この作品は、NIHの助成金R21 DE023311（APM）、R56 AI111836（APM＆SGF）、R01 AI054928（SGF）、およびR01 DE017088（SGF）によって部分的にサポートされていました。

全ての動物手順はロサンゼルス生物医学研究所（プロトコル011000）で施設内動物管理使用委員会によって承認され、動物の倫理的な治療のための国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに従って実施しました。マウスは、ハーバーUCLA研究教育院のキャンパス内にありAAALAC認定施設でケージに入れました。実験動物医学を専門にフルタイムの獣医師は、彼らの世話を監督。監禁と畜産は、米国公衆衛生局の出版物「実験動物の管理と使用に関する指針」のガイドラインに従って提供されました。すべての試みは人道的にマウスを治療することとしました。マウスの生存と健康は、毎日3回モニターしました。明らかに病気、無気力マウスをグループから分離し、苦痛を最小にするために安楽死させました。 Euthanas上のパネルが推奨するようにマウスを、ペントバルビタールの過剰投与（210 mgの/ kg）をすることにより安楽死させましたアメリカ獣医師会のIA。 1.組織の調製、試薬および楽器<ol><li>すべての研究20〜22グラム重み付けオスのBalb / cマウスを使用してください。静脈内に1×10 6酵母相Cで実験群あたり3匹のマウスに接種アルビカンス細胞 。特定の時点感染後に動物や収穫腎臓を生け贄に捧げます。スクリューキャップチューブに各腎臓を置き、後にRNA抽出6のために-80℃の液体窒素中で凍結し、店をスナップ。 注：Xuらに詳細に記載されるように動物実験を行った6。 </li><li> -80℃の冷凍庫から腎臓を削除する前に、以下の試薬および器具を準備します。 <ol><li>全RNA抽出キットを開きます。 （1％v / v）のRLTをバッファリングし、（各サンプルの2ミリリットルを用意）よく混合するの2-メルカプトエタノールを追加します。 </li><li>フェノールの調製：クロロホルム：イソアミルアルコール25：24：1（各サンプルの600μlのを必要とします）。 </li><li>ラベルM型均質化チューブ（M-チューブ）、氷上で冷やします。 </li><li>ラベル2 mlのキャップチューブをネジし、各チューブに約300μlのジルコニアビーズを追加します。 </li><li>チェック機器を使用することができます。組織解離、beadbeater、50mlチューブおよび96ウェルプレート、光度計用のアダプタと卓上遠心機。 </li></ol></li></ol>感染組織から2. RNA抽出<ol><li> -80℃の冷凍庫から腎臓を含むチューブを外して、氷の上に置きます。各腎臓への2-メルカプトエタノールとをBuffer RLT 1.2ミリリットルを追加します。 M型均質化チューブに緩衝液を用いて腎臓をデカント。 </li><li>事前ロードされた設定RNA_02.01上の組織解離を使用して腎臓をホモジナイズします。 </li><li> RTで卓上遠心機で1分間、1000×gで遠心分離します。 </li><li>ジルコニアビーズを含むスクリューキャップチューブに600μlのホモジネートを転送します。氷の上の残りのホモジネートを保存します。 </li><li> 600μlのフェノールを追加：クロロホルム：イソアミルアルコール25：24：1前のステップからのチューブ。 </li><li> 4℃の低温室で3分間beadbeaterにしっかりと蓋を閉め、ボルテックス。 </li><li> 4℃の低温室で5分間15,000×gでチューブを遠心。 </li><li>慎重にスピンカラム（2回ロード）にロード、その後、70％エタノールの等量よく混ぜ、新しい1.5mlマイクロチューブに水相を転送します。 </li><li>二回と500μlのバッファーRPE、続いて700μlのバッファーRWで一度スピンカラムを洗浄します。スピンカラムに残っている液体を除去するためのドライコレクションチューブに遠心分離1つの余分分。 8,000×gですべての遠心操作を実行します。 </li><li> 50μlのH 2 Oで溶出RNA分光光度計を用いてOD 260で RNA濃度を測定します。 </li></ol>デジタルバーコードを使用してプロファイリング3.遺伝子発現<ol><li>氷上で解凍レポーターコードセット（緑キャップチューブ）とキャプチャコードセット（グレーのキャップチューブ）。 </li><li> 130μlのハイブリダイゼーション緩衝液は、再に追加ポーターのコードセットは、混合し、スピンダウンする反転します。 </li><li> 12反応管のそれぞれにミックス20μlのを追加します。 </li><li>各チューブに（5μLの容量で）全組織RNAの10μgのを追加します。ピペッティングにより混和します。 </li><li>各チューブに5μlのキャプチャコードセットを追加します。クイックスピンダウンに続いてチューブを反転することによって混合します。 </li><li>加熱蓋O / N（〜18時間）でのサーマルサイクラーで65℃で反応をインキュベートします。 </li><li> -20℃から1サンプルカートリッジを取り外し、室温にそれを温め。 </li><li>卓上遠心機で2分間670×gで4℃、遠心分離機から2試薬プレートを取り外します。 </li><li>画面上のステップバイステップの指示に従って準備ステーションを設定し、高感度オプションを選択します。 </li><li>サーマルサイクラーからの反応を削除し、すぐに準備ステーションにロードします。高感度プログラム（3時間）を実行する場合に選択します。 </li><li>プレップステーションプログラムが完了したら、カートリッジを除去し、透明なテープでレーンをシール。 APカートリッジの下にプライミネラルオイル（1世代のみnCounterため、後の世代には、このステップを必要としない）、その後、デジタルアナライザにカートリッジをロードします。 </li><li>高解像度スキャンオプションを選択し、画面上のステップバイステップの指示に従ってデジタルアナライザを設定します。 </li><li>スキャンプログラム（〜4.5時間）、高解像度（600フィールド）オプションを選択して実行します。 </li><li>スキャンプログラムが完了すると、結果をダウンロード（または電子メールで結果を受け取ることを選択）、およびメーカーのソフトウェアに生データをインポートします。ソフトウェアは自動的にデータの品質をチェックし、データの品質が正常範囲から外れた場合にフラグを発生させます。 （オプション、ソフトウェアの指示に従ってください）​​組み込み関数を使用して技術的な調整を行い、その後、Excelファイルとしてデータをエクスポートします。 </li><li>次のいずれかの方法を使用してデータを正規化：コードセット内のすべての遺伝子の合計数を、 1つまたは少数の内部コントロール遺伝子;幾何平均高発現遺伝子（説明を参照してください）​​。 </li><li> （実験は複製または三重に行われた場合）は、異なる実験群間の発現レベルの比を計算した後、各遺伝子の平均発現値を計算します。 </li><li> （オプション）nSolverソフトウェアまたはそのようなMultiExperimentビューア10としてクラスタリングプログラムに組み込み関数によってプロファイリング結果を分析し、可視化することができます。 </li></ol>

