Name: an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time
Uploaded: 2014-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time at JoVE.com

DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates &#8211; Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.

הערה: נהלי כל החיה בוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטה לואיוויל, הקפדה על תקנות הפדרליות. 1. הכנת נמוכה Ca 2 + 2 מ&quot;מ וCa 2 + מלאכותי נוזל השדרתי (aCSF) Perfusates <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 + (0.1 מ&quot;מ) חיץ 2x Ca הנמוך Stock C, Ca 2 + 2x הרגיל (2 מ&quot;מ) במלאי חיץ, ו2x Stock B חיץ כפי שמתואר בטבלה 1. פתרונות המניות הבודדים מאפשרים שינוי של תוכן יון (למשל, נמוך או אפס Ca 2 +) ויכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזלוף intracardiac במהלך נתיחה, להוסיף של 2x הנמוך Ca 2 + Stock C 100 מ&quot;ל ושל 2x Stock B 100 מיליליטר לבקבוק פלסטיק כדי להפוך את Ca הנמוך 1x 2 + aCSF. לערבב ולאחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס או לבצע טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפטוף של חוט השדרה vivo לשעבר במהלך מתאר לעצמיing, להוסיף 500 מיליליטר של נורמלי Ca 2 + Stock 2x ו -500 מיליליטר של 2x Stock B לתוך בקבוק זכוכית 1 ליטר לייצר aCSF 1x. לערבב ולאחסן את הלילה בטמפרטורת חדר או לבצע טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה- pH של מאגרי aCSF ל -7.4. תוך שמירה על aCSF בטמפרטורת חדר, למקם את Ca 2 + aCSF הנמוך על קרח ולאחר מכן בועת שני מאגרי גז carbogen (95% O 2; 5% CO 2) במשך 30 דקות לפני שימוש ורציף במהלך זלוף. </li></ol> 2. הכנת Ex Vivo הדמיה קאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף בשמיכת חימום (אין לכבות אוטומטי) סביב בקבוק aCSF ולהתאים חום להגדרה נמוכה / בינונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קו זלוף aCSF ייעודי לבקבוק מחובר למשאבת זלוף ובאונליין דוד הנשלט על ידי בדיקה טמפרטורת בקר הטמפרטורה ומשוב דו קוטבית כפי שמוצגת באיור 1 א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף להוסיף במה מיקרוסקופ השטוח (152 x 102 מ&quot;מ) לעירור / conf 2-הפוטוןהבמה מיקרוסקופ ocal מצוידת במכל לשפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח תא זלוף פתוח אמבטיה גדולה (H W x L x; 12 x 24 x 8 מ&quot;מ) לתוך המכל לשפוך כדי להתאים ולספק זרימה רציפה של aCSF מחומצן הטרי לחוט השדרה לשעבר vivo (ראה איור 1 ב ללשעבר מתאים vivo הדמיה עיצוב תא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר יציאת פלט המתכת של התנור באונליין לחדר ההדמיה vivo לשעבר באמצעות צינורות מתאימים. הנח כרית סופגת דקה מתחת לחדר ההדמיה vivo לשעבר כדי לעזור לשמור על הטמפרטורה של החיץ / הרקמות במהלך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדבוק חדר ההדמיה vivo לשעבר לתחתית של להכניס את המכל לשפוך / שלב באמצעות סימון דביק נשלף. גמישות של נקודת סימון הדביקה תאפשר הקאמרית להיות מותאמת לפי צורך כדי להבטיח נתיב האור של המטרה הוא בניצב למשטח הרקמה. במידת צורך, להשתמש ברמת מרכז המטרה להתאים את החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secureבדיקה באונליין משוב מחמם טמפרטורה ליד הכניסה הקאמרית הנוזל וצינור יניקת נירוסטה מחובר לקו ואקום ביציאה מהתא. מחזיקי סרט מגנטי וmicropipette המתאים שימושיים בהקשר זה. הפעל את מקור הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת זלוף להתחיל למלא את חדר ההדמיה עם aCSF מחומצן. הגדר את משאבת זלוף ל1.5-2 מיליליטר לדקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלוט בעוצמת הקול של aCSF בחדר ההדמיה על ידי התאמת קו הוואקום. חשוב שיהיו מספיק aCSF בחדר ההדמיה כדי לכסות את קטע חוט השדרה ולאפשר מרחק עבודה מספיק בין מטרת טבילה במים ועל פני השטח הרקמות. המיאלין והאקסונים יכולים להיות מושפעים לרעה אם מגזר הרקמה לא טבל לחלוטין בaCSF מחומצן הטרי מוביל חפצים לניסוי מושרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את בקר טמפרטורת התנור באונליין, כך שטמפרטורת perfusate בחדר ההדמיה היא טמפרטורת החדר ליד. </li></ol> &lt;class = &quot;jove_title&quot; p&gt; 3. Dissection של חוט השדרה למבוגרים Murine צוואר הרחם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים Thy1 מבוגר 6-10 שבוע ישן -YFP עכבר מהונדס (זן מתאים לשימוש שיש ביטוי חלבון פלואורסצנטי בנוירונים גנגליון שורש הגבי) על ידי הזרקה מנת יתר של נתרן pentobarbital הרדמה (200 מ&quot;ג / קילוגרם) באמצעות הזרקת intraperitoneal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמתחת לרמה הנאותה של הרדמה (למשל, אין תגובה לקמצוץ הבוהן ואובדן רפלקס מצמוץ), לגלח את העור שמעל חוט השדרה והמוח עם קוצץ כירורגית בזהירות. לטהר את העור באמצעות בטאדין ורפידות אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס חזה / אזור בטן עם אתנול 70%, תנקב את הנושא transcardially באמצעות Ca הנמוך מצונן, בועות-carbogen 2 + aCSF. (ראה תרשים 1C לספסל נתיחה הציע להקים עליון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכבד מחוויר, לאבטח את מחט זלוף אל הלב באמצעות קליפ קטן. הפוך את הנושא כדי לגשת לצד הגב המגולח שלהנושא ולנגב את האזור המגולח עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך עור גב לאורך קו האמצע מתחיל מהאף לירך באמצעות מספריים לנתיחה כדי לחשוף את המוח ועמוד השדרה (איור 2 א). לאבטח את ההכנה על ידי הצבת סיכות באף ובירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה מנקודה זו ואילך, לחתוך בחוזקה על פני השטח הגבי של הגולגולת ברמה של נורות חוש הריח. הכנס אחד הטיפים המספריים לקצוות לרוחב של החתך וחתך בשולי הכיפה ילטרלי עד המוח הקטן. הערה: אל תחתכי לגמרי הכיפה כפי שנדרש מאוחר יותר כדי להרים