Name: intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury
Uploaded: 2014-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury at JoVE.com

The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick&#8217;s Foundation (A.Y.H.), Alex&#8217;s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle&#8217;s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.

注：すべての動物が飼育し、機関の動物管理使用委員会（IACUC）に従って利用されるべきである。ここで説明するすべての手順は、ケースウエスタンリザーブ大学IACUCによって承認されている。 1.トランスジェニック動物<ol><li>軸索（汝-1 YFP H）50及びミクログリア/単球（;材料のリストを参照してくださいCX3CR1 GFP / GFP 51）を標識するために市販の蛍光レポーターマウスを使用してください。これらのマウスは、交配や制度動物ケアポリシーに従って個々の繁殖コロニーとして維持されるべきである。 </li></ol> 2.骨髄キメラ<ol><li>レシピエント動物として使用するための年齢の少なくとも8週間である動物を同定する。 </li><li>でも、全身照射を確保する立場にマウスを保持するように設計された円形照射保持ケージに宿主動物を置きます。 </li><li>セシウムにタイマーを設定し（CS-137）全身放射線DOSを管理するための照射製造業者の指示に従って動物に800〜ラドの年齢（ここに示す例は980ラドである）。 </li><li> 4時間の最小値のために休むために彼らのケージに動物を返します。 </li><li>適切な遺伝子型のドナー動物を選択する骨髄前駆細胞の供給源として（ 図2A参照 ）。 注記：適切なドナーが異なる細胞集団、またはコントロールと同じ遺伝子型のいずれかを識別するために、ホストから別の系統特異的蛍光レポーターを表現する動物である。 </li><li> 1ペトリ70％アルコールとの皿、および10ミリリットルロズウェルパーク記念研究所（RPMI）メディアおよびメディアに浸し40μmのセルストレーナーを持つ第二の皿を埋める。 RPMI培地で15ミリリットルコニカルチューブを埋める。氷の上で料理やチューブを保管してください。 </li><li>施設のガイドラインに従ってCO 2窒息によりドナー動物を生け贄に捧げる。すべての毛皮が濡れになるまで70％エタノールで全体の動物を浸すことによって、皮膚や毛を清掃してください。 </li><li> SKの削除中央部分の周りにカットすると、完全に脚の筋肉を露出するように後ろ足の上に皮膚をプルダウンすることによって、動物の下半分からで。 </li><li> 、骨を脱臼その後滅菌ピンセットやハサミ、皮を使用し、脛骨の両端から離れて筋肉をカットして膝関節の前方過伸展による脛骨を削除します。メディアを含むペトリ皿の内側セルストレーナーに転送後、最大30秒間アルコールでペトリ皿に骨を置きます。 </li><li>股関節を脱臼し、大腿骨に付着した筋肉をはが​​し、アルコールで簡単に大腿骨を入れ、次いで、皿内部の同じセルストレーナーに入れてください。 </li><li>組織培養フード内で、骨の両端を切断し、骨の端部に1mlシリンジに21ゲージの針を挿入するために、滅菌ハサミを使用。メディアと15ミリリットルコニカルに骨髄をフラッシュします。残りの骨のための手順を繰り返します。 </li><li> 3ミリリットルの注射器からプランジャーのバックを使用して、クラッシュの骨は、セルで終わるより多くの細胞を抽出するためのペトリ皿にストレーナー。 </li><li> 50ミリリットルコニカルチューブの上にフィルターを置き、15ミリリットルコニカルチューブから吸引細胞とメディアを転送。単一細胞懸濁液を得るために、骨髄を粉砕するプランジャの背部を使用する。 50ミリリットルコニカルチューブにメディアの30ミリリットルと15ミリリットルの円錐管、骨片とセルストレーナーを洗ってください。 </li><li>遠心ペレット細胞に500×gで5分間、細胞。 </li><li>アンモニウム、塩化物カリウム2分間（ACK）溶解緩衝液2 mlの溶解赤血球。 10％ウシ胎児血清を含む培地10mlの溶解緩衝液をクエンチする。ペレットに5〜10分間500×gで遠心し。 </li><li>各洗浄のためにペレット化する5〜10分間500×gで遠心分離し、生理食塩水で一度RPMI培地10ml中や細胞を2回洗浄する。 </li><li>生理食塩水200μl中3×10 6細胞の最終濃度になるように細胞を再懸濁する。 </li><li>滅菌済に尾静脈注射を介して転送3×10 6個の骨髄細胞adiatedレシピエントマウス。 </li><li>受信者のケージに酸性化した水（pHは3.0）を配置し、マウスが回復することができます。 注：移植は、処置後10〜14日以内に死亡するが失敗したマウス。 </li><li> 8週間後、フローサイトメトリー（ 図2B-C）を用いて末梢血免疫細胞を調べることにより、骨髄再構成を検証する。 </li></ol> 3.背列圧挫注：目的の実験に基づいて、適切なキメラ動物または手術のための二重トランスジェニック動物を選択してください。どちらラベル居住者または骨髄由来の細胞と動物は、前のステップで作成されました。 <ol><li>準備し、骨鉗子、デュモン＃4鉗子、アイリスはさみ、組織、針ドライバと創傷クリップを保持するための鉗子を含むオートクレーブ手術器具、。 </li><li>疼痛コントロールのためのマウスに投与するために薬を準備します。 Bupernexとマーカイン、一般的に疼痛管理のために使用される。必要に応じて、適切な薬を使用してくださいND施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認。 </li><li> 4％イソフルランで麻酔を誘導し、毎分60〜100回の呼吸呼吸速度を達成するために、1〜2％イソフルランで維持する。麻酔下での乾燥を防ぎ、足のピンチによる応答がないことを確認するために、動物の目に目の潤滑剤を適用します。加熱パッドを使用して温度を維持し、直腸プローブを用いて温度を監視する。 </li><li>目標と脊髄レベル以上の電気シェーバーでマウスの背中を剃る、その後2回70％アルコールに続いてポビドンヨードで面積を3回綿棒。無菌ドレープで動物を置き、手術部位を可視化するために適切な位置で切断穴を持つ別の滅菌ドレープで動物をカバーしています。手術を通して無菌ドレープ上のすべてのツールを維持します。 </li><li>動物の背中に筋肉を露出するようにアイリスハサミで希望の脊髄レベルでの正中線に沿って皮膚をカット。 </li><li>ディスの下で顕微鏡をecting、僧帽筋、彼らは背側脊髄のプロセスにアタッチし、脊柱を公開正中線に沿って広背筋の靭帯を含め、背中の筋肉をカット。 </li><li>特定の椎骨の椎弓板を明らかにするために椎骨の背側及び横突起間の回旋筋を除去すること（この場合、T11）が除去される。このプロセスへの最後の非浮動リブの挿入によりT11を特定します。 </li><li>削除するプロセスの上下にスペースに骨鉗子の先端を挿入し、彼らは、椎弓板の周りに所定の位置にしっかりしていることを確認しかし背骨を傷つけるには余りにも深くないように少し持ち上げます。ラミナを除去するための1回の移動で閉じる骨鉗子。 </li><li>残りの椎骨の小さな部分を除去する骨鉗子を使用して、必要に応じて椎弓切除術を拡大。 </li><li>定規に対してそれらを保持し、永久的なマーカーでマークすることで、＃4鉗子の先端から1ミリメートルを測定します。分離賭けで1ミリメートルを測定します定規に対する鉗子を保持することにより、2つの歯をWEENと鉗子のシャフトを介して、所定の位置にゴム製の鉗子リングをスライドさせて1ミリメートルの先端の最大幅を修正。 </li><li>脊髄にアクセスするために鉗子の歯のための2つの挿入箇所で硬膜を通して30ゲージの針を挿入することにより、小さな穴を作成します。 </li><li>マークは硬膜の上にあることを確認しながら、鉗子の側面にマークさ1ミリメートルの深さに穴を通して硬膜に90°の角度で、鉗子歯を挿入します。鉗子を閉じ、10秒間保持するピンチ。リリース、およびリピート鉗子は、3の合計を保持するためさらに2回を絞る。脊髄から鉗子を外します。 </li><li>損傷部位の上に生理食塩水、所定の位置に吸収性ゼラチン圧縮スポンジの一片を浸す。 </li><li>ランニングステッチを使用して、＃4、合成非吸収性のナイロン縫合糸で椎弓切除と浸したゼラチンスポンジの上に所定の位置に筋肉を縫合。 </li><li> 5ミリメートルの傷のCLIを使用して所定の位置に肌をクリップPS。 </li><li>臀筋に筋肉内切開部位を中心に生理食塩水を皮下の490μlの10μlのマーカイン（1.0ミリグラム/ kg）を注入し、5μlのBupernex（0.1 mg / kgを）。 </li><li>動物は暖かいパッド上で回復し、後肢のあらゆる動きの難しさや麻痺の兆候を監視することができます。完全に麻酔から回復するまで無人または他の動物の存在下で動物を放置しないでください。観測可能な運動障害を表示し、任意の動物を使用しないでください。 注：このクラッシュ病変は脊髄に沿った任意のレベルで実行することができますが、実際には、T10-L4は、呼吸に対するイメージングのためのより少ない技術的な課題を提起し、クランプを使用して体の動きを安定させる。クランプ配置は、胸部レベルで画像に胸郭の周りに変更する必要があります。 </li></ol> 4.生体内イメージング<ol><li>準備し、デュモン＃4鉗子、アイリスはさみ、組織を保持するための鉗子、針Dを含むオートクレーブ手術器具、河川や創傷クリップ。 </li><li>イソフルランで以前のようにマウスを麻酔。 4~5％で麻酔を誘導し、毎分60〜100回の呼吸の呼吸数と足のピンチに応答性の欠如を維持するために必要に応じて1~2％で維持する。加熱されたマウスを維持イメージングない呼吸数を監視し、連続的に、直腸プローブを用いて動物の温度を監視する。 </li><li>ベタジンで創傷クリップの周りの皮膚をきれいにした後、アルコール及び製造業者の指示に従って、創傷クリップを削除します。巻かれたクリップが削除されると、必要に応じてNairさんで髪を削除し、ポビドンヨードおよび70％アルコールで再びサイトをクリーニングします。 </li><li>ハサミで皮膚を再オープンします。筋肉から残りの縫合糸を外し、ピンセットで離れて筋肉を引っ張って、必要に応じてハサミでカットする。 </li><li>解剖顕微鏡下、脊髄つの椎骨レベルラミの上下の椎骨上の横突起の側にはさみで筋肉を切断してクランプするためのポケットを作成するnectomy。 </li><li>これらの椎骨の周囲クランプを取り付けて、締め。脊髄に到達するために顕微鏡の対物レンズのスペースを確保するために、必要に応じて調整します。脊髄は、イメージングプラットフォームに平行であることを確認し、イメージングのための組織の安定性を維持する。呼吸アーチファクトが見られた場合は、撮像視野の動きを最小限にするためにそれに応じてクランプを再調整する。 </li><li>パラフィルムでクランプをカバー。 </li><li>また、可能な髄膜上からできるだけ多く瘢痕組織を除去し、繊細に、できるだけ多くの作品をオフにピッキング、鉗子を用いて脊髄から吸収性ゼラチン圧縮スポンジを削除します。必要に応じてカバーは生理食塩水と新しいスポンジで脊髄を露呈した。 注：すべての出血はスポンジで忠実なことも、必要に応じて焼灼いずれか、周囲の筋肉から発生した場合。しかし、焼灼と脊髄に触れないように注意してください。焼灼時浸したティッシュペーパーまたはゼラチン圧縮スポンジの部分のいずれかと脊髄を覆う。 </li><li> WELを作成最初Vetbondで皮膚および組織をシールし、次によく脊髄ホルダー二クランプおよび動物の側の間を構築するために歯科用アクリルを使用して、液浸流体を保持するためのリットル。アクリルが硬化するまでお待ちください。 </li><li>人工脳脊髄液（aCSFの）とよくを記入し、手術部位周辺での出血のために再度確認してください。 </li><li>任意で、この時点で、撮像中の血管を強調するために尾静脈注射によって静脈内蛍光血管色素を注入。 注：量子ドット、蛍光標識されたレクチンはまたとして有用な血管染料を果たすが、70 kDaの上記蛍光デキストランは、多くの場合、使用されている。 15万WM TRITCデキストラン50μlのは、一般的に静脈内注射する。 </li><li>生理学的に関連する免疫細胞の運動性を得るために、マウスの温度を37℃に維持されなければならない。イメージングのために、顕微鏡下で温度制御された環境にマウスを移動し、正しいanesために動物を監視呼吸数と足のピンチによってthesiaレベル。毎分100回の呼吸 - 60の呼吸速度を目指し、麻酔の深さを決定するために、撮像中に頻繁に動物を監視する。 </li><li>顕微鏡の接眼レンズを通して撮影部位の位置を確認します。 </li><li>動的撮像データを取得する毎に30〜60秒のzスタック画像を撮影するために2光子レーザー走査顕微鏡を調整する。 </li><li>撮像セッションが完了すると、加熱された箱から動物を削除する。 </li><li>脊髄クランプを緩め、クランプからマウスを取り外します。クランプを除去しながらも肌からアクリルを引き出します。 </li><li>マウスを再度画像化する場合には、脊髄の上に生理食塩水に浸したゼラチン圧縮スポンジを置く。手術部位の上の筋肉と皮膚を閉じます。麻酔から回復しつつ無人または他の動物の存在下で動物を放置しないでください。動物は回復後に神経障害の兆候を示している場合は、動物を安楽死されるべきである。それ以外の場合は、安楽死させるCO 2チャンバー内のマウスは、それがIACUCが承認した安楽死プロトコルに従って麻酔から出てくる前に。 </li><li>製造業者の指示に従って、画像解析ソフトを用いた蛍光画像を解析する。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

