הכנת ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך חוצץ המכיל PBS עם ארגון ה-BSA (0.5%), ו - 2 mM EDTA. בגלל בועות אוויר יכול לחסום MACS עמודות הפרדה, המאגר צריך להיות degassed ומאוחסנים ב 2-8 מעלות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים RPMI 1640 בינוני המכילה סרום עכבר 5%. בינוני תרבות לא יכילו BSA או FCS, כמו תרכובות אלו תשנה את הספציפיות של גירוי התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IL-17 עכבר Assay הפרשת - העשרה תא ערכת זיהוי מ-Miltenyi BIOTEC. הערכה מכילה את הרכיבים הבאים: IL-17 מגיב תפוס, IL-17 נוגדן איתור (ביוטין), Anti-ביוטין-PE, ו Anti-PE microbeads. </li></ol> גירוי Splenocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה מתבצע בנוכחות של פקד שליליות וחיוביות, כגון splenocytes unstimulated ו counterstain עבור ותאי T. פרוטוקול זה מבוצעת באמצעות טכניקה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ההשעיה תא בודד של העכבר splenocytes שהיו מבודדים באמצעות Dissociator ™ gentleMACS. ריכוז של תאים צריך להיות קבוע מראש באמצעות ספירת התאים. גלולה התאים ב × 200 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, לשאוב supernatant את גלולה באמצעות פיפטה. אין למזוג את הצינור כדי למנוע אובדן של גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו, resuspend התאים במדיום תרבות ולאחר מכן להוסיף את באר. הוסף בינוני מספיק ריכוז של 10,000,000 תאים לכל מ&quot;ל ו - 5,000,000 תאים לס&quot;מ מרובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעורר תגובה חיסונית בתאי resuspended שלנו, אנו להוסיף ionomycin (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו PMA (10 ng / mL) המדגם ומערבבים את הפתרון על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. ואז בארות מסומנים בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו, אנו דגירה התאים שלנו במשך 3 שעות ב 37 ° C, ללא ערבוב כדי להתחיל את תקופת גירוי. המשך IL-17 3 שעות מתחילת הניתוח של גירוי, ולכן התוכנית בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצור את הפרשה, התאים ממוקמים על קרח אנו אוספים את התאים מגורה על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה עם חיץ קר. תאים מועברים לאחר מכן מהבאר אל צינור ו נשטפים בפעם השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להבטיח כי כל התאים נאספים, זה רעיון טוב כדי לבדוק המנה שלך תחת מיקרוסקופ. אם התאים עדיין להישאר מחובר, אתה יכול לאסוף את התאים הנותרים על ידי שטיפת צלחת עם חיץ קר. גושים כל תא ההשעיה הסלולרי שלך ניתן להסיר באמצעות טרום הפרדה מסננים. </li></ol> סימון תאים עם מגיב תפוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה הוא בעל חשיבות עליונה לציין, כי assay זה עובד באופן אופטימלי אם פחות מ 2% של IL-17-מפריש תאים קיימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ריכוז של IL-17 תאים להפריש צפוי להיות יותר מ 2% להתאים כמויות בהתאם. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="דמות 8" width="500" height="162" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשול אפשרי אחד של הליך זה הוא זיהום לחצות של מגיב תפוס, אשר יכול להתרחש במהלך תיוג כאשר נוגדן ספציפי דו נקשר לתא להפריש ללא טי ומלכודות IL-17 מופרש מן לימפוציטים שכנה, ובכך לייצר תוצאות חיוביות שגויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקוף בעיה זו, חשוב לתאי להתקרר לפני תיוג לעבוד עם חיץ קר להאט דיפוזיה של IL-17 ו להימנע זיהום לחצות. בנוסף לשמירה על התאים קר, הם חייבים להיות כל הזמן בריכוז מוגדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את ההליך תיוג, אנו משתמשים 10,000,000 תאים צינור closable 15 מ&quot;ל. אם המספרים גבוהים יותר התא צריך להיות בשימוש, פשוט בקנה מידה את כל הכרכים בהתאם. לאחר ריכוז אופטימלי תא התקבל, לשטוף את התאים על ידי הוספת 10 מ&quot;ל של חיץ קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התאים ב 300 × גרם במשך 10 דקות בצנטריפוגה בקירור (2-8 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, לשאוב supernatant לחלוטין בעזרת פיפטה. אין למזוג supernatant כמו זה יוביל לאובדן התא כרכים מדויק. חזור על השלב כביסה אשר מורכב הוספת 10 מ&quot;ל של חיץ צנטריפוגה קור, והשאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו יש לנו גלולה של טוהר הרצוי, resuspend התאים μL 80 של המדיום תרבות קר. לתייג אותם, נוכל כעת להוסיף 20 μL של מגיב עכבר IL-17 תפוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים למשך 5 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת דגירה 5 דקות על הקרח, להסיר את הצינור לדלל את התאים 10 מ&quot;ל של מדיום 37 מעלות צלזיוס חם. ואז לאבטח את הצינור על Rotator Tube MACSmix ו דגירה צינור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות תחת תנועה רציפה. הגדלת הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס יהיה להתחיל מחדש הפרשת ציטוקינים. </li></ol> סימון תאים עם נוגדן IL-17 Detection (ביוטין) ו Anti-ביוטין-PE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הפרשת 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, במקום צינור מיד על הקרח. זה יעצור הפרשת ציטוקינים. מכאן ואילך זה קריטי לשמור על התאים על הקרח.עבודה עם חוצץ קר ימנע זיהום לחצות של מגיב תפוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הצינור עם חיץ צנטריפוגות קר בבית 300xg ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לשאוב supernatant לחלוטין. חזור על לשטוף את השלב עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התא resuspended ב 80 μL של חיץ קר הצינור ממוקם על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע מחייב נוקבים של הנוגדן, אנו ממליצים על תוספת של מגיב FCR 10μl חסימת לדגור על קרח דק &#39;5. אז נוסיף 20 μL של נוגדן עכבר IL-17 Detection (ביוטין) כי הוא מצומדות כדי ביוטין ו דגירה במשך 10 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב, לשטוף תאים כפי שעשינו לפני כן על ידי הוספת 10 מ&quot;ל של חיץ צנטריפוגות קר בבית 300xg ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב μl 80 של המאגר הקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μL של נוגדנים משני שלנו, Anti-ביוטין-PE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התאים פתרון נוגדנים משנית, ושוב דגירה הצינור במשך 10 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע זה הדגירה השני הוא מלא, לשטוף את התאים עם חיץ 10 מ&quot;ל ו - קר צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה כעת ניתן resuspended ב μL 500 של המאגר הקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התאים יש להפריד לניתוח נוסף במורד הזרם, הם יכולים להיות מתויג מגנטית עם Anti-PE-microbeads ומופרד באופן ידני או אוטומטי באמצעות MACS עמודות מפרידים MACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלמנו עתה את התוויות של splenocytes והם מוכנים לניתוח. </li></ol> FACS ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח שלנו, נוכל להשוות את splenocytes מגורה unstimulated ידי cytometry הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ניתוח תזרים cytometric, התאים הם מוכתמים יודיד propidium על 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​לשער את התאים המתים. Analyzer ™ MACSQuant היתה עמוסה 200,000 תאים עבור כל דגימה ואנחנו עכשיו הולכים להסתכל על מגרשים פיזור של תגובתיות נוגדן יחסית הדגימות. שני השיקולים החשובים לניתוח של תאים נדירים - כמו IL-17 תאים חיובית - ידי זרימת cytometry הם: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת השער על הלימפוציטים פיזור קדימה לעומת פיזור העלילה בצד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ו gating את התאים המתים (מוכתמים propidium יודיד) ו-B-תאים (אשר עלול לגרום מכתים רקע נוקבים) כדי לשפר עוד יותר את הרגישות של זיהוי </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשנו CD4-APC נוגדנים ותאי T לזהות את הנוגדן CD45R/B220-PerCP לזהות את התאים B. אנו רואים את המאפיינים פיזור קדימה בצד של הדגימות ולהחיל השער על אוכלוסיית הלימפוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השער השני היה ליישם כדי לראות את התאים המתים מוכתם ותאי B מוכתם (ציר Y). תאים אלה אינם נכללים בניתוח תא T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוגמה זו, אשר היא למעשה שליטה שלילית שלנו, אנו יכולים לראות כי יש מעט מאוד IL-17 CD4 מפריש תאים חיובית T בדגימות unstimulated כ - 0.003% (איור 4). כאשר מסתכלים על האוכלוסייה מגורה תא T, אנו יכולים לראות מספר לא מבוטל של CD4 חיובי תאי T להפריש IL-17 - על 0.367% (איור 5A) לפני ההפרדה 60.76% לאחר הפרדה מגנטי עם MACS וטכנולוגיה (איור 5 ב). </li></ol>