את הרקמות שמעליה מחוט השדרה לאורך דיסקציה (ראה איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את הכיפה כדי לחשוף את המוח. בעדינות לחתוך את הקצוות שמאליים וימניים של עצם interparietal (הממוקם במוח הקטן) ולמשוך אותו חזרה caudally לחשוף את גזע המוח / חוט השדרה (איור 2 ג </strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים דקים שקצהו נערכו בזווית של 45 מעלות למשטח השולחן ולחתוך את החוליות דו-צדדי רק נחותות שורשי עצבים האחוריים. הערה: יש להימנע ממגע עם עמודות גב לבן הבוהקות. סיבים אלו הם אלה שיהיו צילמו (איור 2 ד) ויכול להיפגע בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את פני השטח כיפה וגב של עמוד השדרה עם מלקחיים קנס היטה, משייכתו בעדינות את הרקמה שמעליה בחתיכה אחת כמו קיצוצים נעשים כדי לחשוף את חוט השדרה. תמשיך לחתוך חוליות למפלס העליון של בית החזה כדי לבודד קטע 1-2 סנטימטר של חוט צוואר הרחם להדמיה הבאה (איור 2E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כדי לחתוך את הרקמה המקבילה / עצם עמוד השדרה והרקמות ברורות מתחת לעמודה. לבצע חתכים אלה כרמה ככל האפשר. זה מאוד חשוב כי הרקמה מונחת ישר בחדר, כך שהכבל היא רמה להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באזמל # 11 ויחצה את גזע המוח (בעברסיום של סיבי fasciculus החינניים) והן ברמת בית החזה העליונה לבודד את קטע חוט השדרה הצווארי (ראה תרשים 2F). השתמש במספריים לחיתוך ברקמה / עצם באותו שתי נקודות הללו. הרקמה המבודדת צריכה להכיל 2/3 של עמוד השדרה המקיף את גזע המוח הזנב, הרחבת צוואר רחם, וחוט השדרה החזי עליון (איור 2G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את עמוד השדרה המבודד לצלחת פטרי של, Ca הנמוך המקורר-מבעבע carbogen 2 + aCSF. במידת צורך, לחתוך את הרקמה מתחת לעמוד השדרה עד שמונח ישר בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את עמוד השדרה המבודד לvivo לשעבר חדר ההדמיה ולהגדיל בהדרגה את טמפרטורת perfusate מעל 1 שעה ל36-37 מעלות צלזיוס. לשמור על טמפרטורה זו במהלך הדמיה. </li></ol> 4. מיקום של כבל Ex Vivo השדרה להדמיה קאמרית והמיאלין תיוג עם הנילוס אדום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאבטח היטב את עמוד השדרה בiתא maging עם הפרוסה הולמת מתאימה החזק שונה עם פלטפורמת רשת אנכית המורכבת מנושאי לייקרה משובחים (להסיר אשכולות אמצע פלטפורמת רשת כדי לאפשר מקום לחוט השדרה, ראה איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot של Red הנילוס (5 מניות מ&quot;מ DMSO ו0.22 מיקרומטר המסונן; יכול להיות מאוחסן במשך חודש 1 על 4 מעלות צלזיוס, או 6 חודשים ב -20 ° C בחושך). רק לפני הוספת הנילוס האדום לחדר ההדמיה, להפחית את הזרימה של משאבת זלוף ולהתאים את קו הוואקום כדי להבטיח את הנוזל בתא תמיד מכסה את חוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פתרון מניות 5-10 μl הנילוס האדום לחדר ההדמיה לקראת סוף הזנב של הכבל (איור 3). השתמש פיפטה 1 מיליליטר לערבב בעדינות הנילוס אדום ברחבי החדר. לאפשר הנילוס האדום להישאר בחדר במשך 1-2 דקות, ואז למקם את קו ואקום אחורי ולהתאים משאבת זלוף ל1.5-2 מיליליטר לדקה לינקב בחוט השדרה ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות את הבמה מיקרוסקופ בזהירותוליישר את המטרה עם המרכז של מגזר חוט השדרה ומדיאלית על עמודות הגב עד אובייקטיבי טבילה במים הוא כ -10 מ&quot;מ מפני שטח של aCSF בתא. השתמש בגלגל פוקוס מזנקי מיקרוסקופ כדי להביא את המטרה לאט למטה עד שנוגע בעדינות את פני השטח של aCSF. השתמש במקור אור epifluorescent להתמקד עמודות הגב לשדה הראייה (איור 3 ג). </li></ol> 5. Ex Vivo הדמיה של כבל עכבר השדרה עם TPLSM וחוט השדרה מושרה לייזר פגיעה (LiSCI) הערה: הווריד האחורי מספק סמן שימושי כדי למרכז את הרקמה כסיבי fasciculus החינניים (מקורן גוף תא של גרעיני שורש הגבי ולעלות מT6 ומתחת לאורך קו האמצע של חוט השדרה) במקביל לכלי דם זה. + תחזיות עבות YFP צוואר רחם גב השורש גם מספקות סמן שימושי כמו Ascend הסיבים ויורדות רוחבי לYסיבי FP + fasciculus החינני שהם קטנים יותר בקוטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שרקמת חוט השדרה מיושרת כראוי, עבור למצב סריקת לייזר לבצע הדמיה בסיסית של סיבי myelinated fasciculus החינני עולים. כדי לעורר את שני YFP והנילוס האדום, להשתמש במקור לייזר שני פוטונים מכוון לגל 950 nm (~ 17 mW נמדד ביציאה של 25x, 1.1 אובייקטיבי NA) וdichroics המתאים (DM) ומסנני bandpass לבודד את פליטת הניאון של fluorophores (אנו משתמשים DM560 525/50, 600/60 DM640, ו685 / 70, להפריד YFP, והנילוס אדום לצהוב-כתום, וערוצים אדומים מורחבים, בהתאמה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יותר מ -3% מהאקסונים להראות spheroids axonal במהלך ההדמיה בסיס (30-60 דקות), לבטל את ההכנה בשל ממצאים הנוצרים על-הנסיין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום LiSCI על ידי מגדלת שדה הראייה ל30.3X (כדי ליצור ~ 20 מיקרומטר אבלציה קוטר). Tune הלייזר עד 800 ננומטר, ולהגדיל את כוחו של הלייזר ל~ 110 mW בהמדגם. הרשה 5 תחום סריקות לייזר תצוגה מלא כדי להבטיח סיבי transected לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר LiSCI על ידי שינוי הגדרות בלייזר בחזרה להגדרות הדמיה (950 ננומטר, 17 mW במדגם, 2.08X) ולסרוק את הרקמות כדי להמחיש את אבלציה. ודא בקוטר של אבלציה ושהאקסונים מלוטשים הראשוניים transected לחלוטין (ראה איור 3D). השתמש בהגדרות הזמן לשגות במיקרוסקופ בשילוב עם לכידת z כדי להקליט את התגובה הדינמית של אקסונים ומיאלין לפציעה עד 8-10 + שעות לאחר פציעה. הערה: אם אבלציה אינה שלמה (כלומר, חיתוך רוחב שלם של סיבים), לבטל את ההכנה, כקביעת מנגנוני פציעה ראשוניות ומשניים יהיה מבולבלות. בנוסף, ניתן הדמיה מגזרי חוט השדרה מבודדת עד 24 שעות לאחר LiSCI עם רק קל עד בינוני נזק לרקמות LiSCI-עצמאית. </li></ol>

