The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick&#8217;s Foundation (A.Y.H.), Alex&#8217;s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle&#8217;s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.

The authors have nothing to disclose.

אינטראקציות הדמיה סוגי תאים שונים בתאי רקמת מולדתם של שבהתפתח פתולוגיה בזמן אמת יצרו עניין רב. בתוך הרשת הצפופה של מערכת העצבים המרכזית, קשר תאי תאים ואיתות עם תאים סמוכים חיונית לתפקוד תקין ולהבנת הפתולוגיה של מערכת העצבים המרכזית. כאן, אנו תיארנו את השימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר 2-פוטון לתצפית של תנועה הסלולר בתוך נגע מכאני בחוט השדרה. בנוסף לאיכות של הכנת הניתוח ורקמה, יציבות מכאנית של הרקמה היא בעל חשיבות עליונה למיקרוסקופיה זמן לשגות מוצלחת, במיוחד הבידוד של חוט השדרה מנשימת חפץ בתנועה. יציבות ניתן להעריך על ידי מחפש תנועה של חוט השדרה תחת מיקרוסקופ לנתח שמתאים לקצב הלב או הנשימה של בעלי החיים. יציבות יש לבחון גם בעת ביצוע הניתוח וגם מייד לפני תחילת הדמיה. אם האנימהl הוא לא יציב, התאמות צריכות להיעשות כדי ההשמה והאטימות של מלחציים חוט השדרה. מודלים של עכברי כתב ניאון ספציפי תא מסוג בשילוב עם גישות הכימרה מח העצם אפשרו זיהוי של תאי monocytic לעומת מיקרוגליה ואקסונים. מחקרים קודמים גילו כי מיקרוגליה מונוציטים בדם נגזר ולא אחראים לנזק axonal המשני לאחר טראומה באמצעות המתודולוגיה שתוארה כאן 43. צבע כלי מצומדות dextran מאפשר זיהוי כלי שני לספק ציוני דרך ולזהות פרצות בשלמות כלי דם. הבחירה של מודל עכבר כתב הניאון המתאים היא קריטית כדי לאפשר זיהוי הנכון של סוגי התאים הרצויים להיות צילם. פיתוח דגמי עכבר ניאון המתאימים למחקרים המתבצע גם קריטי להצלחה של ניסויים. הבחנה בין שתי אוכלוסיות phagocytic של CX3CR1 + / GFP </sup&gt; תאים במערכת העצבים המרכזית היו קשים באופן מסורתי. כפי שניתן לראות כאן, טכניקה נפוצה חיסונית, מפלצות קרינה, יכולה להיות מנוצלת כדי להבחין, מיקרוגליה CNS-תושב רדיו עמיד ממקרופאגים נגזרות מח העצם. יש הליך הקרנת הפוטנציאל לפגוע במחסום דם המוח ולשנות פנוטיפים תאים, ולכן שימוש במודל זה יש לשקול בזהירות. שינויים אלה במידה שונה עם מינון קרינה, כמו גם משך תקופת החלמה, וההשפעה שלהם על דגמים דלקתיים שונים לא נחקרה באופן מלא. ההשפעות של קרינה על מחסום דם מוח CNS ניתן למזער על ידי מגן הראש במהלך הקרנה, וזה הוכח להפחית חדירת תא אל חוט השדרה לאחר הקרנה, גם אם חוט השדרה הוא לא ישירות מוגן 52. כאן יש לנו ציינו כי מספר התאים שחדרו למערכת העצבים המרכזית במצב יציב כתוצאה מדור הכימרה הוא חסר משמעות בניגוד לתחושהאה של תאי הזנת הנגע. מודלים חלופיים אחרים לשקול לכלול מפלצות בהשפעת סמים או 52 מודלים של עכברי parabiotic 53. הנה, יש לנו הצגנו מודל פציעה קטן ספציפי, פשוט ושחזור כי תוצאות בנגע לחומר לבן גב של חוט השדרה שהוא קל לתמונה באמצעות מיקרוסקופיה 2-הפוטון. שיטה זו מספקת גם נגע לכימות לassay מידת dieback axonal בעמודות הגבי שבספרות כבר בשילוב עם 16,18,43,48,54 ניתוח רקמות קבועות משלימים. במודל זה, בעלי חיים להציג רק גירעונות מינימאליים ואין צורך בטיפול מיוחד לאחר פציעה. מחקרים עתידיים ניצול טכניקות פציעה למחוץ טור והדמיה הגב המתואר כאן עשויים להיות כלי מיון רבי עוצמה כדי להעריך את היעילות של טיפול בפגיעה בחוט השדרה. טיפולים אלה עשויים לכלול מעכבים קטנים מולקולה, תרופות, מוצרים סלולריים, שתלי רקמה וטיפול קומבינטוריתs. יחסי הגומלין בין מקרופאגים, מיקרוגליה ונוירונים הם גם צפוי לשחק תפקיד בדגמים אחרים מחלה בחוט השדרה, כוללים טרשת נפוצה, גידולים, דלקת קרום מוח וטרשת לרוחב amyotrophic, וטכניקה זו עשויה להיות שימושית במחקר של מחלות אלו, כמו גם .