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	<li>Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-infecting+fungal+transcriptome.">The host-infecting fungal transcriptome.</a> FEMS Microbiol Lett. 307 (1), 1-11 (2010).</li><li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host.">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).</li><li>Creecy, J. P., Conway, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bacterial+transcriptomics+with+RNA-seq.">Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq.</a> Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).</li><li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs.">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).</li><li>Malkov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System.">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Res Notes. 2, 80 (2009).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+Alliance+of+Regulatory+Pathways+in+C.+albicans+during+Mammalian+Infection.">Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection.</a> PLoS Biology. 13, e1002076 (2015).</li><li>O'Meara, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+Rim101+Transcription+Factor+Directly+Regulates+Genes+Required+for+Adaptation+to+the+Host.">The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host.</a> Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).</li><li>Cheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+Candida+albicans+Gene+Expression+During+Intra-Abdominal+Candidiasis+Identifies+Biologic+Processes+Involved+in+Pathogenesis.">Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis.</a> J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).</li><li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+Targets+of+Candida+albicans+Biofilm+Regulator+Bcr1+in+Vitro+and+In+Vivo.">Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo.</a> Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).</li><li>Saeed, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TM4:+a+free,+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis.">TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).</li></ol>

This protocol is developed in the laboratory of Dr. Aaron P. Mitchell at Carnegie Mellon University. The publication of this manuscript is sponsored by NanoString Technologies.