リアルタイムで病理を次の中にそれらのネイティブ組織区画における異なる細胞型の撮像相互作用が大きな関心を生成しました。 CNSの密なネットワーク内では、隣接する細胞との細胞 - 細胞接触およびシグナル伝達は、正常な機能およびCNSの病理学を理解するために不可欠である。ここでは、脊髄の機械的な病変内の細胞運動の観察のための2光子レーザー走査顕微鏡の使用を記載している。手術および組織調製物の品質に加えて、組織の機械的安定性は、成功したタイムラプス顕微鏡検査、モーションアーチファクト呼吸から脊髄の特に単離するための最も重要である。安定性は、動物の心拍数や呼吸に対応する解剖顕微鏡下で、脊髄の動きを探すことによって評価することができる。安定性は、イメージングを開始する前に、すぐにも手術を実施している間の両方を評価すべきである。アニマの場合lは調整が脊髄クランプの配置と気密になされるべきである、安定していない。骨髄キメラのアプローチと結合され、細胞型特異的な蛍光レポーターマウスモデルは、小膠細胞および軸索対単球細胞の同定を可能にしている。以前の研究では、血由来単球およびませミクログリアは、ここ43記載の方法論を用いて、外傷後の二次軸索損傷の原因であることを明らかにした。デキストラン共役容器色素は、ランドマークを提供し、血管の完全性の侵害を識別するために、両方の血管の同定を可能にする。適切な蛍光レポーターマウスモデルの選択は、所望の細胞型の適切な識別を撮像できるようにすることが重要である。 実施されて研究に適した蛍光マウスモデルの開発も実験の成功に不可欠です。 CX3CR1 + / GFPの2食細胞集団の区別</sup&gt; CNS中の細胞は、従来、困難であった。ここに示されているように、一般的な免疫学的方法、照射キメラは、骨髄由来マクロファージからの放射線耐性、CNS常駐ミクログリアを区別するために利用することができる。照射手順は、血液脳関門を損傷し、細胞の表現型を変化させる可能性があるので、このモデルの使用は慎重に考慮されるべきである。これらの変化の程度は、照射線量ならびに回復期間の長さと異なり、異なる炎症モデルへの影響は十分に研究されていない。 CNS、血液脳関門への照射の効果は、照射中に頭部を遮蔽することにより最小限に抑えることができ、これは、脊髄を直接52に遮蔽されていない場合であっても、照射後の脊髄への細胞浸潤を減少させることが示されている。ここでは、キメラの生成の結果として、定常状態でCNSへの浸潤細胞の数は麻痺とは対照的に重要でないことを観察した病変に入る細胞の小胞体。薬物誘発性キメラ52または並体結合マウスモデル53を含んで考慮すべき他の代替モデル。 ここでは、2光子顕微鏡を用いて画像に容易である脊髄の背側の白質の病変をもたらす、特定の単純かつ再現可能な小さな損傷モデルを提示している。この方法はまた、文献に相補的な固定組織解析16,18,43,48,54と連結された後柱における軸索の枯死の程度をアッセイするための定量化可能な病変を提供する。このモデルでは、動物は最小限の赤字を表示し、損傷後の特別なケアを必要としません。ここで説明背列挫傷及びイメージング技術を利用して、将来の研究は、脊髄損傷の治療の有効性を評価するための強力なスクリーニングツールとすることができる。これらの治療は、小分子阻害剤、薬物、細胞産物、組織移植片および組み合わせ治療を含むことができS。マクロファージ、ミクログリアとニューロンとの間の相互作用はまた、多発性硬化症、腫瘍、髄膜炎および筋萎縮性側索硬化症などの脊髄の他の疾患モデルにおいて役割を果たす可能性があるが、この技術は、これらの疾患の研究に有用であり得る。

