايا في قشرة الدماغ الماوس بما في ذلك الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، مكتب خدمات المشاريع، قليلة التغصن التي شكلت حديثا، myelinating قليلة التغصن، الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا البطانية، وpericytes التي كتبها RNA التسلسل 17، وأعرب عن ASPA حصرا في الخلايا قليلة التغصن ، ولا سيما في myelinating قليلة التغصن (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). وعلى الرغم من هذه الدراسات على نمط التعبير ASPA في الدماغ، لا يزال هناك عدد من الشكوك. تقنيات مختلفة يمكن استخدامها لدراسة أنماط التعبير الجيني. IHC هو طريقة تستخدم عادة للكشف عن المنتجات وظيفية (أي البروتين) من التعبير الجيني في أقسام الأنسجة. وعلى الرغم من فائدتها كبيرة، وهذا الأسلوب له قيود تطبيقه وخصوصية ور تخضعس توافر ونوعية الأجسام المضادة اللازمة. وعلى سبيل المقارنة، ISH لديها ميزة كونها قادرة على الكشف عن التعبير عن أي الجينات على مستوى مرنا. ومع ذلك، فإنه يمكن أن يكون تحديا تقنيا لاستخدام عدة تحقيقات في نفس الوقت من أجل توطين التعبير الجيني لأنواع معينة من الخلايا. في هذه المقالة، نحن تصف بروتوكول الجمع مزدوج RNA مضان في الموقع التهجين مع immunolabelling مضان من البروتين. وقد استخدمنا هذه مجموعة من التقنيات لدراسة نمط التعبير عن الإقليمين في مخ الفأر. وتسمح هذه الطريقة دراسة دقيقة في التعبير الجيني باستخدام متحد البؤر المجهري.

<table><tbody><tr><td>QIAprep Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Deionized formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>for ISH blocking buffer</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>VWR International</td><td>20252.290</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td><td>Sigma</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA</td><td>Roche</td><td>10109495001</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhardt&#039;s solution</td><td>Life Technologies</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Aspa cDNA clone</td><td>Source Bioscience</td><td>IRAVp968C0654D</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Equilibrated phenol</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl alcohol</td><td>Aldrich</td><td>496200</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR International</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>Promega</td><td>P4074</td><td></td></tr><tr><td>Transcription buffer</td><td>Promega</td><td>P118B</td><td></td></tr><tr><td>100 mM DTT</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>UTP-DIG NTP mix</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Fisher scientific</td><td>005479470</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>59378</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbitone</td><td>Animalcare Ltd</td><td>BN43054</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>25 gauge needle</td><td>Terumo</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Cole-Parmer Instrument Co. Ltd</td><td>WZ-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors</td><td>Weiss</td><td>103227</td><td></td></tr><tr><td>No.2 tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>500230</td><td></td></tr><tr><td>Coronal Brain Matrix</td><td>World Precision Instruments</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Personna Medical</td><td>PERS60-0138</td><td></td></tr><tr><td>OCT medium</td><td>Tissue tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat/microtome</td><td>Bright</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>for 65 &amp;deg;C wash buffer</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR International</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Smith Scientific Ltd</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Heat-inactivated sheep serum</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic pen</td><td>Cosmo Bio</td><td>DAI-PAP-S</td><td>1:500</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-FITC POD-conjugated antibody</td><td>Roche</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>TSA&amp;trade; Plus Fluorescein System</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>1:1,500</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-DIG AP-conjugated</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Fast red tablets</td><td>Roche</td><td>11496549001</td><td></td></tr><tr><td>.22 &amp;micro;M filter</td><td>Millex</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Olig2 Rabbit antbody</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 647-conjugated &amp;alpha;-rabbit antibody</td><td>Life technologies</td><td>A-31573</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33258</td><td>sigma</td><td>B2883</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 confocal microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combining double fluorescence in situ hybridization with immunolabelling for detection of the expression of three genes in mouse brain sections

