עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקי NIH R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM &amp; SGF), R01 AI054928 (SGF), וR01 DE017088 (SGF).

נהלי כל החיה אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים בלוס אנג&#39;לס ביו-רפואי מכון המחקר (פרוטוקול 011,000) ובוצעו על פי המכון הלאומי לבריאות הנחיות (NIH) לטיפול האתי בבעלי חיים. העכברים בכלוב במתקן מוכר-AAALAC ממוקם בקמפוס של אוניברסיטת קליפורניה-הארבור מחקר ומכון לחינוך. וטרינר במשרה מלאה המתמחה ברפואת חיות מעבדה פיקח טיפול בם. כליאה והבעלים סופקו על פי ההנחיות ב&quot; המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה &quot;שירות בריאות הציבור בארה&quot;ב פרסום. כל נעשה ניסיון לטיפול בעכברים אנושי. ההישרדות והבריאות של העכברים היו פיקוח שלוש פעמים ביום. ברור שעכברים חולים, רדום הופרדו מהקבוצה ומורדמת כדי למזער את הסבל. העכברים מורדמים ידי ממנת יתר pentobarbital (210 מ&quot;ג / קילוגרם), כפי שהומלץ על ידי הפנל על EuthanasIA של האגודה האמריקנית לרפואת וטרינרית. 1. הכנת רקמות, ריאגנטים ומכשירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעכברי BALB / ג גברי שקלול 20-22 גרם לכל המחקרים. לחסן שלושה עכברים בכל קבוצת ניסוי לוריד עם 1 x 10 6 שמרים-שלב ג תאי אלביקנס. להקריב בעלי חיים וכליות קציר בנקודות זמן ספציפיות לאחר פגיעה. מניחים כל כליה לתוך צינור כובע בורג, להצמיד הקפאה בחנקן נוזלי, וחנות ב -80 ° C להפקת RNA מאוחר יותר 6. הערה: הניסויים בבעלי החיים בוצעו כפי שתואר בפירוט בet al שו 6.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ריאגנטים ומכשירים הבאים לפני הסרת כליות מהמקפיא -80 ° C: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח כוללת ערכת חילוץ RNA. הוסף 2-mercaptoethanol (V 1% / V) לחיץ RLT ומערבבים היטב (להכין 2 מיליליטר לכל דגימה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול 25: 24: 1 (צריך 600 μl עבור כל דגימה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות תווית M-סוג הומוגניזציה (M-צינור) ומקרר על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מיליליטר תווית בורג צינורות כובע, ולהוסיף כ -300 חרוזים Zirconia μl לכל צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשירי בדיקה זמינים: Dissociator רקמה, beadbeater, צנטריפוגה שולחן עם מתאמים לצינורות 50 מיליליטר ו 96 צלחות גם, פוטומטר. </li></ol></li></ol> 2. RNA חילוץ מרקמות נגועות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צינורות המכילים כליות מהמקפיא -80 ° C ולשים על קרח. להוסיף 1.2 מיליליטר חיץ RLT עם mercaptoethanol-2 לכל כליה. למזוג כליות עם חיץ לצינורות הומוגניזציה M-סוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize הכליות באמצעות Dissociator רקמה על RNA_02.01 הגדרה טעונה מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 1000 דקות 1 בצנטריפוגה שולחן בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את homogenate 600 μl לצינור כובע בורג המכיל חרוזים Zirconia. שמור את homogenate שנותר על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 600 פנול μl: כלורופורם: isoamyl אלכוהול 25: 24: 1 להצינורות מהשלב הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגרו את העפעפיים בחוזקה ומערבולת בbeadbeater 3 דקות בחדר קר 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה הצינורות ב 15,000 XG במשך 5 דקות בחדר קר 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את השלב המימי לצינור microfuge 