<ol>
	<li>Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+long-distance+axon+regeneration+in+the+injured+CNS.">The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS.</a> Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).</li><li>Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+mechanisms+regulating+axon+regeneration:+an+integrin+perspective.">Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective.</a> Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).</li><li>McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+factors+in+combinatorial+approaches+for+spinal+cord+regeneration.">Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration.</a> Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).</li><li>Pernet, V., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Nogo-A+in+axonal+plasticity,+regrowth+and+repair.">The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair.</a> Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).</li><li>Bradbury, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitinase+ABC+promotes+functional+recovery+after+spinal+cord+injury.">Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury.</a> Nature. 416, 636-640 (2002).</li><li>Cregg, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+beyond+the+glial+scar.">Functional regeneration beyond the glial scar.</a> Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).</li><li>Park, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+axon+regeneration+in+the+adult+CNS+by+modulation+of+the+PTEN/mTOR+pathway.">Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway.</a> Science. 322, 963-966 (2008).</li><li>Coleman, M. P., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration,+wld(s),+and+nmnat.">Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).</li><li>Sulaiman, W., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+peripheral+nerve+injury,+regeneration,+and+functional+recovery:+from+bench+top+research+to+bedside+application.">Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application.</a> Ochsner J. 13, 100-108 (2013).</li><li>Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+a+new+growth+cone+after+axotomy:+the+precursor+to+axon+regeneration.">Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).</li><li>Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorganized+microtubules+underlie+the+formation+of+retraction+bulbs+and+the+failure+of+axonal+regeneration.">Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration.</a> J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).</li><li>Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+axonal+degeneration+'dieback'+in+the+corticospinal+tract+after+transection+injury+of+the+rat+spinal+cord:+a+confocal+microscopy+study.">Retrograde axonal degeneration 'dieback' in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study.</a> J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).</li><li>Fishman, P. S., Mattu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+severed+cortical+projection+axons.">Fate of severed cortical projection axons.</a> J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).</li><li>McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+activated+phagocytes+and+myelin+degeneration+to+axonal+retraction/dieback+following+spinal+cord+injury.">The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury.</a> Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).</li><li>Stirling, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+treatment+reduces+delayed+oligodendrocyte+death,+attenuates+axonal+dieback,+and+improves+functional+outcome+after+spinal+cord+injury.">Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+laser-scanning+microscopy+of+Ca2++dynamics+in+visual+motion-sensitive+neurons.">In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons.</a> Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).</li><li>Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+of+cortical+astrocytic+networks+in+vivo.">Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo.</a> PLoS Biol. 2, 96 (2004).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-+and+short-term+intravital+imaging+reveals+differential+spatiotemporal+recruitment+and+function+of+myelomonocytic+cells+after+spinal+cord+injury.">Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury.</a> J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).</li><li>Canty, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+single+neuron+axotomy+triggers+axon+regeneration+to+restore+synaptic+density+in+specific+cortical+circuits.">In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits.</a> Nat Commun. 4, 2038 (2013).</li><li>Dibaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NO+mediates+microglial+response+to+acute+spinal+cord+injury+under+ATP+control+in+vivo.">NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo.</a> Glia. 58, 1133-1144 (2010).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia,+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li><li>Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+microglia+in+the+mouse+cortex+in+vivo.">Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen-induced+perivascular+microglial+clustering+is+required+for+the+development+of+axonal+damage+in+neuroinflammation.">Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation.</a> Nat Commun. 3, 1227 (2012).</li><li>Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+maintenance+of+molecular+domains+in+myelinated+axons.">Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons.</a> J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).</li><li>Stirling, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+2-mediated+alternative+activation+of+microglia+is+protective+after+spinal+cord+injury.">Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury.</a> Brain. 137, 707-723 (2014).</li><li>Greenspan, P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrofluorometric+studies+of+the+lipid+probe,+nile+red.">Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red.</a> J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).</li><li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+red:+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets.">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).</li><li>Tajima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+hemodynamic+response+to+acute+hyperoxia+in+awake+mice.">Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice.</a> Brain Res. 1557, 155-163 (2014).</li><li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms.">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80, 900-913 (2013).</li><li>Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+behavior+activates+Bergmann+glial+networks.">Motor behavior activates Bergmann glial networks.</a> Neuron. 62, 400-412 (2009).</li><li>Tsutsui, S., Stys, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+injury+to+axons+and+myelin.">Metabolic injury to axons and myelin.</a> Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).</li><li>Matute, C., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+white+matter+in+central+nervous+system+pathophysiologies.">Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies.</a> ASN Neuro. 4, (2012).</li><li>Matute, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dyshomeostasis+in+white+matter+pathology.">Calcium dyshomeostasis in white matter pathology.</a> Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).</li><li>Stys, P. K., Lipton, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+matter+NMDA+receptors:+an+unexpected+new+therapeutic+target.">White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target.</a> Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).</li><li>Baltan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+anoxia:+a+tale+of+two+white+matter+tracts.">Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts.</a> Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).</li><li>Stirling, D. P., Stys, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+injury:+internodal+nanocomplexes+and+calcium+deregulation.">Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation.</a> Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).</li><li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+anti-stokes+Raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+tissues.">Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues.</a> Biophys J. 89, 581-591 (2005).</li><li>Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+spheroid+formation+in+central+nervous+system+Wallerian+degeneration.">Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).</li><li>Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+membrane+sealing+in+injured+mammalian+spinal+cord+axons.">Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons.</a> J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).</li><li>Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen, ., R, S., Stys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axoplasmic+reticulum+Ca(2+)+release+causes+secondary+degeneration+of+spinal+axons.">Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons.</a> Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