このプロトコルはnanoString nCounterプラットフォームを使用して微生物感染の転写プロファイリングを最適化するために開発されています。全体の手順は、発現データに対する組織のコレクションから、未満48時間を必要とします。ハンズオン時間は、12個のサンプルのために約4時間です。このプロトコルにおける一つの重要な変数は、非常に最初のステップで組織に追加されたバッファRLTの量です。少なすぎるバッファは、フェノールクロロホルム抽出工程後の粘性ゲルの形成をもたらし、RNAの回収のための水相を残さないかもしれないがあまりにも多くのバッファは、ホモジネートを希釈し、RNA濃度を低下につながります。 （典型的な大きさと仮定した場合）、マウス組織のバッファRLTの経験的に決定された最適のボリュームがある：腎臓（1.2 ml）を、舌（1.0 ml）および肺（2.0ミリリットル）。特に、これらは糸状形で成長した微生物病原体については、ビーズ打つのステップは、完全に細胞内容物を放出するために、オープン厚い細胞壁を破るのに役立ちます。溶出工程において、最終的なRNAを増加させるために濃度は、最初のラウンドの溶出液をカラムに加え戻し、2回目を溶出することができます。約100μgの全組織RNAのは1 RNeasyスピンカラム（×50μL〜2μgの/μL）から回収することができます。 RNAのより大きな量が必要な場合は、第二の分取は、残りの組織ホモジネートから作ることができます。 RNA濃度が測定されるまで、念のた​​めに、残りのホモジネートを処分しないでください。 感染モデルに応じて、接種材料のサイズおよび病原体株は、全組織RNA中の病原体のRNAの割合は0％〜2％で変化し、典型的には0.05％-0.5％の範囲内です。 C.から全組織RNAを、例えば、10μgのアルビカンスは、感染した純粋なCの 10 ngのと同等の生のカウントを生成することができ、腎臓インビトロ培養からアルビカンス RNA（10 ngの/ 10μgの= 0.1％）。全組織RNA中の病原体のRNAの割合は広い範囲で変化するので、pathogeの量を知ることは困難ですトータルRNAの所定量のn RNA。消耗コードセットを回避するために、検出レベル以下の病原体のRNAの試料上で（250遺伝子のx 192反応のために、反応あたりのコストは約$ 200である）、RNAの品質管理ステップは、各試料中の病原体のRNAレベルを決定するために実行することができます。これは、Q-RTPCRまたは少数のハウスキーピング遺伝子を含む小さなコードセットのいずれかによって行うことができます。 病原体の遺伝子を用いて正規化は、発現プロファイルは、異なる試料間で比較することができる前に、重要なステップです。正規化のために一般的に使用される3つの方法があります。 1.コードセット内のすべての遺伝子から全カウントを使用してください。 2. 1つまたは少数の「ハウスキーピング」遺伝子。 3.高発現遺伝子の幾何平均（N個の数の積のN 乗根 ）を使用します。無関係な多数の遺伝子の合計数が信仰する可能性があるため、ランダムに選択されたプローブを含む大規模なコードセット（&gt; 100個の遺伝子）については、正規化のために総カウントを使用することは、良い選択することができます完全RNAインプットの量を反映しています。 （菌糸の成長遺伝子は共調節する傾向があることを考えれば、このような菌糸の成長など、）特定のプロセスに焦点を当てたプローブを含む小さなコードセット（&lt;100個の遺伝子）については、標準化のための制御として、1つまたは少数のハウスキーピング遺伝子を選択することが不可欠です。 TDH3、ロバスト表現代謝遺伝子は、多くの実験のためのコントロールとしても務めています。第3の方法は、高発現遺伝子から等しい貢献を強調して、方法1と2のハイブリッドです。 nCounterプラットフォームは、ゲノムワイドなされていないが、それは、単一のアッセイで最大800個の遺伝子についての発現レベルの定量化を可能にします。したがって、分析するために最も有益な遺伝子を選択すると、プロファイリングの成功のために重要です。プローブを選択するために2つのアプローチが使用されています。最初のアプローチは、「知識ベース」です。公開された発現と機能データからの情報は、現在の潜在的な関心のある遺伝子をスクリーニングするためにコンパイルされていますこのような環境応答遺伝子6-9として、研究しています。このアプローチは、in vivoでの簡単な比較はデータの解釈にコンテキストを提供するため、多くの既存のデータセットにデータをプロファイリングできます。第2のアプローチは、「探査ベース」です。そのような転写因子、キナーゼまたは細胞壁タンパク質を指定するすべての遺伝子のような微生物のゲノム中の遺伝子のカテゴリは、プローブ用に選択されます。このアプローチは、in vivoデータ 6プロファイリングに基づく新規毒性因子及び新規規制関係の発見の同定を可能にします。