1.5 מיליליטר חדש, ומערבב היטב עם נפח שווה של 70% אתנול, ולאחר מכן לטעון על טור הספין (עומס פעמיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את עמודת ספין פעם אחת עם 700 RW חיץ μl, ואחריו פעמיים עם 500 הרשתית חיץ μl. צנטריפוגה דקה אחת נוספת בצינור איסוף יבש כדי להסיר נוזל שנותר בעמודת הספין. לבצע את כל צעדי צנטריפוגה ב 8000 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute RNA עם 50 μl H 2 O. למדוד ריכוז RNA בOD 260 באמצעות ספקטרופוטומטר. </li></ol> 3. ביטוי גני פרופיל שימוש הדיגיטלי ברקוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערך התוים הפשרת כתב (צינור כובע ירוק) ואת מערך התוים לכידה (צינור כובע אפור) על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ הכלאה 130 μl למחדשמערך התוים שוער, להפוך לערבב וספין למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של התערובת לכל אחד מצינורות התגובה 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיקרוגרם של RNA הכולל רקמה (בהיקף של 5 μl) על צינור אחד. מערבבים על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את המערך התוים לכידה 5 μl לכל צינור. מערבבים על ידי היפוך הצינור ואחרי סיבוב מהיר במורד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תגובות על 65 מעלות צלזיוס בCycler תרמית עם O מכסה מחומם / N (~ 18 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את מחסנית מדגם אחד מ-20 ° C ולתת לו חם לRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שתי צלחות מגיב מ4 ° C ו צנטריפוגות ב 670 XG למשך 2 דקות בצנטריפוגה שולחן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תחנת ההכנה הבאה הוראות צעד-אחר-צעד על המסך, בחר באפשרות הרגישות הגבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התגובות מCycler התרמית ומייד לטעון בתחנת ההכנה. בחר כדי להפעיל את תכנית הרגישות הגבוהה (3 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תכנית תחנת ההכנה היא מלאה, להוציא את המחסנית ולאטום את הנתיבים עם קלטת ברורה. Apרובדי שמן מינרלים לחלק התחתון של המחסנית (דור אחד nCounter בלבד, לאחר מכן דורות אינם דורשים שלב זה), ולאחר מכן טען את המחסנית על המנתח הדיגיטלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המנתח הדיגיטלי הבאים הוראות צעד-אחר-צעד על המסך, בחר באפשרות הסריקה ברזולוציה הגבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ברזולוציה הגבוהה אופציה (600 שדות), להפעיל את תכנית הסריקה (~ 4.5 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תכנית הסריקה הושלמה, להוריד את התוצאות (או לבחור לקבל את התוצאות בדואר אלקטרוני), ולייבא את הנתונים גולמיים לתוך התוכנה של היצרן. התוכנה באופן אוטומטי לבדוק את איכות הנתונים ולהעלות דגלים אם איכות הנתונים נופלת מחוץ לטווח הנורמלי. לבצע התאמה טכנית באמצעות הפונקציה מובנית (האופציונלית, בצע את ההוראות בתוכנה), ואז לייצא את הנתונים כקובץ Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את הנתונים באמצעות אחת מהשיטות הבאות: ספירה כוללת מכל הגנים במערך התוים; אחד או כמה גני בקרה פנימיים; ממוצע גיאומטריגנים של הביעו ביותר (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את ערכי ביטוי הממוצעים עבור כל גן (אם הניסוי שנעשה במשכפל או triplicates), ואז לחשב את היחס של רמות ביטוי בין קבוצות ניסוי שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (לא חובה) לנתח ולחזות את תוצאות הפרופיל בפונקציות מובנות בתוכנת nSolver או תכנית אשכולות כגון MultiExperiment Viewer 10. </li></ol>