中枢神経系（CNS）の疾患または傷害に対する炎症反応が不十分に特に組織内の免疫常駐細胞間の相互作用に関して、理解される。脊髄におけるこれらの細胞の相互作用の研究は、生きている動物に特に重要である。唯一簡単にアクセスCNS白質管は実現可能な実験的なアプローチを改善することに努力を集中するには、この重要な分野を作り、脊髄の背側の列にある。これらの調査に起因アクセスおよび撮像のためCNSの安定化に技術的困難に限られていた。脊髄のライブイメージングは、以前に1-13について説明したが、しかし、いくつかの研究では、最初の傷害の後に数時間を超えた脊髄損傷における細胞運動に取り組んできた。外傷性脊髄損傷は、ニューロン、アストロサイト、線維芽細胞、NG2前駆細胞、およびincludi免疫細胞と、複雑な環境である小膠細胞、好中球、マクロファージ、T細胞、B細胞および樹状細胞14,15 ng の 。マクロファージは、循環から浸潤、病変における食作用を担当する免疫細胞のサブセットである。これらの食細胞の役割は、これらの細胞が損傷組織の両方の損傷や保護の役割を取ることができることを示すレポートで、議論されてきた。これらの役割は表現型の創傷治癒に取って、負傷した動物21,23,24における機能障害を減少させることを、損傷後の二次軸索の枯死が増加し、貪食方法16-22で行動する範囲である。 これまでは、主に健康な組織における形態学に依存してきたミクログリアからマクロファージを区別しようとします。しかし、活性化ミクログリアおよびマクロファージは、同一マーカーの多くの表現とBASを研究することは困難で、これらの細胞の異なる活動の分離を行う、傷害25-29後に区別できない形態を表示するこれらの要因だけでは30日にエド。このアプローチは、インビボでこれらの細胞型を区別はあまり有用であるが、これらの細胞は、33,34、フローサイトメトリーを用いて、CD45の発現差によって分離することができる。単球はマクロファージに分化するように、これらのマーカーの発現の動的変化は、正確な分析35,36を複雑にする可能性が、小膠細胞およびマクロファージにおいてCCR2およびCX3CR1の発現差異を利用することも検討されている。ミクログリアCNSにおける居住者の免疫細胞であり、マクロファージは、骨髄前駆細胞に由来している間に、胎児の発育中に卵黄嚢前駆細胞から生じ、侮辱31,32の後に負傷したCNSを入力してください。これら2つの細胞型を区別するための形態を使用する代わりのアプローチは、CNS常駐を維持しながら、ドナー前駆細胞から由来マクロファージで追跡可能なマーカーを発現するドナー動物から前駆細胞と骨髄を置換することで、レシプロient由来ミクログリア。これらの骨髄キメラモデルは、一般的に多くの他の用途に利用されている37-40。この方法は、それによって特定の用途での使用を制限し、宿主における骨髄前駆細胞を根絶するために使用される照射または細胞毒性薬物によって引き起こされる血液脳関門の完全性の損傷に関連付けられた固有の警告を有する。最近、CNSにおける小膠細胞およびマクロファージの間の機能的な違いは、フローサイトメトリー、遺伝子チップアレイ分析及び将来において非常に有用であることが分かるであろうキメリズム方法24,26,41-44を使用して識別され始めている。これら2つの細胞型を分離することは困難なままであるが、彼らの独自の機能を理解することは、CNS内の両方ミクログリアおよびマクロファージが関与する障害のよりターゲットを絞った治療法につながるのに重要である。 脊髄病変内の細胞の相互作用の記述は、主に細胞培養モデルを含む研究から来ている。これをd生きている動物に一緒に両方の脊髄病変と免疫細胞イメージングに関わる課題へのUE。様々なタイプと重症度の脊髄損傷の現在の齧歯類モデルは挫傷モデル45,46、ピン刺し負傷2、裂傷47、ここで16,18,48で説明脊柱挫滅傷害を含む。髄膜における炎症は、損傷の重症度とともに増加し、シリアルイメージング用の窓や手術の移植のための固有の課題を提起する。これらの課題のいくつかは、食細胞の浸潤など手術部位上線維性組織の生成を含む。後柱圧壊損傷を研究するために、ここで行われているように、これらの問題のいくつかは、より小さな病変を作成し、硬膜とその後の再開放手術を可能にするための傍脊椎筋の間に非免疫原性外科ドレッシングで​​露光脊髄を覆うことによって克服することができる。スピンの画像だけ背部分に能力挫傷モデルは、主に傷害45,49の後に特に初期の時点で、多くの場合、背側の列の中で最も背側部分を温存、中央のコードに損傷を引き起こすので、アルコードはまた、傷害の選択肢を制限します。したがって、我々は、病変内および病変への軸索の位置を簡単に定量化のための細胞運動の観察の両方に便利ですきれいな、繰り返し可能な、矩形状の病変を生み出すシンプルな損傷モデルを記述する。