אנו מתארים שיטה של הדמיה לשעבר ההדמיה vivo האקסונים myelinated חוט השדרה (כלומר, fasciculus החינני) בשילוב עם פגיעה בחוט השדרה מושרה לייזר ללמוד את ההתקדמות הדינמית של שני ניוון axonal myelinated הראשוני והמשני לאורך זמן. Ex vivo של פני השטח של חוט השדרה מתגבר רב של הסיבוכים הקשורים להדמיה in vivo כגון חפצי תנועה ואת הפוטנציאל של היפוקסיה המושרית הנסיין במהלך פגישות הדמיה ממושכות. פרוטוקול זה מבודד את קטע צוואר הרחם השלם של חוט השדרה באמצעות perfusates מחומצן המכיל Ca 2 + נמוך ונמנע נזק של סיבי axonal שמעליה, נסיגה נפוצה נתקלה במהלך טור הגבי או תכשירי רצועת חומר לבנים הגחון. בנוסף הוא מאפשר לחוקר כדי לתפעל מייקרו-הסביבה של חוט השדרה המבודד לפני או לאחר פגיעה בחוט השדרה (למשל, שינוי של Ca 2 +ריכוז ו / או תוספת של חומרים כימיים תרופות). בניגוד לחיתוך הרוחב, החבלה, או לרסק דגמי SCI המשפיעים על שטח רחב של אקסונים, הטבע הממוקד ביותר של LiSCI מאפשר מחקר בו זמני של פגיעה הראשונית (האקסונים transected) ונזק axonal המשני מאוחר יותר מתרחש. Vivo ההדמיה תיארה לשעבר ופרוטוקול LiSCI יכולים להיות מנוצל כדי לחקור רכיבים אחרים של פגיעה בחומר לבנה כוללים demyelination, neuroinflammation הנגרם על ידי תאי מערכת חיסון CNS-מתגורר כוללים מיקרוגליה, ומנגנוני anoxic / פציעת איסכמי. גם מחקרים אלה יכולים להתמקד באקסונים טור-גב בפרוטוקול או שינויים הנוכחיים יכול להתבצע לתמונת שטחים אחרים הממוקמים באופן שטחי השדרה חומר לבן. בנוסף, זני עכברים הטרנסגניים מהונדסים או כפולים אחרים עשויים לשמש גם עם פרוטוקול זה ללמוד הפעלה / פעילותם של תאים במערכת העצבים המרכזית-מתגוררים. ישנן מספר con הקריטיsiderations לבידוד מוצלח והדמיה של עכברי vivo לשעבר חוט השדרה. ראשית, מאגרי aCSF צריכים להישמר מחומצן למניעת היפוקסיה. חוט השדרה צריך להישמר לחה על ידי כך שקוע בaCSF מחומצן בזמן ואחרי הבידוד. במהלך נתיחה, עדיף לצמצם את הלחץ מכאני על חוט השדרה כגון לחץ מוגזם מהפיל את הרקמה שמעליה בחוזקה מדי ומתיחה / כיפוף בעמוד השדרה בעת שחרור הרקמות שמתחת לקטע עמוד השדרה. יתר על כן הוא חיוני לא לגעת / לדחוס את העמודות בעמוד השדרה הגבי. שמירה על טמפרטורת perfusate aCSF האופטימלית בחדר ההדמיה חשובה גם מאז סביבת hyperthermic עשויה להדגיש את רקמת חוט השדרה. כדי להבטיח שהאקסונים הם transected לחלוטין במהלך LiSCI, חשוב כדי לשתק את קטע הרקמה בתא vivo לשעבר כדי למזער את תנועת רקמה פוטנציאלית במהלך ablat הלייזריון. בנוסף הרקמה באתר אבלציה הרצויה צריכה לשכב בחדר ההדמיה (בניצב לעדשה האובייקטיבית). LiSCI מבוצע על רקמות שאינה מובילה לרמת אבלציה נטויה אשר מסבכת ניתוח תמונה שלאחר מכן ומפחיתה את בהירות תמונה הכוללת. לבסוף, עומק הרקמה של אבלציה הלייזר עשוי להשפיע על תוצאות LiSCI. אנו מציעים להגדיר המוקד לאבלציה להיות סביב 12-15 מיקרומטר להלן מאטר פיא. מגבלה העיקרית לשימוש במודל ההדמיה vivo לשעבר זה לבחון מנגנוני האקסון ופציעת המיאלין היא שלא ניתן לקבוע את ההשפעות של תאים שמקורם דם היקפיים הבאים LiSCI. יתר על כן, מכיוון שמדובר במודל מסוף, לא ניתן להעריך את התוצאות ההתנהגותיות והתחדשות הבאות הפציעה. אילוץ לvivo לשעבר מודל הדמיה זו LiSCI משותף עם ההדמיה in vivo הוא העומק שהוא מסוגל להיות נפתר עקב sc האור החזקattering מאפיינים של החומר לבן בחוט השדרה. לפיכך, לשעבר מודל הדמיה זו vivo חוט השדרה מתמקד בעיקר בתחזיות המרכזיות עולים מתאי העצב התחושתיים גנגליון שורש הגבי שהם הסיבים הנגישים ביותר לדמיין שכן הם נמצאים על פני השטח הגבי של חוט השדרה. שטחים אחרים myelinated axonal כגון יורד אקסונים מנוע עשוי להגיב באופן שונה לאחר פציעה בהשוואה לאקסונים החושי עולה המתועד בפרוטוקול זה. עוד מגבלה משותפת לשניהם הדמיה in vivo ועם פרוטוקול ההדמיה vivo לשעבר שלנו היא משך ההדמיה. בעוד ששיטה זו vivo לשעבר היא אמצעי מצוין לחקר מנגנוני פציעה אקוטיים, שינויי axonal אורך טווח ארוך הדמיה באותו vivo לשעבר קטע הרקמה עשויים להיות מעשיים. בדרך כלל אנחנו תמונת הרקמה מבודדת בחוט השדרה ל6-10 שעות לאחר LiSCI ללא כל נזק לרקמות LiSCI-עצמאית בולטות; עם זאת, יש לנו צילמו קטע חוט השדרהעד 24 שעות לאחר LiSCI רק עם ניוון רקמות מתון שאינו קשור לפציעה המושרית. עם זאת, אם קטע חוט השדרה היה צילם לתקופות זמן ארוכות יותר, תיוצר בהכרח חלק התמוטטות רקמה, שאינו תלויה אבלציה הלייזר. למרות מגבלות אלה במודל שלנו לשעבר הציע vivo חוט השדרה LiSCI, הידע שיכול להיות שנרכש מvivo לשעבר הדמיה זו בחוט השדרה ומודל LiSCI דודתי יכולת הרומן להבחין בין פגיעה הראשונית ומשנית פציעה בזמן אמת להערכת היעילות של חומרים כימיים תרופות ומניפולציות סביבתיות לאחר injury- עשוי להניב תובנות רבות ערך למנגנונים של axonal הדינמי ותגובות המיאלין בעקבות פציעה.