<ol>
	<li>Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-infecting+fungal+transcriptome.">The host-infecting fungal transcriptome.</a> FEMS Microbiol Lett. 307 (1), 1-11 (2010).</li><li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host.">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).</li><li>Creecy, J. P., Conway, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bacterial+transcriptomics+with+RNA-seq.">Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq.</a> Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).</li><li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs.">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).</li><li>Malkov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System.">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Res Notes. 2, 80 (2009).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+Alliance+of+Regulatory+Pathways+in+C.+albicans+during+Mammalian+Infection.">Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection.</a> PLoS Biology. 13, e1002076 (2015).</li><li>O'Meara, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+Rim101+Transcription+Factor+Directly+Regulates+Genes+Required+for+Adaptation+to+the+Host.">The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host.</a> Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).</li><li>Cheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+Candida+albicans+Gene+Expression+During+Intra-Abdominal+Candidiasis+Identifies+Biologic+Processes+Involved+in+Pathogenesis.">Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis.</a> J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).</li><li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+Targets+of+Candida+albicans+Biofilm+Regulator+Bcr1+in+Vitro+and+In+Vivo.">Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo.</a> Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).</li><li>Saeed, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TM4:+a+free,+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis.">TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).</li></ol>

This protocol is developed in the laboratory of Dr. Aaron P. Mitchell at Carnegie Mellon University. The publication of this manuscript is sponsored by NanoString Technologies.