<table><tbody><tr><td>CX3CR1 GFP mice</td><td>Jackson laboratories</td><td>5582</td><td></td></tr><tr><td>Thy-1 YFP H mice</td><td>Jackson laboratories</td><td>3782</td><td></td></tr><tr><td>Mouse pie cage</td><td>Braintree Scientific</td><td>MPC 2 set</td><td></td></tr><tr><td>60 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Petri dish</td><td>Corning</td><td>430166</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>Falcon 40 &amp;mu;m cell filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>1 x 15 ml and 1 x 50 ml conical tube</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>21 gauge needle</td><td>BD</td><td>305177</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>309628</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>ACK lysis buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-022-CV</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>RPMI media</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>F4/80 antibody</td><td>Ebioscience</td><td>12-4801 PE</td><td>For FACS verification of chimeras</td></tr><tr><td>30 gauge insulin syringe</td><td>BD</td><td>328280</td><td>For tail vein injection</td></tr><tr><td>Spinal Cord Clamps</td><td>Narshinge</td><td>STS-A</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Dental Acrylic powder</td><td>Lang Dental</td><td>REF1320</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Dental Acrylic liquid</td><td>Lang Dental</td><td>REF1404</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Gelfoam gelatin sponges</td><td>Pfizer</td><td>9034201</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>4-0 Ethilon sutures</td><td>Ethilon</td><td>1667G</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Reflex Clips, 7 mm</td><td>Kent Scientific</td><td>INS750344</td><td>For surgery. Sterilize before use</td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-09</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>45/5 Forceps, Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>30 gauge needle</td><td>BD</td><td>305106</td><td>For making access holes in dura</td></tr><tr><td>Forceps Dumont #4 Biology tips</td><td>Dumont</td><td>11242-40</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Needle Drivers</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Michel Wound Clip Forceps</td><td>Kent Scientific</td><td>INS700753</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Wound clip remover</td><td>Fine Science Tools</td><td>12033-00</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>O-rings for Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-00</td><td>For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately</td></tr><tr><td>Cordless Rechargable Animal trimmer</td><td>Wahl</td><td>Series 8900</td><td>for surgery</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution)</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-150-08</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Nair Hair remover lotion</td><td>Church &amp;amp; Dwight Co., Inc.</td><td>NRSL-22329-05</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td>Drugs &amp;ndash; for surgery</td></tr><tr><td>Marcaine</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 0409-1587-50</td><td>Drugs &amp;ndash; for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously</td></tr><tr><td>Bupernex</td><td>Henry Schein</td><td>121-7793</td><td>Drugs &amp;ndash; for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg</td></tr><tr><td>aCSF</td><td>Chemicals from Sigma</td><td>119 mM NaCl&lt;br /&gt;26.2 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;br /&gt;2.5 mM KCl&lt;br /&gt;1 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br /&gt;1.3 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br /&gt;10 mM glucose</td><td>For surgery&lt;br /&gt;From Cold Spring Harbor Protocols</td></tr><tr><td>TRITC-dextran 150,000 MW</td><td>Sigma</td><td>T1287</td><td>For intravenous administration to label vasculature</td></tr></tbody></table>

intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

後柱圧壊病変を示す模式図を図1Aに示されている。病変した後、動物は、脊髄クランプ（ 図1B）を使用して、生体内顕微鏡検査のために調製し、安定化される。後柱圧壊損傷直後に撮影した画像は明らかに識別可能な鉗子タイン挿入ポイントとはっきりと見える長方形の病変を示しています。損傷部位での軸索は全体の脊柱（ 図1C）のスパン間で切断されている。血管の完全性が無傷のままであり、容器の色素漏出の証拠は、蛍光によって検出されなかった。週間にわたって同じ病変の連続撮影を行うためには、筋肉と皮膚をその後の再暴露の椎弓切除を介して縫合することができる。同様の病変の形態は、後の時点（ 図1D、E）で見られる。 5日損傷後、鉗子挿入部位は、まだ表示されますが、病変がサイズdに増加し始めている炎症によって引き起こされる二次的損傷のUE。病変の尾末尾の軸索は「軸索の枯死」と呼ばれるプロセスを経由して傷害の初期のサイトから後退している。病変の吻側端の軸索はウォーラーのような変性（ 図1D、E）を示した。 5日目および損傷後22との間に、病変の大きさが安定している。 図1に示すように、これらの細胞（マクロファージに対するミクログリア）の同一性は、製剤中に区別することはできないが、同時に、CX3CR1 +細胞の大流入、およびこれらの時点の間に圧壊病変周囲に浸潤することが分かる。 クラッシュ病変の微小環境内ミクログリアおよびマクロファージの挙動を区別するために、放射線キメラモデル（ 図2Aに概説）を用いた。まず、CX3CR1 + / GFPマウスの骨髄前駆細胞は非蛍光ドナーセルに置き換えられLS、こうしてのみGFP + CNS常駐ミクログリアは、蛍光イメージングによって表示されます。骨髄再構成の効率は、8週間の骨髄移植（ 図2B、C）後の末梢血のフローサイトメトリー試験により確認することができる。 図2B、F4 / 80およびGFP陽性マクロファージでは、青で強調表示、その中でいくつかのGFP陰性であるが、F4 / 80陽性単球も存在する、CX3CR1 + / GFP→C57BL / 6キメラマウスで検出されている。 図2Cは 、無重陽性F4 / 80及びGFP陽性細胞は、野生型骨髄を有するCX3CR1 + / GFPレシピエントの骨髄の交換後に残される。怪我する前に、ミクログリアは均等に休息、分枝形態（ 図2D）を表示する、脊髄内に分布している。 8日後、損傷後、わずかミクログリアは、病変内および周囲に検出することができる。これらのミクログリアはアメーバ状の形態（ 図2E）を表示。第二に、骨非蛍光性マウスにおける骨髄前駆細胞は、従って、GFP蛍光（ 図2A）によって可視骨髄由来CX3CR1 +単球/マクロファージのレンダリング、CX3CR1 + / GFPマウスからの骨髄細胞によって置換される。怪我する前に、検出された唯一のGFP +細胞は骨髄が誘導されると報告され、継続的に定期的に28（ 図2F）に裏返しされている、主に血管周囲のです。圧潰損傷後、CX3CR1 + / GFP細胞が病変（ 図2H-J）を囲む血管の内側に沿って見ることができ、病変中心はCX3CR1 + / GFPマクロファージ （ 図2G）の浸潤が充填されている。 後柱のタイムラプスイメージングは​​、最大6時間行うことができる。 図3に、我々はすぐに、循環からの細胞を見ることが可能な損傷後の非キメラCX3CR1 + / GFPマウスを示すn個の病変コアに向けて血管の外に移動すると、損傷部位（ 図3A、B;補足作品1）内で移動する。マクロファージ（; 補足映画1、図3A、B）で撮影した経路を追跡することができる細胞を同定するために蛍光強度を利用した画像解析。画像解析から得られた統計は、病変におけるマクロファージの平均運動性は3.6ミクロン/分（ 図3D）であることを示している。けが、軸索、ミクログリアおよびマクロファージの後、22日がまだイメージングの領域を実証し、病変内で検出することが可能で最後に、時間（ 補足動画2）長期間にわたって安定している。 <img alt="図1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" width="600" /> 図1：作成と背側の列挫滅損傷の連続イメージング。 （A）背カラム挫傷、関心のレベルで脊椎の背側プロセスを除去することによって行われる。鉗子を1mm離れた脊髄の脊柱に挿入された後に紫色に示す病変を生成するために3回を閉じている。（B）次いで、動物を脊髄に位置している生体内イメージングのための安定性を得るためにクランプする。（C）直ちに損傷後、鉗子挿入部位（赤楕円形）と長方形挫滅傷害ボリューム（グレーのボックス）が明確に識別することができます。背側根の軸索は（白矢印）、ならびに病変（黒矢印の頭）の尾側の軸索負傷端を見ることができる。（D）5日損傷後、鉗子挿入部位（赤い円）、病変（グレーのボックス）の程度は、依然として容易に可視化することができる。病変は最初の傷害以来、サイズが増加している。ウォーラーのような変性を受けた軸索は、additiの病変（オープン矢頭）へ吻側見ることができます後根（白矢印）と負傷した軸索の先端（白矢印）。（E）22日損傷後における軸索の上、病変部位は、まだ5日後に傷害に同様の寸法と識別可能である。損傷部位とその周辺のCX3CR1 +細胞を大量に注意してください。標識された特徴は、（D）と同じである。 =200μmのすべてのスケールバー。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> 図2：キメラマウスの構築後柱圧壊病変におけるCNS常駐ミクログリアまたは骨髄由来マクロファージに発現CX3CR1 + / GFPを追跡する。 （A）CX3CR1 + / GFPのいずれかがマイルを発現するキメラマウスの生成の模式図crogliaまたはマクロファージ。まず、のThy-1 YFP Hマウスが照射され、骨髄マクロファージがGFP +であるキメラマウスに生じる、CX3CR1 + / GFPマウスから単離した骨髄細胞で再構成されている。第二に、Thyの-1 YFP H / CX3CR1 + / GFPマウスが照射されると、骨髄が、そのミクログリアGFP +であるキメラマウスを産生する、非蛍光性のマウスから単離した骨髄細胞で再構成されている。（B）フローサイトメトリーデータの例照射されたC57BL / 6レシピエントに移植CX3CR1 + / GFP骨髄ドナーとのキメラ動物から血液中のF4 / 80 +とCX3CR1 GFP +細胞と。 C57BL6とキメラ動物におけるF4 / 80 +とCX3CR1 GFP +細胞を用いたフローサイトメトリーデータの青いエリアをハイライト表示の両方でGFPおよびF4 / 80陽性であるCX3CR1陽性ドナー由来の細胞を示している。（C）例ドナー骨髄は、IRに移植するCX3CR1 + / GFP受信者を放射。二重陽性CX3CR1 + / GFPの欠如に注意して、青色の内のF4 / 80細胞は地域性を強調した。（D）最初のキメラスキームからのマウスの生体2光子顕微鏡的スナップショット、背側内枝状形態を有するGFP +ミクログリアを示すコラム（矢じり）。これらの細胞は、後根と背側の列の軸索（黄色）の間に散在している。スケールバー=100μmである。（E）で同じマウスの生体内イメージング（B）8日後柱損傷はプロセス（矢頭）を欠いている大規模でアメーバ状の細胞体を持つ少数のCX3CR1 +ミクログリアを明らかにした後。 = 100ミクロンスケールバー。（A）における第二のキメラのスキームからのマウスの（F）スナップショット、CNS実質内、わずかなGFP +マクロファージを示した。脊柱損傷はアルを明らかに=100μmのスケールバー。（G）（F）で同じマウスの生体内イメージング8日後病変とその周辺のマクロファージのARGE流入。スケールバー=100μmである。（H）無傷の動物における血管に接触したCX3CR1 +血液由来細胞の高倍率写真。スケールバー=30μmである。血管の内側から見た容器と接触するCX3CR1細胞（I）A再建。スケールバー= 30ミクロン。（J）容器と接触するCX3CR1細胞の再構築、血管の外側から見た。スケールバー=20μmの。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> 図3 :.すぐに後柱圧壊後の非キメラCX3CR1 + / GFPマウスにおける代表的な細胞追跡データけが。 （A）はすぐに後柱圧壊損傷後CX3CR1 +ミクログリアと補足作品1からのマクロファージの周りに損傷を受けた軸索（黄色）のスナップショット。（B）（グレー）のパス（A）にCX3CR1 +細胞が撮影した110の間に分生体内イメージングセッション（C）（B）内のトラックの時間符号化表現。タイムバーに示すようにトラックは、全体の110分の映画以内にその時間に基づいて着色されている。CX3CR1 +細胞の全体的な運動性の（D）ヒストグラム。すべてのスケールバーは30μmである。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52228/52228fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 補足ムービー1：すぐにダブルヘテロ接合体における脊柱挫滅損傷後の代表生体映画のThy-1 YFP / + <st栄&gt; / CX3CR1 GFP / +マウス。生体内脊椎イメージングはT11レベルでの脊柱挫滅損傷後すぐに実施された。右側のパネルには、CX3CR1 +ミクログリアおよびマクロファージの動きを示している。細胞運動の経路は、左パネルの白いトラックとして示されている。損傷は、左上隅に位置しています。 CX3CR1 +細胞は、これらのトラックに沿って損傷部位に移動することが分かる。軸索は黄色で示されている。 =40μmのスケールバー。合計時間：110分。再生速度：300X。 補足ムービー2：ダブルヘテロ接合体のThy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / +マウスにおける背側の列圧壊病変後の22日目での代表生体映画ここに示されているが、22日、最初の後柱圧壊後にマウスで撮影代表映画です脊髄レベルのT11で損傷。 INJユリィは、フレームの右上にあります。軸索（黄色）上昇が吻側右下に表示されます。背静脈血管がTRITCデキストラン（赤）で標識される。すぐに損傷後のものと比較して低速で病変の移動中に、CX3CR1 +細胞。 =50μmのスケールバー。合計時間：90分。再生速度：600X。

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Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

マウス背側列のクラッシュ損傷におけるミクログリアおよびマクロファージと軸索の相互作用の生体内イメージング

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

intravital-imaging-axonal-interactions-with-microglia-macrophages

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K ビュー.  Case Western Reserve University. Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury. 