ניוון של אקסונים הוא סיבה בולטת של תחלואה פורש כמה תנאי נוירולוגיות כוללים neurotrauma, שבץ, אוטו-אימוניות, ומחלות ניווניות. בניגוד למערכת העצבים ההיקפי (PNS), מערכת עצבים מרכזית יש אקסונים (CNS) קיבולת מוגבלת להתחדש נפצע פעם הן בשל חסמים פנימיים וחיצוניים (כלומר, מולקולות מעכבות לצמיחת axonal הופקה במהלך היווצרות צלקת ושחררה במהלך ניוון המיאלין) 1 -7. למרות שכמה ממחסומים אלה נחקרו בהרחבה, התערבויות טיפוליות שמטרתה למנוע ניוון axonal CNS, לקדם התחדשות axonal חזקה, ולשחזר connectively הפונקציונלי, תישאר מוגבל. האקסונים מופרדים מפעם אחת סומה לעבור תהליך של הניוון סטריאוטיפי הידוע כניוון Wallerian המתאפיין בנפיחות axonal, היווצרות אליפטית ופיצול סופו של דבר (שנסקר ב8). בלעומת זאת, הגדם הפרוקסימלי שנותר ברציפות עם סומה של האקסון היקפי transected, יוצר נפיחות בקצה שלה, מת חזרה לצומת הקרובה ביותר ל Ranvier, ולאחר מכן יכול ליזום היווצרות חרוט צמיחה, תנאי חיוני נחוץ להתחדשות axonal הבאה 9-11. בניגוד לכך, הסופים axonal הפרוקסימלי של אקסונים רבים מרכזיים יוצרים &quot;endbulbs&quot; אופייני או נורות הכחשה, לא מצליחים ליצור קונוסים צמיחה, ובמקום לחזור ממקום הפציעה שם הם נמצאים במשך חודשים לאחר פציעת 12-15. בנוסף לפציעת axonal העיקרית, נזק / הפסד axonal נוסף עלול להתרחש גם לאקסונים שנחסכו במידה רבה מהפגיעה הראשונית. אובדן axonal עיכוב זה של אקסונים בתחילה חסכו מכונה ניוון axonal המשני כ. תגובה טבעית זו של האקסונים במערכת העצבים המרכזית לפגיעה הופכת התחדשות axonal תפקודית קשה עוד יותר להשיג את המטרה במוח ובחוט השדרה. למרות חהllmarks פציעה axonal (למשל, היווצרות אליפטית, נורות הכחשה) מתאפיינת גם מרקמות שלאחר המוות ומודלים ניסיוניים של ניוון axonal, הבהרת המנגנונים המולקולריים שבבסיס תהליכים הדינמיים אלה הוגבלה. רוב המחקרים האלה הסתמכו על תצפיות נקודת סיום סטטי שמטבעם לא הצליחו ללכוד תגובות axonal בודדות לאורך זמן. למרות אקסוגני מיושם קליעים נותבים axonal היו מועילים להבהיר תגובות axonal מסעיפי סטטי ובמהלך ההדמיה חיה, את הזמינות של סמני axonal מקודד גנטי השתפרה מאוד את היכולת שלנו לדמיין האקסונים בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ואכן, דו&quot;ח זרע מKerschensteiner והעמיתים סיפק ראיות ישירות של ניוון והתחדשות axonal הראשון in vivo באמצעות עכברי Thy1 -GFP-S שמקודדים חלבון פלואורסצנטי ירוק בתת קבוצות של תאי עצב ששולחים תחזיות שלהם בעמודות הגב של עמוד השדרהכבל 16. הדמיה חיה גישות באמצעות שתי מיקרוסקופיה פוטון סריקת לייזר (TPLSM) וסימון חלבון פלואורסצנטי הגנטי של תאי העניין ממשיך לספק ראיות ישירות ותובנה מכניסטית לרבים תהליכים דינמיים מגוונים כגון ניוון axonal, Ca 2 + איתות, התחדשות axonal, פיזיולוגיה astrocyte, פיזיולוגיה microglial, ותגובה לפציעה 17-25. בניגוד לאקסונים, מעט מאוד ידוע של תגובות מיאלין לפציעה בזמן אמת. מיאלין הוא רכיב חיוני של חומר לבן המופק ומתוחזק על ידי oligodendrocytes בתאי מערכת העצבים המרכזית ושוואן בPNS. המיאלין מבודד 99% מהשטח של אקסונים ועל ידי כך מספק גבוהה התנגדות, כיסוי מגן נמוך קיבול התומך בהתפשטות מהירה ויעילה קופצנית דחף, נבדקה לאחרונה על ידי Buttermore et al. 26. כדי ללכוד את התגובה הדינמית של מיאלין לפציעתם אנו משתמשים solvatochromic, lipophilicצבע פלואורסצנטי הנילוס אדום 27. מאפייני solvatochromic של כתם חיוני זה מאפשרים משמרות רפאים של ספקטרום הפליטה שלה, כי הוא תלוי בסביבה הפיסיקלית הכימית 28,29. מאפיינים אלה הם שימושיים כדי לקבל תובנה מנגנונים של פגיעת axomyelinic וניתן דמיינו באמצעות dichroics כראוי נבחר ומסנני פליטה או נפתרו באמצעות מיקרוסקופ רפאים 27. לדוגמא, ספקטרום הפליטה של הנילוס האדום הוא בסביבות פחות קוטביות, שומנים בדם עשיר כמו אלה שנמצאו בתאי שומן והמיאלין במערכת העצבים המרכזית נורמלי (פליטת שיא ~ 580-590 ננומטר) 27 העבירו כחול. בניגוד לכך, פסגות ספקטרום פליטה של צבע חיוני זה ב ~ 625 nm