الكشف عن التعبير الجيني في أنواع مختلفة من خلايا الدماغ على سبيل المثال، الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، قليلة التغصن، السلائف دبقية قليلة التغصن والخلايا الدبقية الصغيرة، التي يمكن أن تعوق عدم وجود الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية محددة لالمناعية. نحن هنا تصف بروتوكول للكشف عن التعبير عن ثلاثة جينات مختلفة في قسم المخ نفسه باستخدام مضان مزدوجة في الموقع التهجين مع تحقيقين جينات محددة تليها المناعية مع الأجسام المضادة من نوعية عالية الموجهة ضد البروتين المشفرة بواسطة الجينات الثالث. ويعتقد أن يتم التعبير عنها قليلة التغصن والخلايا الدبقية الصغيرة ولكن ليس في الخلايا النجمية والخلايا العصبية - وAspartoacyclase (ASPA) الجينات، والطفرات التي يمكن أن تؤدي إلى مرض المادة البيضاء البشري النادر - مرض كانافان. ومع ذلك، لم يتم بعد تأسيس نمط التعبير الدقيق للASPA في الدماغ. وقد سمح لنا هذا البروتوكول لتحديد ما ASPA يتم التعبير في مجموعة فرعية من الخلايا قليلة التغصن ناضجة لالثانية يمكن تطبيقه بصفة عامة إلى مجموعة واسعة من الدراسات نمط التعبير الجيني.

توضح هذه المقالة طريقة لISH مضان مزدوجة تليها immunolabelling في أقسام مخ الفأر. ويرد وصف موجز لهذا البروتوكول في الشكل 1. وكانت الخطوة الأولى لتجميع تحقيقات محددة لالإقليمين وم ب ب (بروتين النخاعين الأساسي). للتأكد من أن تحقيقات قد تم توليفها، تم تشغيل قسامة صغيرة من كل رد فعل على هلام الاغاروز. قالب الخطي خافت وكمية كبيرة من التحقيق RNA يمكن رؤية (الشكل 2). ISH مضان مزدوج لالإقليمين وم ب ب، تليها Olig2 immunolabelling وتلطيخ النووي هويشت، وقد أجريت على أقسام مخ الفأر. نحن تفحص أقسام الدماغ في مجهر متحد البؤر ومخيط الصور معا للكشف عن توزيع إشارات التعبير الجيني في الدماغ. التعبير الإقليمين في م ب ب -positive لوحظ (م ب ب +) الخلايا في جميع أنحاء البرازيل<html> في (الشكل 3). كما درسنا التعبير الإقليمين في هياكل الدماغ المختلفة باستخدام أعلى التكبير. وترد ASPA التعبير في الخلايا قليلة التغصن في القشرة والإحضار الثفني في الشكل (4). وشارك في توطين م ب ب، Olig2، وASPA يشير إلى أن الإقليمين وأعرب في مجموعة فرعية من الخلايا قليلة التغصن ناضجة في القشرة والجسم الثفني (الشكل 4). هذه النتائج تثبت أن هذا البروتوكول يمكن الكشف في وقت واحد التعبير عن ثلاثة جينات مختلفة في أقسام الدماغ. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53976/53976fig1.jpg" /> الشكل 1. بروتوكول مزدوجة الإسفار في الموقع التهجين تعقبها المناعية. يعمل هذا البروتوكول على مدى 5 أيام، وبالكشف عن التعبير عن ثلاثة جينات./files/ftp_upload/53976/53976fig1large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53976/53976fig2.jpg" /> الشكل 2. فحص ASPA RNA التحقيق في الاغاروز جل. القالب الخطية وكمية كبيرة من التحقيق RNA من الوزن الجزيئي أقل يمكن ملاحظتها. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53976/53976fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53976/53976fig3.jpg" /> الشكل 3. الإسفار مزدوجة في الموقع التهجين لالإقليمين وم ب ب في أقسام مخ الفأر. </strong&gt; تم مسحها ضوئيا أقسام الدماغ مع المجهر متحد البؤر وكان مخيط الصور معا لإظهار توزيع الإقليمين (الحمراء)، وم ب ب (الأخضر) في الدماغ. شريط مقياس: 500 ميكرون <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53976/53976fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/53976/53976fig4.jpg" /> وأعرب عن الشكل 4. التعبير عن الإقليمين في الخلايا قليلة التغصن في اللحاء وكوربوس الثفني. وحات تظهر الصور التمثيلية من ISH للالإقليمين (الحمراء)، وم ب ب (الأخضر) تليها المناعية من Olig2 (الأزرق) جنبا إلى جنب مع هويشت تلطيخ. الإقليمين في بعض م ب ب + / + Olig2 الخلايا في القشرة (A و B) وفي الجسم الثفني (C و D). M<html> بي بي + / + Olig2 / ASPA + الخلايا المشار إليها مع السهام وم ب ب + / + Olig2 / ASPA - يشار إلى الخلايا مع النصال في لوحات مكبرة (B و D). الحانات مقياس: 100 ميكرون (A و C)؛ 20 ميكرون (B و D). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53976/53976fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل التكميلي 1" src="/files/ftp_upload/53976/53976supfig1.jpg" /> التكميلي الشكل 1. تسلسل وخريطة ASPA استنساخ (IRAVp968C0654D). تم إدراج 1.5kb تسلسل [كدنا من الإقليمين إلى pCMV-Sport6 ​​البلازميد (A). يظهر خريطة pCMV-Sport6-ASPA البلازميد في الفقرة (ب).م / الملفات / ftp_upload / 53976 / 53976supfig1large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Watch this Scientific Journal Video about Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections at JoVE.com