פרוטוקול זה פותח על מנת לייעל את פרופיל תעתיק של הדבקת חיידקים באמצעות פלטפורמת nanoString nCounter. ההליך כולו, מאוסף רקמות לנתונים ביטוי, דורש פחות מ 48 שעות. הידיים על הזמן היא סביב 4 שעות במשך 12 דגימות. משתנה אחד מפתח בפרוטוקול זה הוא הסכום של RLT חיץ נוסף לרקמה בצעד הראשון. יותר מדי חיץ יהיה לדלל את homogenate ולהוביל להורדת ריכוז RNA, ואילו מאגר קטן מדי עלול להוביל להיווצרות של ג&#39;לי צמיג לאחר שלב חילוץ כלורופורם פנול ולא משאיר שלב המימי להתאוששות RNA. הכרכים אופטימליים באופן אמפירי שנקבעו של RLT חיץ לרקמות עכבר (בהנחת גדלים אופייניים) הם: כליות (1.2 מיליליטר), לשון (1.0 מיליליטר) וריאות (2.0 מיליליטר). לפתוגנים חיידקים, במיוחד אלה גדלו בצורת פילמנטיות, צעד מכות-חרוז עוזר לשבור קיר תא עבה פתוח לשחרר באופן מלא תוכן סלולארי. בשלב elution, על מנת להגדיל את RNA הסופיריכוז, eluate הסיבוב הראשון ניתן להוסיף לראש הטור, וelute בפעם שנייה. כ 100 מיקרוגרם של RNA הכולל רקמה ניתן לשחזר מעמודה אחת ספין RNeasy (~ 2 מיקרוגרם / μl x 50 μl). אם יש צורך בכמות גדולה יותר של רנ&quot;א, הכנה שנייה יכולה להיות עשויה מhomogenate הרקמות שנותר. אין להשליך את homogenate שנותר עד ריכוז RNA כבר נמדד, רק במקרה. בהתאם לדגם הזיהום, גודל הבידוד ומתח הפתוגן, אחוז RNA הפתוגן בסך RNA רקמה משתנים בין 0% -2%, ובדרך כלל נופלים בטווח של 0.05% -0.5%. לדוגמא, 10 מיקרוגרם של רנ&quot;א רקמות המוחלט מג אלביקנס נגוע בכליות יכולות ליצור ספירת גלם שווה לזה של 10 ng של ג הטהור אלביקנס RNA מתרבות במבחנה (10 ng / 10 מיקרוגרם = 0.1%). בגלל אחוז RNA הפתוגן בסך RNA רקמה משתנה במגוון רחב, קשה לדעת את כמות pathogeRNA n בכמות נתונה של רנ&quot;א הכל. כדי להימנע מבזבוז מערך התוים (250 x 192 תגובות גנים, העלות לכל תגובה היא סביב 200 $) על דגימות עם RNA הפתוגן מתחת לרמת זיהוי, צעד בקרת איכות RNA עשוי להתבצע כדי לקבוע את רמת RNA הפתוגן בתוך מדגם זה. ניתן לעשות זאת על ידי שני Q-RTPCR או מערך התוים קטן המכיל כמה גני משק בית. נורמליזציה באמצעות גני הפתוגן היא שלב קריטי לפני פרופילי הביטוי ניתן להשוות בין מדגמים שונים. ישנן שלוש שיטות נפוצות לנורמליזציה. 1. ספירה כוללת שימוש מכל הגנים במערך התוים. 2. השתמש באחת או כמה גנים &quot;משק בית&quot;. 3. השתמשו בממוצע הגיאומטרי (ה שורש של המוצר של מספרי N N) של גנים הביעו מאוד. למערך התוים גדול (&gt; 100 גנים) המכיל בדיקות שנבחרו באקראי, תוך שימוש בספירה כוללת של נורמליזציה יכולה להיות בחירה טובה, כי הספירה הכוללת של מספר גדול של גנים שאינם קשורים רשאית אמונהלשקף באופן מלא את כמות קלט RNA. למערך התוים קטן (&lt;100 גנים) המכילים בדיקות התמקדו בתהליך מסוים (כגון צמיחת hyphal, בהתחשב בכך שגנים של צמיחת hyphal נוטים להיות שותף מוסדר), בחירה אחת או כמה גני משק בית כשליטה לנורמליזציה היא חיונית. TDH3, גן חילוף חומרים הביע חסונה, שימש גם כשליטה לניסויים רבים. השיטה השלישית היא שיטה היברידית של 1 ו -2, בדגש על תרומה שווה מהגנים הביעו מאוד. למרות שפלטפורמת nCounter לא הגנום, היא מאפשרת כימות של רמת ביטוי של עד 800 גנים בassay אחד. לכן, בחירת גנים אינפורמטיבי ביותר לנתח היא קריטית להצלחה של הפרופיל. שתי גישות כדי לבחור לבדיקות כבר בשימוש. הגישה הראשונה היא &quot;ידע מבוסס&quot;. מידע מביטוי שפורסם ונתונים פונקציונליים נערך למסך לגנים שיש בם עניין הפוטנציאל הנוכחיללמוד, כגון גני התגובה הסביבתיים 6-9. גישה זו מאפשרת השוואה קלה של פרופיל in vivo נתונים למערכי נתונים קיימים רבים, ולכן מתן הקשר לפרשנות הנתונים. הגישה השנייה היא &quot;חקר מבוסס&quot;. קטגוריה של גנים בגנום חיידק, כגון כל הגנים המפרטים גורמי שעתוק, קינאז או קיר תא חלבונים שנבחרו לבדיקות. גישה זו מאפשרת זיהוי של גורמי רומן אלימות וגילוי של יחסי רגולציה רומן המבוססים על in vivo פרופיל נתונים 6.