בendbulbs נוצר כהאקסונים עוברות dieback axonal 27. למרות שהמנגנון המדויק שבסיס משמרות הרפאים האלה במיוחד בendbulbs לעומת המיאלין נורמלי עדיין אינו ברור, שינויי רפאים כזה עשויים לחשוף שינויים הבסיסיים בהצטברות חלבון או חוסר ארגון מוביל לחשיפה של אתרי קישור הידרופובי 27. בעוד ההדמיה in vivo הוא המדד האולטימטיבי להתבוננות דינמיקת פציעת axonal חוט השדרה בסביבה הטבעית שלהם, זה מאתגר מבחינה טכנית ודורש מומחיות כירורגית משמעותית, ולעתים קרובות חוזרים ניתוחים לחשוף את העמודה הגבית שעשויה להציג את ממצאי ניסוי (למשל, דלקת וצלקת היווצרות). בנוסף, ציוד יקר יש צורך לעתים קרובות כדי לאפשר השעיה ומיצוב של בעלי חיים שלמים תחת העדשה האובייקטיבית מיקרוסקופ. בעלי החיים צריכים להיות במעקב צמוד וכן כדי להבטיח שהם יישארו חמים, כדי להבטיח נוזלים מתחדשות, ועל מנת להבטיח אין סימנים של חוסר חמצן בגלל ממושכת פגישות הדמיה בהרדמה. האחרון הוא חשוב מאוד כאקסונים והמיאלין בהחלט דורשים זלוף קבוע ורמות חמצן נאותות להישאר בת קיימא. עם זאת, זו היא לעתים קרובות לא דווחה או במעקב ברוב במחקרי vivo לתאריך. בנוסף, חפצי תנועה בשל קצב לב ונשימה (isoflurane מורדמים עכבר מבוגר: ~ 300-450 פעימות לדקה (BPM) היא אופטימליות כדי לשמור על 97-98% רוויון חמצן (שיעור ~ 632 BPM הרגיל) ו~ 55-65 נשימות לדקה (קצב נורמלי הוא ~ 163 נשימות לדקה), בהתאמה)) 30 נתקלו במהלך in vivo איפור הדמיה חוט השדרה הבחנה תגובות פציעת axonal ראשוניות ומשנית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה מאתגרים כמו גם סריקות הלייזר המהירות ביותר באופן בלתי נמנע כפופים לתנועה הבאות חפצים. התקדמות בסורקי התהודה ultrafast בשילוב עם חלון השדרה נוקשה מושתל ממוסגר עשויים לאפשר הדמיה של עמוד השדרה העכברית בבעלי חיים ער, אבל פעמים סריקה מהירה יותר באופן בלתי נמנע להפחית את האות לאיכות תמונה משפילה יחס רעש. שיפורים נוספים בטכניקות הדמיה חוט השדרה הכמשמשים כיום להדמיה מוחית יכולים להתגבר על מכשולים רבים של אלה ולהגביל את הבלבול פוטנציאלי שהוצג על ידי inaזלוף הרקמה dequate, למשל, 31-33. הרבה ממה שידוע על פיזיולוגיה חומר לבנה ומנגנונים של פגיעה בחומר לבנה כבר נקבע באמצעות במבחנה או תכשירי vivo לשעבר של חומר לבן מעצב ראייה, עצבים היקפיים, ורצועות של חומר לבן בחוט השדרה 34-41. הכנות אלה ימשיכו לקדם את הידע של מנגנוני פציעה בחומר לבנים שלנו מאחר שהם מאפשרים מבוקרים שינויים בגורמים סביבתיים, יישום מבוקר של תרופות וחומרים כימיים, הערכות תפקודיות באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, ותצפיות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ישירות של אקסונים והמיאלין ברקמה חי. ובכל זאת, כמה גישות קודמות להתבונן האקסונים מרצועות עמודה הגבי חוט השדרה או רצועות חומר לבנים הגחון בלתי נמנע לפגוע האקסונים פני השטח במהלך שלב הסילוק שעשוי להשפיע על התגובה של אקסונים התנגדו באופן הדוק. כדי לנצל את מניפולציות ניסוי לעיל ולמנוע נזק לveסיבי ר&quot;י תחת חקירה, אנו משתמשים במודל כבל vivo לשעבר צוואר רחם השדרה כפי שהוא מונע מגע ישיר של ההיבט הגבי של החוט. לפיכך, את הארכיטקטורה של מאטר פיא ואקסונים טור גב שטחי סמוכים להישאר קיימא ומוטרד בבידוד. כאן אנו מתארים גישה פשוטה יחסית, המאפשרת הדמיה ישירה של אקסונים myelinated המרכזיים כפי שהם באופן דינמי להגיב לפציעת מוקד בזמן אמת עד 8 - 10 + שעות לאחר פציעה. פגיעה בחוט השדרה המודל מושרה הלייזר (LiSCI) מאפשר הבחנה בין מנגנונים הראשוניים ומשניים פציעת axonal כנגע הראשוני (אתר אבלציה) נותר מוגבלים במרחב לאורך זמן. חדר ההדמיה פתוחה האמבטיה נגיש להתערבות טיפולית, משלוח מגיב, ומניפולציות סביבתיות. סוכני מגן axomyelinic משוערים ניתן להעריך במהירות בזמן אמת על ידי תצפיות ישירות לעומת ניסויים ממושכים ויקרים הכרוכים בתהליך הרקמהing, חתך, immunostaining, לכידת תמונה, וניתוח, ולכן מספק מודל פונדקאית שימושי כדי להעריך את תגובות חריפות ומניפולציות מגן לפני בדיקת הסוכנים הניסיוניים בבעלי חיים.