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

الجمع بين نقرا الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين مع Immunolabelling للكشف عن التعبير عن ثلاثة جينات في أقسام الدماغ ماوس

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

13.1K Views.  University College London. Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Video: Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

نقرا الإسفار في الموقع التهجين في أقسام المخ طازجة

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

الجمع بين صبغ محبة للدهون ، في الموقع التهجين ، المناعية ، والأنسجة

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are expressed in spatial relation to each other in situ. Multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) greatly facilitates the instant comparison of gene expression patterns, as it allows distinctive visualization of different mRNA species in contrasting colors in the same sample specimen. This provides the possibility to relate gene expression domains topographically to each other with high accuracy and to define unique and overlapping expression sites. In the presented protocol, we describe a MC-WISH procedure for comparing mRNA expression patterns of different genes in Drosophila embryos. Up to three RNA probes, each specific for another gene and labeled by a different hapten, are simultaneously hybridized to the embryo samples and subsequently detected by alkaline phosphatase-based colorimetric immunohistochemistry. The described procedure is detailed here for Drosophila, but works equally well with zebrafish embryos.

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

We describe a multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) procedure in intact Drosophila embryos allowing simultaneous and specific detection of three different mRNA distribution patterns by contrasting color precipitates.

متعددة الهدف اللونية الجامع جبل<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين لمقارنة الجينات مجالات التعبير في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Developmental Biology

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

التمهيدي لالمناعية على نسيج Cryosectioned دماغ الفئران: مثال تلطيخ لالدبقية الصغيرة والخلايا العصبية

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

الكشف عن Axonally المترجمة من mRNAs في أقسام المخ باستخدام عالية الدقة<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

الجمع بين التهجين الفلوري المتعدد في الموقع مع الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية على أقسام دماغ الفأر الطازجة المجمدة أو الثابتة