דינמיקת ביטוי גנים מחזיקה מידע חיוני על איך תא מגיב לשינויים סביבתיים. במקרה של חיידק מדביק, נתונים ביטוי גנים יכולים לספק תובנות רלוונטיות מבחינה קלינית על איך הפתוגן מתאים את עצמו לסביבת הזיהום וגורם נזק למארח. בשני העשורים האחרונים, מחקרי ביטוי גנים הן במבחנה in vivo שנוצרו כמות גדולה של נתונים והניחו בסיס להבנת ביולוגיה זיהום 1-3. עם זאת, טכנולוגיות פרופיל הנוכחיות כוללים microarray וRNAseq, אינן אופטימליות לפרופיל של ביטוי גני הפתוגן בזיהום. לארח RNA מהווה חלק מכריע (בדרך כלל&gt; 99%) של RNA הכולל מבודד מדגימות רקמה נגועות. RNA המארח תורם לרקע גבוה בmicroarrays, ושולט רצף קורא מRNAseq. בידוד תא הפתוגן מהרקמה נגועה, בתאוריה, יכול לעזור להעשרה לRNA הפתוגן, אבל זה מציב בנוסףבעיות אל: היא דורשת כמויות גדולות של רקמה נגועה; ההליך יכול להיות מייגע; והכי חשוב, שקשה לשמר את המדינה או שלמות של RNA ילידים בתהליך הארוך. על מנת להפיק נתונים יותר מקיפים ומדויקים על ביטוי גני הפתוגן בזיהומים אמיתיים, יצאנו לפתח פרוטוקול המאפשר כימות אמינה וחסכונית של מיני RNA המיעוט באוכלוסיית RNA מעורבת. NanoString nCounter היא פלטפורמה שפותחה לאחרונה שעושה מדידה מרובבת ישירה של ביטוי גנים באמצעות זוגות בדיקה מקודד בר דיגיטלי 4, 5. יש פלטפורמה זו רמת רגישות דומה לזה של qRT-PCR אבל אינו דורשת הגברה האנזימטית. הטכנולוגיה אינה הגנום, היא מאפשרת זיהוי של עד 800 גנים שונים בכל assay. לכן, חשוב לבחור גנים אינפורמטיבי כמו בדיקות לפרופיל. כאן אנו משתמשים ביטוי גני פרופיל מחקר של זמזום גדולפתוגן, קנדידה אלביקנס, במהלך זיהום פולשני כדוגמא, כדי להדגים: 1) פרטים טכניים של הפרוצדורות (פרוטוקול), 2) רגישות, שחזור והטווח דינמי של שיטה זו (תוצאות נציג), ו -3) חשובה שיקולים לתכנון וביצוע ניסויים המבוססים על פרוטוקול זה (דיון). פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לפתוגנים שונים ויושם בהצלחה במספר דגמי זיהום 6-9.

<table><tbody><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentelMACS M tube</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;:IAA</td><td>Sigma</td><td>P-2069</td><td></td></tr><tr><td>Zirconia beads</td><td>Biospec Products</td><td>11079110zx</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>Biospec Products</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>nCounter Analysis system</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nCounter Gene Expression Codesets</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSolver Analysis tool</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gene expression profiling of infecting microbes using a digital bar-coding platform

עבור רוב פתוגנים יונקים, ביטוי גני פרופיל מחקרים היה מוגבל על ידי קשיים טכניים לכמת במדויק תעתיקי גני הפתוגן מרקמות נגועות. פתוגן RNA מהווה חלק זעיר של רנ&quot;א הכל מבודד מדגימות רקמה נגועות. microarray וטכנולוגיות RNAseq לשניהם יש קשיים ביצירה קוראים אמינה לגנים הפתוגן הביעו בקול חלוש. זני הפתוגן מוטציה עם מופחת בהתפשטות vivo מהווים אתגר גדול עוד יותר. כאן אנו מתארים בפרוטוקול פרופיל ביטוי גני vivo שהוא מאוד מהיר, מאוד רגיש ומאוד לשחזור. פיתחנו פרוטוקול זה במהלך החקירה שלנו של אלביקנס הפתוגן קנדידה הפטרייה במודל עכברי של פטרת הופץ hematogenously. שימוש בפרוטוקול זה, יש לנו מתועד קורסים של ג המוסדר באופן דינמי בזמן ביטוי אלביקנס גן במהלך זיהום בכליות, ותכונות בלתי צפויות גילו שלתגובות ביטוי גנים לטיפול תרופתי נגד פטריות in vivo.