התגובה הדלקתית למחלה או פציעה במערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא הבין היטב, במיוחד בכל הקשור ליחסי הגומלין בין תאי מערכת חיסון ותושב בתוך הרקמה. חקירות של אינטראקציות הסלולר אלה בחוט השדרה הן בעלי עניין מיוחד בחי. בדרכי העניין רק נגישות בקלות במערכת העצבים המרכזית הלבנות היא בעמודות הגבי של חוט השדרה, מה שהופך את זה תחום חשוב שבו יש למקד את המאמצים בשיפור גישה ניסויית אפשרית. חקירות אלה היו מוגבלות בשל הקושי הטכני בגישה ולייצוב מערכת העצבים המרכזית להדמיה. הדמיה לחיות בחוט השדרה שתוארה תנועה סלולרית בעבר 1-13, עם זאת, מספר המחקרים התייחסו בפגיעה בחוט השדרה מעבר לכמה שעות אחרי העלבון הראשוני. נגע חוט השדרה הטראומתי הוא סביבה מורכבת, עם תאי עצב, האסטרוציטים, fibroblasts, ותאי NG2, ותאי חיסון including מיקרוגליה, נויטרופילים, מקרופאגים, תאי T, תאי B ותאים דנדריטיים 14,15. המקרופאגים הם תת-הקבוצה של תאי מערכת חיסון אחראים לphagocytosis בנגע, שחדרו מהמחזור. תפקידם של תאי phagocytic אלה כבר התווכח, עם דיווחים מצביעים על כך שתאים אלה יכולים לקחת על שני תפקידים מזיקים ומגן ברקמה הפגועה. תפקידים אלה נעים בין הגדלת dieback axonal המשני לאחר פציעה ופועל באופן phagocytic 16-22, לוקח על ריפוי פצע פנוטיפ, ולהקטין את גירעונות תפקודיים בבעלי החיים הפצועים 21,23,24. בעבר, מנסה להבחין מקרופאגים ממיקרוגליה הסתמכו בעיקר על מורפולוגיה ברקמה בריאה. עם זאת, מיקרוגליה ומקרופאגים מופעלים להביע רבים מאותו הסמנים ולהציג מורפולוגיה נבדלה לאחר פציעת 25-29, מה שהופכים את ההפרדה של פעילויות שונות של תאים אלה קשים ללמוד based בגורמים אלה לבד 30. ניתן להפריד תאים אלה על ידי ביטוי ההפרש של CD45 באמצעות זרימת cytometry 33,34, למרות שגישה זו היא פחות שימושית באפליה מסוג התא בגוף חי. ביטוי ההפרש ניצול של CCR2 וCX3CR1 במיקרוגליה ומקרופאגים גם נחקר, למרות שהשינויים הדינמיים בביטוי של סמנים אלה כמונוציטים להתמיין מקרופאגים יכולים לסבך ניתוח מדויק 35,36. Microglia הם התאים חיסוניים התושב במערכת העצבים המרכזית ונובע מאבות שק החלמון במהלך התפתחות עוברית, בעוד מקרופאגים נגזרים מאבות מח עצם ולהיכנס למערכת העצבים המרכזית הפצועה לאחר