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by crossing the &#39;Tet-On&#39; system oTet-Cre mouse with a novel reverse tetracycline transactivator (rtTA) transgene linked to the Tert promoter, which we have demonstrated marks a novel population of adult brain stem cells. Here, administration of the tetracycline derivative doxycycline to mTert-rtTA::oTet-Cre mice will indelibly mark a population of cells that express a 4.4 kb fragment of the promoter region of the gene Tert. When combined the Rosa-mTmG reporter, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mice will express membrane tdTomato (mTomato) until doxycycline treatment induces the replacement of mTomato expression with membrane EGFP (mGFP) in cells that also express Tert. Therefore, when these triple-transgenic lineage tracing mice receive doxycycline (the &#34;pulse&#34; period during which TERT expressing cells are marked), these cells will become indelibly marked mGFP+ cells, which can be tracked for any desirable amount of time after doxycycline removal (the &#34;chase&#34; period), even if Tert expression is subsequently lost. Brains are then perfusion-fixed and processed for immunofluorescence and other downstream applications in order to interpret changes to stem cell activation, proliferation, lineage commitment, migration to various brain niches, and differentiation to mature cell types. Using this system, any rtTA mouse can be mated to oTet-Cre and a Rosa reporter to conduct doxycycline-inducible &#34;pulse-chase&#34; lineage&#160;tracing experiments using markers of stem cells.

The ability to permanently mark stem cells and their progeny with a fluorophore using an inducible transgenic lineage tracing mouse line allows for spatial and temporal analysis of activation, proliferation, migration, and/or differentiation in vivo. Lineage tracing can reveal novel information about lineage commitment, response to intervention(s), and multipotency.

تتبع نسب الخلايا الجذعية المستحثة ذات العلامات الفلورية في دماغ الفأر البالغ

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ within a given tissue remain limited. The EASI-FISH protocol described here has been adapted to detect the expression of dozens of genes in the intact adult Drosophila central nervous system (CNS) using commercially available reagents. This protocol includes a new gel formulation that enhances gel robustness, enabling multiple rounds of hybridization and allowing the embedding of multiple brains per gel. This improvement increases throughput, facilitates optimal comparison of experimental conditions, and reduces reagent costs. Additionally, by employing the GAL4-UAS system for co-detection of green fluorescent protein (GFP), gene expression can be visualized in specific neuronal or glial cell types. Notably, the high resolution achieved through expansion microscopy, combined with the sensitivity of the method, allows for the detection of single RNA transcripts. This approach effectively integrates high image quality with high throughput, making it a powerful tool for studying gene expression throughout the intact fly brain.

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) is a robust technique that combines expansion microscopy with fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect the expression of multiple genes in thick tissue. This protocol outlines recent advancements in the method and its adaptation for labeling the intact Drosophila central nervous system..

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative approaches are widely used to handle the tissue sections during the staining procedure, one approach consists of mounting the sections directly on glass slides, while a second approach, the free-floating, allows for fixed sections to be maintained and stained while suspended in solution. Although slide-mounted and free-floating approaches may yield similar results, the free-floating technique allows for better antibody penetration and thus should be the method of choice when thicker sections are to be used for 3D reconstruction of the tissues, for example when the focus of the experiment is to gain information on dendritic and axonal projections in brain regions. In addition, since the sections are kept in solution, a single aliquot can easily accommodate 30 to 40 sections, handling of which is less laborious, particularly in large-scale biomedical studies. Here, we illustrate how to apply the free-floating method to fluorescent immunohistochemistry staining, with a major focus on brain sections. We will also discuss how the free-floating technique can easily be modified to fit the individual needs of researchers and adapted to other tissues as well as other histochemical-based stainings, such as hematoxylin and eosin and cresyl violet, as long as tissue samples are properly fixed, typically with paraformaldehyde or formalin.

The free-floating technique allows researchers to perform histological-based stainings including immunohistochemistry on fixed tissue sections to visualize biological structures, cell type, and protein expression and localization. This is an efficient and reliable histochemical technique that can be useful for investigating a multitude of tissues, such as brain, heart, and liver.

تلطيخ قائم على الأنسجة باستخدام أقسام الأنسجة العائمة الحرة

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

Biology

 Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53976/combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling'>Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (2016).</a>This video demonstrates the use of double fluorescence in situ hybridization to visualize the expression of two RNA targets in mouse brain sections. The protocol involves sequential detection of RNA using probes labeled with fluorescein isothiocyanate and digoxigenin, followed by enzymatic signal amplification to enhance sensitivity. The resulting fluorescence enables co-localization analysis of the target RNAs within the tissue.

Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse ...

الجمع بين نقرا الإسفار

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video