遺伝子発現のダイナミクスは、細胞が環境の変化にどのように応答するかについての重要な情報を保持しています。感染性微生物の場合には、遺伝子発現データは、病原体感染の環境に適応し、ホストへの損傷を引き起こす方法の臨床的に関連する洞察を提供することができます。過去20年間に、 インビトロおよびインビボの両方の遺伝子発現研究は、大量のデータを生成し、感染生物学1-3を理解するための基礎を築いています。しかし、マイクロアレイとRNAseqを含む現在のプロファイリング技術は、感染の間の病原体の遺伝子発現のプロファイリングには最適ではありません。 RNAは、感染した組織試料から単離された全RNAの圧倒的な部分（通常&gt; 99％）を構成するホスト。宿主RNAは、マイクロアレイ上の高いバックグラウンドに寄与し、シーケンスはRNAseqから読み取り支配しています。感染組織からの病原体細胞の単離は、理論的には、病原体のRNAを濃縮することができますが、それはまたのポーズアルの問題：それが感染した組織を大量に必要とします。手順は退屈することができます。最も重要なことは、長いプロセスの間に天然状態またはRNAの完全性を保存することは困難です。実際の感染時に病原体の遺伝子発現のより包括的で正確なデータを生成するために、我々は、混合RNA集団中の少数のRNA種の信頼性が高く、費用対効果の定量化を可能にするプロトコルの開発に着手しました。 NanoString nCounterは、デジタルバーコードプローブ対4、5を用いた遺伝子発現の直接の多重化測定を行い、最近開発されたプラットフォームです。このプラットフォームは、QRT-PCRと同等の感度レベルを持っていますが、酵素増幅を必要としません。技術は、ゲノム全体ではないが、それは、それぞれのアッセイにおいて、最大800の異なる遺伝子の検出を可能にします。したがって、プロファイリングのためのプローブとして有益な遺伝子を選択することが重要です。ここでは、主要なハムの研究遺伝子発現プロファイリングを使用例として、侵襲性感染時の病原体、 カンジダ・アルビカンスは 、実証するために：1）実験手順（プロトコル）の技術的な詳細、2）この方法の感度、再現性とダイナミックレンジ（代表的な結果）、および3）重要このプロトコル（議論）に基づいて実験を設計し、実行するための考慮事項。このプロトコルは、容易に種々の病原体に適合させることができ、正常に感染モデル6-9の数に適用されています。

<table><tbody><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentelMACS M tube</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;:IAA</td><td>Sigma</td><td>P-2069</td><td></td></tr><tr><td>Zirconia beads</td><td>Biospec Products</td><td>11079110zx</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>Biospec Products</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>nCounter Analysis system</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nCounter Gene Expression Codesets</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSolver Analysis tool</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gene expression profiling of infecting microbes using a digital bar-coding platform