עלבון 31,32. גישה חלופית לשימוש במורפולוגיה להבחין בין שני סוגים אלה התא היא להחליף את מוח העצם עם אבות מבעלי חי תורם להביע סמן למעקב במקרופאגים נגזרו מאבות התורם, תוך שמירה על תושב CNS, recipהנגזר ient מיקרוגליה. המודלים chimeric מח עצם אלה נמצאים בשימוש נרחב ביישומים רבים אחרים 37-40. לשיטה זו אזהרות ייחודיות הקשורים לפגיעה בשלמות מחסום דם-המוח הנגרם על ידי תרופות קרינה או רעילות לתאים המשמשות למיגור אבות מח במארח, ובכך להגביל את השימוש שלה ביישומים מסוימים. לאחרונה, הבחנות פונקציונליות בין microglia ומקרופגים במערכת העצבים המרכזית מתחילות להבחין באמצעות cytometry זרימה, ניתוח מערך שבבי גן ושיטות chimerism 24,26,41-44, אשר תוכיח מאוד שימושי בעתיד. למרות מפריד בין שני סוגי התאים עדיין קשה, הבנת הפונקציות הייחודיות שלהם היא חשובה שבהוביל לטיפולים ממוקדים יותר של הפרעות שכוללות שני מיקרוגליה ומקרופאגים בתוך מערכת העצבים המרכזית. תיאור של אינטראקציות הסלולר בתוך נגע חוט השדרה הגיע בעיקר ממחקרים שכלל דגמי תרבית תאים. זה דue לאתגרים כרוכים בהדמיה הן נגע חוט השדרה ותאי חיסון יחד בחי. מודלים של מכרסמים הנוכחיים של פגיעה בחוט השדרה של סוג וחומרה שונים כוללים דגמי חבלה 45,46, פציעות דקירת סיכה 2, חתך 47, ולפציעתם למעוך עמודה הגבית שתוארה כאן 16,18,48. דלקת בקרומי המוח עולה עם חומרת פציעה ומציבה אתגרים ייחודיים להשתלה של חלונות או ניתוחים להדמיה סידורי. חלק מאתגרים אלה כוללים חדירה של תאי phagocytic, כמו גם את הדור של רקמה סיבית על האתר כירורגית. חלק מנושאים אלה ניתן להתגבר על ידי יצירת נגעים קטנים ומכסה את חוט השדרה החשוף ברוטב כירורגית שאינו חיסוני בין הדורה ושרירי paraspinous כדי לאפשר לניתוח פתיחה מחדש לאחר מכן, כפי שנעשה כאן כדי ללמוד את הפציעה למחוץ עמודה הגבי . יכולת תמונת החלק הגבי בלבד של הספיןכבל אל גם מגביל את הבחירה של פגיעה, שכן דגמי חבלה בעיקר לגרום לניזק לחוט המרכזי, לעתים קרובות חוסך חלק הגבי רוב עמודות הגב, במיוחד בנקודות זמן מוקדמות לאחר פציעת 45,49. לכן, אנו מתארים מודל פציעה פשוט שמניב נגע נקי, הדיר, מלבני בצורה שהוא שימושי עבור שתי התצפית של תנועת תאים בתוך הנגע ולכימות קל של axonal עמדה ביחס לנגע.