ビデオ: Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

神経科学

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

根切断術後の後根の軸索のライブイメージング

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as multiple sclerosis. Here we present a low-cost and reproducible glass window implantation protocol that is suitable for intravital microscopy and studying the dynamics of spinal cord cytoarchitecture with subcellular resolution in live adult mice with EAE. Briefly, we surgically expose the vertebrae T12-L2 and construct a chamber around the exposed vertebrae using a combination of cyanoacrylate and dental cement. A laminectomy is performed from T13 to L1, and a thin layer of transparent silicone elastomer is applied to the dorsal surface of the exposed spinal cord. A modified glass cover slip is implanted over the exposed spinal cord taking care that the glass does not directly contact the spinal cord. To reduce the infiltration of inflammatory cells between the window and spinal cord, anti-inflammatory treatment is administered every 2 days (as recommended by ethics committee) for the first 10 days after implantation. EAE is induced only 2-3 weeks after the cessation of anti-inflammatory treatment.
Using this approach we successfully induced EAE in 87% of animals with implanted windows and, using Thy1-CFP-23 mice (blue axons in dorsal spinal cord), quantified axonal loss throughout EAE progression. Taken together, this protocol may be useful for studying the recruitment of various cell populations as well as their interaction dynamics, with subcellular resolution and for extended periods of time. This intravital imaging modality represents a valuable tool for developing therapeutic strategies to treat autoimmune demyelinating diseases such as EAE.

We describe a method for implanting and maintaining glass windows over the exposed spinal cords of adult mice for studying experimental autoimmune encephalomyelitis. These windows provide chronic optical access to the spinal cord for monitoring cell dynamics at the subcellular level in live animals using two-photon microscopy.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

医学

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

縦二光子イメージングに続いてマウスの急性脳外傷

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

アン<em&gt;エクスビボ</em&gt;レーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

縦断のために脊髄商工を移植するための手順<em&gt;インビボ</emマウス脊髄の&gt;イメージング

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

In Vivoデュオ カラー霊長類脊髄損傷血管動態のイメージング手法

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

免疫・感染学

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell types of an animal's brain, upon exposure to exogenous stimuli. Here, the administration of a closed-skull traumatic brain injury (TBI) and simultaneous implantation of a cranial window for subsequent longitudinal intravital imaging in mice is shown. Mice are intracranially injected with an adeno-associated virus (AAV) expressing enhanced green fluorescent protein (EGFP) under a neuronal specific promoter. After 2 to 4 weeks, the mice are subjected to a repetitive TBI using a weight drop device over the AAV injection location. Within the same surgical session, the mice are implanted with a metal headpost and then a glass cranial window over the TBI impacting site. The expression and cellular localization of EGFP is examined using a two-photon microscope in the same brain region exposed to trauma over the course of months.

This study demonstrates delivery of a repetitive traumatic brain injury to mice and simultaneous implantation of a cranial window for subsequent intravital imaging of a neuron-expressed EGFP using two-photon microscopy.

2光子顕微鏡を用いた閉鎖頭蓋外傷性脳損傷マウスおよび頭蓋窓における蛍光タンパク質発現の生体内イメージング

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

マウス背側列のクラッシュ損傷におけるミクログリアおよびマクロファージと軸索の相互作用の生体内イメージング

要約

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この動画の章

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

根切断術後の後根の軸索のライブイメージング

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

縦二光子イメージングに続いてマウスの急性脳外傷

アン

縦断のために脊髄商工を移植するための手順

In Vivoデュオカラー霊長類脊髄損傷血管動態のイメージング手法

マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

2光子顕微鏡を用いた閉鎖頭蓋外傷性脳損傷マウスおよび頭蓋窓における蛍光タンパク質発現の生体内イメージング

マウス背側列のクラッシュ損傷におけるミクログリアおよびマクロファージと軸索の相互作用の生体内イメージング

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二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

根切断術後の後根の軸索のライブイメージング

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

縦二光子イメージングに続いてマウスの急性脳外傷

アン

縦断のために脊髄商工を移植するための手順

In Vivoデュオ カラー霊長類脊髄損傷血管動態のイメージング手法

マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

2光子顕微鏡を用いた閉鎖頭蓋外傷性脳損傷マウスおよび頭蓋窓における蛍光タンパク質発現の生体内イメージング

In Vivoデュオカラー霊長類脊髄損傷血管動態のイメージング手法