אתגר עיקרי אחת עבור ביטוי גני הפתוגן פרופיל in vivo הוא להשיג מספיק קוראת מRNA הפתוגן. בהתחשב באחוז הנמוך של תמלילי הפתוגן ברנ&quot;א הכל, כמות גדולה של רנ&quot;א הכל (10 מיקרוגרם&gt;) יש להשתמש לכל תגובה. יש פלטפורמת יתרון ייחודי בנקודת מבט זו: הוא משתמש בשניהם בדיקה לכידה ובדיקת דו&quot;ח להגדיל את הספציפיות, כך שהכמות העצומה של RNA המארח אינה גורמת לרמה משמעותית של רעש. כפי שניתן לראות באיור 1 (מותאם מRef. 6), ספירת רקע גלם מדגימת רקמה נגוע (נקודות אדומות) היו כל מתחת ל -10, ואילו סעיפי גלם משתי דגימות רקמה נגועות (נקודות כחולות) היו כל מעל 10. נתוני ביטוי שנוצרו השימוש בפרוטוקול זה הם מאוד לשחזור. כפי שניתן לראות באיור 1 (מותאם מRef. 6), ספירת גלם משני משכפל ביולוגי (נקודות כחולות, דגימות כליות לאחר זיהום 48 שעות) היה מאוד gooמתאם ד, עם ערך R-מרובע שווה 0.945. הפלטפורמה מספקת גם טווח דינמי מספיק כדי להקיף רמות טבעיות ביולוגיות ביטוי (איור 1, ספירת גלם נעה בין 10 1 ו -10 6). שימוש בערכת בדיקה המפרטת 248 גני תגובה סביבתיים, היינו יכול להבחין בשני שלבים של ביטוי גני הפתוגן (איור 2, המותאם מאסמכתא 6.): תגובת ביטוי גנים מוקדמת כוללת גנים עם רמות RNA שונות באופן משמעותי בין הבידוד והשעה 12 דגימות לאחר פגיעה (P &lt;0.05 ו&gt; שינוי פי 2 בביטוי), ותגובת ביטוי גנים מאוחר כוללים גנים עם רמות RNA שהם שונים באופן משמעותי בין נקודת זמן 12 שעות בדגימות שלאחר זיהום 48 שעות (P &lt;0.05 ו&gt; פי 2 שינוי בביטוי). תוצאות אלו מצביעות כי ג ביטוי גני אלביקנס מוסדר באופן דינמי במהלך infectio פולשניתn של מארח יונקים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig1.jpg" /> איור 1. גלם סופר מרקמות כליה נגועות נגועות (מותאם מRef. 6). בדיקה נחשבת לשתיים (לאחר זיהום 48 שעות, נקודות נתונים כחולות) נגוע ו( נקודות אדומות נתונים) אחת נגוע דגימות כליות מוצגות כפיזור עלילה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53460/53460fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig2.jpg" /> איור 2. ביטוי של ג אלביקנס גנים מגיבים לסביבה בזיהום פולשני (מותאמים מRef. 6). שינויים ברמות הביטוי במהלך פלישת כליות עכבר על 248 ג גני אלביקנס מוצגים במ &#39;חוםפורמט AP. ערכים ממוצעים של triplicates הביולוגי מוצגים ל( צהוב) עד-רגולציה ומטה-רגולציה (כחולה) של גנים בגיל 12, 24, וקרוב משפחה לאחר זיהום 48 שעות למתכוונים רמות הבידוד (0 שעה). רוויית צבע מייצגת את מידת שינוי הביטוי, עם רוויה מלאה ב 10 לקפל למעלה או למטה-רגולציה. חלקים של מפת החום מורחבים כדי להמחיש נציג המוקדם עד מוסדר גנים (למעלה), גנים מאוחר (באמצע), וגנים מטה-מוסדרים המוקדם (למטה). בחלקים אלה, דגימות בודדות מוצגות בנפרד כדי להמחיש שחזור. אנו מגדירים מוקדם ביטוי שינויים כהבדלים משמעותיים בין הבידוד ו -12 דגימות שעות. אנו מגדירים מאוחר ביטוי שינויים כהבדלים משמעותיים בין דגימות 12 שעות ו- 48. משמעות מתייחסת לשינויים של&gt; 2 קיפול וp-value &lt;0.05. הנתונים עבור כל דגימה היו מנורמלים לרמות RNA מTDH3 גן השליטה לפני ערכים ממוצעים חושבו. הקריטריונים לשיוך שלנו מאפשרים כמה דינמיקהגנים מוסדרים lly ליפול לשתי כיתות ביטוי המוקדמות ומאוחרות. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53460/53460fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform at JoVE.com