<table><tbody><tr><td>CX3CR1 GFP mice</td><td>Jackson laboratories</td><td>5582</td><td></td></tr><tr><td>Thy-1 YFP H mice</td><td>Jackson laboratories</td><td>3782</td><td></td></tr><tr><td>Mouse pie cage</td><td>Braintree Scientific</td><td>MPC 2 set</td><td></td></tr><tr><td>60 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Petri dish</td><td>Corning</td><td>430166</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>Falcon 40 &amp;mu;m cell filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>1 x 15 ml and 1 x 50 ml conical tube</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>21 gauge needle</td><td>BD</td><td>305177</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>309628</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>ACK lysis buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-022-CV</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>RPMI media</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>F4/80 antibody</td><td>Ebioscience</td><td>12-4801 PE</td><td>For FACS verification of chimeras</td></tr><tr><td>30 gauge insulin syringe</td><td>BD</td><td>328280</td><td>For tail vein injection</td></tr><tr><td>Spinal Cord Clamps</td><td>Narshinge</td><td>STS-A</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Dental Acrylic powder</td><td>Lang Dental</td><td>REF1320</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Dental Acrylic liquid</td><td>Lang Dental</td><td>REF1404</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Gelfoam gelatin sponges</td><td>Pfizer</td><td>9034201</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>4-0 Ethilon sutures</td><td>Ethilon</td><td>1667G</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Reflex Clips, 7 mm</td><td>Kent Scientific</td><td>INS750344</td><td>For surgery. Sterilize before use</td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-09</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>45/5 Forceps, Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>30 gauge needle</td><td>BD</td><td>305106</td><td>For making access holes in dura</td></tr><tr><td>Forceps Dumont #4 Biology tips</td><td>Dumont</td><td>11242-40</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Needle Drivers</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Michel Wound Clip Forceps</td><td>Kent Scientific</td><td>INS700753</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Wound clip remover</td><td>Fine Science Tools</td><td>12033-00</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>O-rings for Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-00</td><td>For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately</td></tr><tr><td>Cordless Rechargable Animal trimmer</td><td>Wahl</td><td>Series 8900</td><td>for surgery</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution)</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-150-08</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Nair Hair remover lotion</td><td>Church &amp;amp; Dwight Co., Inc.</td><td>NRSL-22329-05</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td>Drugs &amp;ndash; for surgery</td></tr><tr><td>Marcaine</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 0409-1587-50</td><td>Drugs &amp;ndash; for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously</td></tr><tr><td>Bupernex</td><td>Henry Schein</td><td>121-7793</td><td>Drugs &amp;ndash; for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg</td></tr><tr><td>aCSF</td><td>Chemicals from Sigma</td><td>119 mM NaCl&lt;br /&gt;26.2 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;br /&gt;2.5 mM KCl&lt;br /&gt;1 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br /&gt;1.3 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br /&gt;10 mM glucose</td><td>For surgery&lt;br /&gt;From Cold Spring Harbor Protocols</td></tr><tr><td>TRITC-dextran 150,000 MW</td><td>Sigma</td><td>T1287</td><td>For intravenous administration to label vasculature</td></tr></tbody></table>

intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

תרשים סכמטי המתאר את הנגע למעוך עמודה הגבי מוצג באיור 1 א. לאחר הפגיעה, בעלי החיים מוכנים והתייצבו למיקרוסקופיה intravital באמצעות מהדק השדרה (איור 1). תמונה שצולמה מייד לאחר הפציעה למחוץ עמודה הגבי תערוכות נגע מלבני נראה בבירור עם נקודות החדרת שן מלקחיים שהם בבירור לזיהוי. האקסונים באתר הפציעה, נותקו על פני פרק הזמן של טור הגב כולו (איור 1 ג). שלמות כלי דם נותרה בשלמותה, ואין עדות לדליפת צבע הכלי זוהתה על ידי הקרינה. כדי לבצע הדמיה סידורי של אותו הנגע מעל שבועות, ניתן נתפרו השרירים והעור מעל laminectomy לחשיפה מחדש לאחר מכן. מורפולוגיה נגע דומה נצפית בנקודות זמן מאוחר יותר (1D דמויות, E). 5 ימים לאחר פציעה, אתרי החדרת מלקחיים עדיין נראים לעין אבל הנגע החל להגדיל בד הגודלue לפגיעה משנית הנגרמת על ידי דלקת. האקסונים בסוף הזנב של הנגע שחזרו מהאתר הראשוני של הפציעה באמצעות תהליך הנקרא &quot;dieback axonal&quot;. האקסונים בסוף מקורי של הנגע הציגו ניוון כמו-Wallerian (1D איור, E). בין ימים 5 ו -22 לאחר פציעה, בגודל של הנגע התייצב. במקביל, זרם גדול של CX3CR1 + תאים ניתן לראות שחדר ובמסביב לפצע למעוך בנקודתי הזמן הללו, אם כי זהותו של תאים אלה (מיקרוגליה לעומת מקרופאגים) לא ניתן להבחין בהכנה, כפי שמוצג באיור 1. כדי להבדיל את ההתנהגות של מיקרוגליה ומקרופאגים בתוך מייקרו-סביבת הנגע למעוך, מודל הכימרה הקרינה שימש (שמתואר באיור 2 א). ראשית, תאי אב במח העצם של עכבר + / GFP CX3CR1 מוחלפים בcel תורם לא פלורסנטls, כך microglia + GFP רק CNS-התושב גלוי על ידי הדמיה ניאון. היעילות של הכינון מחדש מח יכולה להיות מאושרת על ידי זרימת cytometry בחינת הדם ההיקפי 8 שבועות לאחר השתלת מח (איור 2 ב, ג). באיור 2, F4 / 80 ומקרופאגים החיוביים GFP, מסומן בכחול, המתגלים ב+ / GFP → C57BL / 6 עכבר chimeric CX3CR1, שבו כמה מונוציטים חיוביים שליליים אבל F4 / 80 GFP הם גם בהווה. באיור 2 ג, אין F4 הכפול חיובי / 80 ותאים חיוביים GFP נותרו לאחר החלפה של מח עצם נמען + / GFP CX3CR1 עם מח עצם מסוג בר. לפני פציעה, מיקרוגליה מופצים באופן שווה בתוך חוט השדרה, בו מוצגות מנוחה, מורפולוגיה מסועפת (איור 2 ד). 8 ימים לאחר פציעה, יכולים להתגלות רק כמה המיקרוגלים ובמסביב לפצע. microglia אלה להציג מורפולוגיה אמבואידית (איור 2E). שנית, עצםתאי אב במח בעכבר לא פלורסנט מוחלפים על ידי תאי מוח של עכבר + / GFP CX3CR1, לכן טיוח מח עצם נגזר CX3CR1 + מונוציטים / מקרופאגים הגלויים על ידי הקרינה GFP (איור 2 א). לפני פציעה, GFP + התאים זוהו רק במידה רבה perivascular, אשר כבר דיווחה להיות מח עצם נגזר ולהתהפך ללא הרף על בסיס קבוע 28 (איור 2F). לאחר פציעה למעוך, ניתן לראות תאים + / GFP CX3CR1 לאורך הצד הפנימי של כלי דם המקיפים את הנגע (איור 2H-J), ומרכז הנגע מלא בחדירת מקרופאגים CX3CR1 + / GFP (איור 2G). הדמיה הזמן לשגות של העמודות הגבי יכולה להתבצע עד 6 שעות. באיור 3, אנו מראים CX3CR1 אינו chimeric + / עכבר GFP מייד לאחר פציעה שבו תאים מהמחזור ניתן לראותn נע מכלי