ほとんどの哺乳動物の病原体のために、研究を遺伝子発現プロファイリングは正確に、感染した組織からの病原体遺伝子転写物を定量するための技術的な困難さにより制限されています。病原体RNAは、感染した組織試料から単離された全RNAの小さな部分を構成しています。マイクロアレイとRNAseq技術の両方が弱く発現病原体の遺伝子を読み取る信頼性を生成する際に困難を持っています。 in vivoでの増殖に減少した変異病原体株は、さらに大きな課題を提起します。ここでは、非常に高速で非常に敏感と非常に再現性があるin vivoでの遺伝子発現プロファイリングプロトコルを記述します。私たちは、血行性播種性カンジダ症のマウスモデルにおける真菌病原体カンジダ・アルビカンスの私達の調査中に、このプロトコルを開発しました。このプロトコルを使用して、我々は動的に調整されたCの時間経過を報告しています腎臓感染中アルビカンス遺伝子発現、及び予想外の特徴を発見し遺伝子発現応答をin vivoで薬物治療を抗真菌します。

生体内でプロファイリング病原体の遺伝子発現のための一つの主な課題は、十分な病原体RNAから読み取る取得することです。総RNAは、全RNAを多量に病原体転写物の割合が低い所定の（&gt;10μg）を各反応のために使用されなければなりません。プラットフォームは、この視点でユニークな利点があります：それは、宿主RNAの圧倒的な量は、ノイズのかなりのレベルを引き起こさないように、特異性を高めるために捕捉プローブとレポートプローブの両方を使用しています。 （参考文献から適応。6）を図1に示すように、2つの感染組織サンプル（ブルードット）からの生カウントが生成されたすべての10式のデータの上にあったが、非感染組織試料（赤い点）からのバックグラウンド生の数は、すべての10未満でしたこのプロトコルを使用して高度に再現可能です。 図1（参考文献6から適応）に示すように、2つの生物学的複製（ブルードット、48時間の感染後の腎臓サンプル）からの生カウントは非常にグーを持っていましたR二乗値とDの相関は、0.945に等しいです。プラットフォームはまた、天然の生物学的発現レベルを包含するのに十分なダイナミックレンジを提供する（ 図1、生カウントは10 1から10 6の範囲でした）。 248環境応答遺伝子を特定するプローブセットを用いて、病原体の遺伝子発現の二相識別することができた（参考文献から適応図2、6）：初期遺伝子発現応答は、接種物と12時間の間で有意に異なるRNAレベルを有する遺伝子を含みます感染後のサンプル（P &lt;0.05及び&gt;発現の2倍の変化）、および後期遺伝子発現応答は、48時間の感染後のサンプル（P &lt;0.05で12時間の時点の間で有意に異なるRNAレベルを有する遺伝子を含みますそして、&gt; 2倍の発現の変化）。これらの結果は、ことを示しているC.アルビカンスの遺伝子発現は、動的に侵襲infectio中に規制されています哺乳動物宿主のN。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig1.jpg" /> 図1.生が。プローブは、2つの感染（48時間の感染後、青色のデータポイント）のカウント（参考文献6から適応）感染および非感染腎組織からカウントし、1感染していない（赤いデータポイント）腎臓サンプルは、散乱として表示されていますプロット。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53460/53460fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig2.jpg" /> C. 図2.式 アルビカンス 、環境応答性遺伝子は、侵襲性感染の間に（参考文献から適応。6）。発現レベルの変化を248℃でのマウスの腎臓の侵攻アルビカンス遺伝子は熱メートルに提示されていますAP形式。生物学的な三連の平均値はアップレギュレーション（黄色）のために示されており、12、24での遺伝子の（青）、および48時間感染後の相対的なダウンレギュレーション接種材料レベル（0時間）を意味します。彩度が10倍アップまたはダウンレギュレーションで完全に飽和して、表情変化の程度を表します。ヒートマップの一部は、代表的な初期の上方制御された遺伝子（上）、後期遺伝子（中央）、および初期のダウンレギュレートされた遺伝子（下）を説明するために展開されます。これらの部分では、個々のサンプルは、再現性を説明するために個別に表示されています。私たちは、接種物と12時間のサンプル間の有意差には早く発現変化を定義します。私たちは、12および48時間のサンプル間に有意な差として後期発現変化を定義します。意義は&gt; 2倍、およびp値&lt;0.05の変化を指します。平均値が計算される前に、各サンプルについてのデータは、対照遺伝子TDH3のRNAレベルに対して標準化しました。私たちの割り当て基準は、いくつかのdynamicaを許可LLY調節される遺伝子は、初期および後期表現クラスの両方に分類する。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53460/53460fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