<table><tbody><tr><td>Large bath chamber with slice supports</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27L</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Standard Slice Supports</td><td>Warner Instruments</td><td>SS-3</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers</td><td>Warner Instruments</td><td>SHD-27LP/10</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed</td><td>Warner Instruments</td><td>ST-1L</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Solution In-line heater/cooler</td><td>Warner Instruments</td><td>SC-20</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Instruments</td><td>CL-100</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Liquid Cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Cable assembly for heater controllers</td><td>Warner Instruments</td><td>CC-28</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Replacement bead thermisitor for CC-28 cable</td><td>Warner Instruments</td><td>TS-70B</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Magnetic holder with suction tubing</td><td>Bioscience Tools</td><td>MTH-S</td><td>To hold the stainless steel vacuum suction tubing&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Adjustable holder</td><td>Bioscience Tools</td><td>MTH</td><td>To hold the temperature probe</td></tr><tr><td>clear silicone sealant</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>superglue</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>thin plexiglass strips</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>nile red</td><td>Life Technologies</td><td>N-1142</td><td>For labeling myelin</td></tr></tbody></table>

an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time

אקסונים CNS נפצעו מצליחים להתחדש ולעתים קרובות לחזור ממקום הפציעה. האקסונים חסכו מהפגיעה הראשונית עשויים מאוחר יותר לעבור ניוון axonal המשני. חוסר היווצרות חרוט צמיחה, התחדשות, ואובדן של תחזיות axonal myelinated נוספות בחוט השדרה מאוד מגביל התאוששות נוירולוגית בעקבות פציעה. כדי להעריך איך מרכזי האקסונים myelinated של חוט השדרה מגיבים לפציעה, שפיתחנו vivo לשעבר המתגורר מודל חוט השדרה ניצול עכברים הטרנסגניים המבטאים חלבון צהוב ניאון באקסונים ומוקדים ופגיעה בחוט השדרה נגרם-לייזר לשחזור מאוד לתעד את גורלם של האקסונים והמיאלין (צבע ניאון lipophilic הנילוס אדום) לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופיה זמן לשגות עירור שני פוטונים. תהליכים דינמיים כגון פגיעה חריפה axonal, הכחשה axonal, וניוון המיאלין נלמדים הטובים ביותר בזמן אמת. עם זאת, האופי הלא-המוקד של פציעות המבוססת על חבלה וחפצי תנועה נתקל בבמהלך in vivo איפור הדמיה חוט השדרה הבחנה תגובות פציעת axonal ראשוניות ומשנית באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה מאתגר. לשעבר מודל חוט השדרה vivo המתואר כאן מחקה כמה היבטים של חבלה / פתולוגיות axonal מושרה דחיסה רלוונטיות קליני כוללים נפיחות axonal, היווצרות אליפטית, חיתוך רוחב axonal, ופרי-axonal נפיחות מתן מודל שימושי ללמוד תהליכים הדינמיים אלה בזמן אמת. יתרונות עיקריים של מודל זה הם ברזולוציה spatiotemporal מצוינת המאפשרת הבחנה בין העלבון העיקרי שפוגע ישירות אקסונים ומנגנוני פציעה משניים; עירוי מבוקר של חומרים כימיים ישירות לרחצת perfusate הכבל; שינויים מדויקים של הסביבה הסביבתית (למשל, סידן, יוני נתרן, תורמים ידועים לפציעת axonal, אבל כמעט בלתי אפשרית לתפעל in vivo); ומודלים עכבריים מציעים גם יתרון כפי שהם מספקים הזדמנות לחזות ולתפעל אוכלוסיות תאים מזוהות מבחינה גנטית ומבני subcellular. כאן אנו מתארים כיצד לבודד ותמונת חוט השדרה חי מעכברים כדי ללכוד דינמיקה של פגיעת axonal חריפה.