הדם לכיוון ליבת הנגע ומרגש באתר הפציעה (איור 3 א &#39;, ב&#39;; משלים סרט 1). ניתוח תמונת ניצול עוצמת הקרינה לזהות תאים יכול לעקוב אחר הנתיבים נלקחו על ידי מקרופאגים (איור 3 א &#39;, ב&#39;; משלים סרט 1). סטטיסטיקה נגזרת מניתוח ההדמיה מראה תנועתיות של מקרופאגים הממוצע בנגע היא 3.6 מיקרומטר / min (איור 3D). לבסוף, בעדיין ניתן לאתר 22 ימים לאחר פציעה, האקסונים, מיקרוגליה ומקרופאגים בתוך הנגע מפגין תחום ההדמיה יציב על פני תקופות זמן (סרט משלים 2) ארוכות. <img alt="איור 1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" width="600" /> איור 1: יצירה והדמיה רציפה של הפציעה למחוץ עמודה הגבי. (א) הגבפציעה למחוץ עמודה מתבצעת על ידי הסרת תהליך הגב של החוליה ברמת העניין. מלקחיים מוכנסים לתוך טור הגב של גזרי מ&quot;מ כבל 1 השדרה ולאחר מכן סגרו 3 פעמים כדי לייצר את הנגע שמוצג בסגול. (ב) בעלי החיים אז ממוקמים בחוט השדרה מלחציים להשיג יציבות להדמית intravital. (C) מייד לאחר פציעה, אתרי המלקחיים ההכנסה (סגלגל אדום) ומלבני פציעה למחוץ נפח (הקופסה האפורה) ניתן זיהו בבירור. האקסונים בשורשי הגב ניתן לראות (חצים לבנים), כמו גם את הקצוות הפצועים של האקסונים בצד הזנב של הנגע (ראשי חץ מלאים). (ד) 5 ימים לאחר פציעה, אתרי החדרת מלקחיים (סגלגל אדום ), ועדיין יכול להיות דמיין) המידה של הנגע (התיבה האפורה בקלות. הנגע גדל בגודל מאז העלבון הראשוני. האקסונים עוברים ניוון כמו-Wallerian ניתן לראות מקורי לנגע ​​(ראשי חץ פתוח) בadditiעל האקסונים בשורשים הגבי (חצים לבנים) ואת הקצוות של אקסונים נפצעו (ראשי החץ לבנים). (E) 22 ימים לאחר פציעה, אתר הנגע עדיין מזוהה עם ממדים דומים לפציעה לאחר 5 ימים. שים לב למספר הגדול של CX3CR1 + תאים ובסביב האתר נפצע. תכונות שכותרתו הן אותו הדבר כמו ב( D). כל הברים בקנה מידה = 200 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> איור 2: בנייה של עכברי chimeric כדי לעקוב אחר CX3CR1 + / GFP להביע מקרופאגים נגזרות מח CNS-תושב microglia או עצם בנגע למעוך עמודה הגבי. תרשים סכמטי של דור עכברי chimeric עם או CX3CR1 + / GFP להביע מיל ()croglia או מקרופאגים. ראשית, עכברי Thy-1 YFP H הם מוקרנים ובמח העצם מחדש עם תאי מח מבודדים מעכבר + / GFP CX3CR1, וכתוצאה מכך עכבר chimeric מקרופאגים שהם + GFP. שנית, Thy-1 עכברי H / CX3CR1 + / GFP YFP הם מוקרנים ובמח העצם מחדש עם תאי מח מבודדים מעכבר לא פלורסנט, הפקת עכבר chimeric המיקרוגלים שהם + GFP. (ב) דוגמא של זרימת cytometry נתונים עם תאי F4 / 80 + וCX3CR1 GFP + בדם מבעלי חי chimeric עם תורם מח + / GFP CX3CR1 הושתלו C57BL / 6 נמען מוקרן. דוגמא תאים שמקורם בתורמים החיוביים CX3CR1 כי הם חיוביים עבור שני GFP וF4 / 80 מוצגים בכחול מודגש אזור. (C) של זרימת cytometry נתונים עם F4 / 80 + וCX3CR1 GFP + תאים בבעלי חי chimeric עם C57BL6 מח תורם הושתלו irהמוקרן CX3CR1 נמען + / GFP. שים לב לחוסר CX3CR1 + / GFP החיובי הכפול וF4 / 80 תאים בתוך הכחול מודגש אזור. (ד &#39;) תמונת מצב מיקרוסקופית שני פוטונים intravital של עכבר מתכנית