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

פרופיל ביטוי גנים של חיידקים הדבקה באמצעות פלטפורמה דיגיטלית ברקוד

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

gene-expression-profiling-infecting-microbes-using-digital-bar-coding

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K Views.  Carnegie Mellon University. We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

Video: Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

הפרעות של במחזור miRNAs ב תסמונת מעי רגיז זוהו באמצעות פלטפורמת ביטוי גני תפוקה הגבוהה Multiplexed

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Genetics

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

Multiplex זיהוי של חיידקים דוגמאות מורכבות קלינית הסביבה באמצעות oligonucleotide מצמידים פלורסנט microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

דיגיטלי PCR מבוססי אינדקס תחרותי עבור ניתוח תפוקה גבוהה של כושר בסלמונלה

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is an effective methodology for tumor evaluation that improves the understanding of the tumor microenvironment. The visualization of protein expression in formalin-fixed, paraffin-embedded&#160;tissues is achieved when a specific fluorophore is annealed to an antibody-bound barcode via complementary oligonucleotides and then sample imaging is performed; indeed, this method allows for the use of customizable panels of more than 40 antibodies in a single tissue staining reaction. This method is compatible with fresh frozen tissue, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, cultured cells, and peripheral blood mononuclear cells, meaning that researchers can use this technology to view a variety of sample types at single-cell resolution. This method starts with a manual staining and fixing protocol, and all the antibody barcodes are applied using an antibody cocktail. The staining fluidics instrument is fully automated and performs iterative cycles of labeling, imaging, and removing spectrally distinct fluorophores until all the biomarkers have been imaged using a standard fluorescence microscope. The images are then collected and compiled across all the imaging cycles to achieve single-cell resolution for all the markers. The single-step staining and gentle fluorophore removal not only allow for highly multiplexed biomarker analysis but also preserve the sample for additional downstream analysis if desired (e.g., hematoxylin and eosin staining). Furthermore, the image analysis software enables image processing-drift compensation, background subtraction, cell segmentation, and clustering-as well as the visualization and analysis of the images and cell phenotypes for the generation of spatial network maps. In summary, this technology employs a computerized microfluidics system and fluorescence microscope to iteratively hybridize, image, and strip fluorescently labeled DNA probes that are complementary to tissue-bound, oligonucleotide-conjugated antibodies.

Multiplexed barcoding image analysis has recently improved the characterization of the tumor microenvironment, permitting comprehensive studies of cell composition, functional state, and cell-cell interactions. Herein, we describe a staining and imaging protocol using the barcoding of oligonucleotide-conjugated antibodies and cycle imaging, which allows for the use of a high-dimensional image&#160;analysis technique.

ניתוח תמונת ברקוד מרובה פרופיל חיסוני ואפיון מיפוי מרחבי באנליזה חד-תאית של דגימות רקמת פרפין

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Cancer Research

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

מרבב תא יחיד mRNA ניתוח הרצף של העכבר תאים עובריים

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Developmental Biology

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Bioengineering

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Biology

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

ניתוח תמלול תפוקה גבוהה לחקירת אינטראקציות בין מארח לפתוגן

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Barcoding הגנטי עם חלבונים ניאון עבור יישומי Multiplexed

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...