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time at JoVE.com

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; חוט השדרה מושרה לייזר הפגיעה דגם להערכת מנגנוני axonal הניוון בזמן אמת

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

an-ex-vivo-laser-induced-spinal-cord-injury-model-to-assess

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

10.8K Views.  University of Louisville. We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability. 

Video: An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

בתחום ההדמיה vivo של חוט השדרה בעזרת עכבר דו פוטון מיקרוסקופית

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

הדמיה חיה של אקסונים לאחר רוט הגבי Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Nanosurgery הלייזר של האקסונים Cerebellar<em&gt; בVivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

נוהל השתלה קאמרי בעמוד השדרה לאורך<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של כבל עכבר השדרה

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

ההדמיה Intravital של axonal אינטראקציות עם Microglia והמקרופאגים בפגיעת Crush טור העכבר הגבי

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.

Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.

Photothrombosis-induced איסכמיה מיקוד כדגם של חוט השדרה פגיעה בעכברים

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

Medicine

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Vivo דואו-צבע שיטת הדמיה Dynamics כלי הדם בעקבות פגיעה בחוט השדרה Contusive

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

מודל פציעה דרוזופילה In Vivo ללמוד Neuroregeneration ב ההיקפית ואת מערכת העצבים המרכזית

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its incidence is still considerably high and therefore, influences patient outcome. Microcirculation plays a key role in tissue perfusion and oxygen supply and is often dissociated from macrohemodynamics. Thus, direct evaluation of spinal cord microcirculation is essential for the development of microcirculation-targeted therapies and the evaluation of existing approaches in regard to spinal cord microcirculation. However, most of the methods do not provide real-time assessment of spinal cord microcirculation. The aim of this study is to describe a standardized protocol for real-time spinal cord microcirculatory evaluation using laser-Doppler needle probes directly inserted in the spinal cord. We used a porcine model of ischemia/reperfusion to induce deterioration of the spinal cord microcirculation. In addition, a fluorescent microsphere injection technique was used. Initially, animals were anesthetized and mechanically ventilated. Thereafter, laser-Doppler needle probe insertion was performed, followed by the placement of cerebrospinal fluid drainage. A median sternotomy was performed for exposure of the descending aorta to perform aortic cross-clamping. Ischemia/reperfusion was induced by supra-celiac aortic cross-clamping for a total of 48 min, followed by reperfusion and hemodynamic stabilization. Laser-Doppler Flux was performed in parallel with macrohemodynamic evaluation. In addition, automated cerebrospinal fluid drainage was used to maintain a stable cerebrospinal pressure. After completion of the protocol, animals were sacrificed, and the spinal cord was harvested for histopathological and microsphere analysis. The protocol reveals the feasibility of spinal cord microperfusion measurements using laser-Doppler probes and shows a marked decrease during ischemia as well as recovery after reperfusion. Results showed comparable behavior to fluorescent microsphere evaluation. In conclusion, this new protocol might provide a useful large animal model for future studies using real-time spinal cord microperfusion assessment in ischemia/reperfusion conditions.

Spinal cord microcirculation plays a pivotal role in spinal cord injury. Most methods do not allow real-time assessment of spinal cord microcirculation, which is essential for the development of microcirculation-targeted therapies. Here, we propose a protocol using Laser-Doppler-Flow Needle probes in a large animal model of ischemia/reperfusion.

הערכה בזמן אמת של מיקרופרפוזיה בחוט השדרה במודל חזירי של איסכמיה/רפרפוזיה

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its ...

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes this animal model very useful for studying spinal cord injury and regeneration. The standard protocol for inducing such lesions is to transect the dorsal part of the trunk manually. However, this technique requires extensive training and damages additional tissues. A protocol was developed for laser-induced lesions to circumvent these limitations, allowing for high reproducibility and completeness of spinal cord transection over many animals and between different sessions, even for an untrained operator. Furthermore, tissue damage is mainly limited to the spinal cord itself, reducing confounding effects from injuring different tissues, e.g., skin, muscle, and CNS. Moreover, hemi-lesions of the spinal cord are possible. Improved preservation of tissue integrity after laser injury facilitates further dissections needed for additional analyses, such as electrophysiology. Hence, this method offers precise control of the injury extent that is unachievable manually. This allows for new experimental paradigms in this powerful model in the future.

The present protocol describes a method to induce tissue-specific and highly reproducible injuries in zebrafish larvae using a laser lesion system combined with an automated microfluidic platform for larvae handling.

פציעות חצי אוטומטיות מבוקרות הנגרמות בלייזר לחקר התחדשות חוט השדרה בזחלי דגי זברה

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video