chimeric הראשונה, מראה GFP + מיקרוגליה עם מורפולוגיה מסועפת בתוך הגב עמודה (ראש חץ). תאים אלה ובין בין האקסונים (צהוב) בשורש הגבי ועמודה הגבי. בר סולם = 100 מיקרומטר. (E) ההדמיה Intravital של אותו העכבר ב( B) 8 ימים לאחר פציעת טור הגבי מגלה כמה CX3CR1 + מיקרוגליה עם גופי תא גדולים ואמבואידית בצורה שחסרות תהליכים (ראש חץ). בר סולם = 100 מיקרומטר (F) Snapshot. של עכבר מתכנית chimeric השנייה ב (א), מראה GFP + מקרופאגים זעומים, בתוך parenchyma CNS. בר סולם = 100 מיקרומטר. (G) ההדמיה Intravital של אותו העכבר ב( F) 8 ימים לאחר פציעת טור הגבי מגלים אלזרם arge של מקרופאגים ובמסביב לפצע. בר סולם = 100 מיקרומטר. תמונה בהגדלה גבוהה יותר של תאי דם + CX3CR1 נגזרים במגע עם הכלים בבעלי החיים ללא כל הפגע (H). בר סולם = 30 מיקרומטר. שיקום (I) של תאי CX3CR1 במגע עם הכלי, מבט מבפנים על הספינה. בר סולם = 30 מיקרומטר. (J) שחזור של תאי CX3CR1 במגע עם הכלי, מבט מבחוץ של כלי השיט. בר סולם = 20 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> איור 3 :. נתוני מעקב תא נציג בCX3CR1 אינו chimeric + / GFP עכבר מייד לאחר למחוץ עמודה הגביפציעה. (א) תמונת מצב של CX3CR1 מיקרוגליה + ומקרופאגים האקסונים סביב פגומים (צהובים) מסרט משלים 1 מייד לאחר פציעה למחוץ טור גב. (B) הנתיבים (האפורים) שצולם על ידי + תאי CX3CR1 ב (א) במהלך 110 דקות פגישת ההדמיה intravital. ייצוג מקודד זמן של המסלולים ב( ב) (ג). מסלולים הם בצבע המבוססים על הזמן שלהם בתוך הסרט כולו 110 דקות, כפי שמוצגים בסרגל הזמן. היסטוגרמה (D) של תנועתיות הכוללת של התאים + CX3CR1. כל הברים בקנה מידה הם 30 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52228/52228fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> סרט משלים 1: סרט intravital נציג מייד לאחר פציעה למחוץ עמודה הגבי בheterozygote הכפול Thy-1 YFP / + <stרונג&gt; / CX3CR1 GFP / + עכבר. הדמיה של עמוד השדרה Intravital בוצעה מייד לאחר פציעה למחוץ עמודה הגבי ברמת T11. פנל ימני מראה התנועה של מיקרוגליה CX3CR1 + ומקרופאגים. נתיבי תנועת התא מוצגים כפסים לבנים על הלוח השמאלי. הפציעה ממוקמת בפינה השמאלית העליונה. ניתן לראות CX3CR1 + תאים עוברים לאתר של הפגיעה במסלולים אלה. האקסונים מוצגים בצהוב. בר סולם = 40 מיקרומטר. סה&quot;כ זמן: 110 דקות. מהירות השמעה: 300x. סרט משלים 2:. סרט intravital נציג ב 22 ימים לאחר נגע למעוך עמודה הגבי בheterozygote הכפול Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + העכבר המוצג כאן הוא סרט נציג שצולם בעכבר 22 ימים לאחר למעוך עמודה הגבי הראשונית פגיעה ברמה T11 השדרה. Injאורי ממוקם בפינה הימנית העליונה של המסגרת. האקסונים עולים (צהוב) rostrally מוצגים בפינה הימנית התחתונה. כלי וריד הגבי ודם מסומנים עם TRITC-dextran (אדום). CX3CR1 + תאים בתוך מהלך הנגע במהירות איטית יותר בהשוואה לאלו מייד לאחר פציעה. בר סולם = 50 מיקרומטר. סה&quot;כ זמן: 90 דקות. מהירות השמעה: 600x.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury at JoVE.com