デジタルバーコードプラットフォームを使用して感染する微生物の遺伝子発現プロファイリング

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

gene-expression-profiling-infecting-microbes-using-digital-bar-coding

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K ビュー.  Carnegie Mellon University. We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

ビデオ: Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

遺伝学

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

免疫・感染学

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

サルモネラ菌におけるフィットネスのハイスループット分析に関するデジタルPCRベースの競争指数

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is an effective methodology for tumor evaluation that improves the understanding of the tumor microenvironment. The visualization of protein expression in formalin-fixed, paraffin-embedded&#160;tissues is achieved when a specific fluorophore is annealed to an antibody-bound barcode via complementary oligonucleotides and then sample imaging is performed; indeed, this method allows for the use of customizable panels of more than 40 antibodies in a single tissue staining reaction. This method is compatible with fresh frozen tissue, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, cultured cells, and peripheral blood mononuclear cells, meaning that researchers can use this technology to view a variety of sample types at single-cell resolution. This method starts with a manual staining and fixing protocol, and all the antibody barcodes are applied using an antibody cocktail. The staining fluidics instrument is fully automated and performs iterative cycles of labeling, imaging, and removing spectrally distinct fluorophores until all the biomarkers have been imaged using a standard fluorescence microscope. The images are then collected and compiled across all the imaging cycles to achieve single-cell resolution for all the markers. The single-step staining and gentle fluorophore removal not only allow for highly multiplexed biomarker analysis but also preserve the sample for additional downstream analysis if desired (e.g., hematoxylin and eosin staining). Furthermore, the image analysis software enables image processing-drift compensation, background subtraction, cell segmentation, and clustering-as well as the visualization and analysis of the images and cell phenotypes for the generation of spatial network maps. In summary, this technology employs a computerized microfluidics system and fluorescence microscope to iteratively hybridize, image, and strip fluorescently labeled DNA probes that are complementary to tissue-bound, oligonucleotide-conjugated antibodies.

Multiplexed barcoding image analysis has recently improved the characterization of the tumor microenvironment, permitting comprehensive studies of cell composition, functional state, and cell-cell interactions. Herein, we describe a staining and imaging protocol using the barcoding of oligonucleotide-conjugated antibodies and cycle imaging, which allows for the use of a high-dimensional image&#160;analysis technique.

パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

がん研究

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

発生生物学

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

単一細胞のゲノムの配列のための超高スループット マイクロ流体プラットフォーム

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

生物工学

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

生物学

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

宿主と病原体の相互作用を調するためのハイスループットトランスクリプトーム解析

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

多重化アプリケーションのための蛍光タンパク質との遺伝バーコーディング

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

デジタルバーコードプラットフォームを使用して感染する微生物の遺伝子発現プロファイリング

要約

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過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

サルモネラ菌におけるフィットネスのハイスループット分析に関するデジタルPCRベースの競争指数

パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析

単一細胞のゲノムの配列のための超高スループットマイクロ流体プラットフォーム

バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

宿主と病原体の相互作用を調するためのハイスループットトランスクリプトーム解析

16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

多重化アプリケーションのための蛍光タンパク質との遺伝バーコーディング

デジタルバーコードプラットフォームを使用して感染する微生物の遺伝子発現プロファイリング

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過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

サルモネラ菌におけるフィットネスのハイスループット分析に関するデジタルPCRベースの競争指数

パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析

単一細胞のゲノムの配列のための超高スループット マイクロ流体プラットフォーム

バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

宿主と病原体の相互作用を調するためのハイスループットトランスクリプトーム解析

16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

多重化アプリケーションのための蛍光タンパク質との遺伝バーコーディング

単一細胞のゲノムの配列のための超高スループットマイクロ流体プラットフォーム