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

ההדמיה Intravital של axonal אינטראקציות עם Microglia והמקרופאגים בפגיעת Crush טור העכבר הגבי

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

intravital-imaging-axonal-interactions-with-microglia-macrophages

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K Views.  Case Western Reserve University. Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury. 

Video: Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

בתחום ההדמיה vivo של חוט השדרה בעזרת עכבר דו פוטון מיקרוסקופית

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

הדמיה חיה של אקסונים לאחר רוט הגבי Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as multiple sclerosis. Here we present a low-cost and reproducible glass window implantation protocol that is suitable for intravital microscopy and studying the dynamics of spinal cord cytoarchitecture with subcellular resolution in live adult mice with EAE. Briefly, we surgically expose the vertebrae T12-L2 and construct a chamber around the exposed vertebrae using a combination of cyanoacrylate and dental cement. A laminectomy is performed from T13 to L1, and a thin layer of transparent silicone elastomer is applied to the dorsal surface of the exposed spinal cord. A modified glass cover slip is implanted over the exposed spinal cord taking care that the glass does not directly contact the spinal cord. To reduce the infiltration of inflammatory cells between the window and spinal cord, anti-inflammatory treatment is administered every 2 days (as recommended by ethics committee) for the first 10 days after implantation. EAE is induced only 2-3 weeks after the cessation of anti-inflammatory treatment.
Using this approach we successfully induced EAE in 87% of animals with implanted windows and, using Thy1-CFP-23 mice (blue axons in dorsal spinal cord), quantified axonal loss throughout EAE progression. Taken together, this protocol may be useful for studying the recruitment of various cell populations as well as their interaction dynamics, with subcellular resolution and for extended periods of time. This intravital imaging modality represents a valuable tool for developing therapeutic strategies to treat autoimmune demyelinating diseases such as EAE.

We describe a method for implanting and maintaining glass windows over the exposed spinal cords of adult mice for studying experimental autoimmune encephalomyelitis. These windows provide chronic optical access to the spinal cord for monitoring cell dynamics at the subcellular level in live animals using two-photon microscopy.

השתלת זכוכית חוט השדרה של Windows בעכברים בוגרים עם ניסיון אוטואימוניות Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Medicine

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

טראומה מוחית חריפה בעכברים אחריו שני פוטונים הדמיה אורכית

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; חוט השדרה מושרה לייזר הפגיעה דגם להערכת מנגנוני axonal הניוון בזמן אמת

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

נוהל השתלה קאמרי בעמוד השדרה לאורך<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של כבל עכבר השדרה

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Vivo דואו-צבע שיטת הדמיה Dynamics כלי הדם בעקבות פגיעה בחוט השדרה Contusive

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

מיפוי המוח מדויק לבצע חוזרות ונשנות של הדמיה Vivo של נוירודינמיקה החיסונית בעכברים

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Immunology and Infection

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell types of an animal's brain, upon exposure to exogenous stimuli. Here, the administration of a closed-skull traumatic brain injury (TBI) and simultaneous implantation of a cranial window for subsequent longitudinal intravital imaging in mice is shown. Mice are intracranially injected with an adeno-associated virus (AAV) expressing enhanced green fluorescent protein (EGFP) under a neuronal specific promoter. After 2 to 4 weeks, the mice are subjected to a repetitive TBI using a weight drop device over the AAV injection location. Within the same surgical session, the mice are implanted with a metal headpost and then a glass cranial window over the TBI impacting site. The expression and cellular localization of EGFP is examined using a two-photon microscope in the same brain region exposed to trauma over the course of months.

This study demonstrates delivery of a repetitive traumatic brain injury to mice and simultaneous implantation of a cranial window for subsequent intravital imaging of a neuron-expressed EGFP using two-photon microscopy.

הדמיה תוך חיונית של ביטוי חלבון פלואורסצנטי בעכברים עם פגיעה מוחית טראומטית בגולגולת סגורה וחלון גולגולת באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

ההדמיה Intravital של axonal אינטראקציות עם Microglia והמקרופאגים בפגיעת Crush טור העכבר הגבי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video