כל הפרוטוקולים וגליונות נתונים זמינים www.miltenyibiotec.com. אזהרות ריאגנטים מכילים נתרן אזיד. בתנאים חומציים אזיד הנתרן התשואות חומצה hydrazoic, שהוא רעיל ביותר. תרכובות אזיד צריך להיות מדולל במים זורמים לפני השלכת. אמצעי זהירות אלה מומלץ להימנע פיקדונות אינסטלציה שבו התנאים נפץ עלול להתפתח.

תאים TH17 לשחק תפקיד אינטגרלי חסינות אדפטיבית את התגובה הדלקתית הם מרכיב מרכזי נהיגה דלקת אוטואימונית. זה וידאו ומסמכים כיצד להשתמש בעכבר של Miltenyi IL-17 Assay הפרשת - העשרה תא ערכת זיהוי (PE). כשעושים הליך זה חשוב יש הערכת התדירות של IL-17-מפריש תאים לקראת ההתחלה שלך התא. ריכוז התא המתאים במהלך תיוג ועל הפרשת ציטוקינים תקופה מונע זיהום צולבות על ידי תאים אחרים השעיה שלך מבטיחה תוצאות אמינות.

<table><tbody><tr><td>Mouse IL-17 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit (PE) </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Propidium Iodide Solution</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>FcR Blocking reagent, mouse </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dead Cell Removal Kit </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; Dissociator</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Starting Kit</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS Columns</td><td>Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS Separator</td><td>Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection and isolation of viable mouse il-17-secreting t cells

המקים הפרשת ציטוקינים Assay הטכנולוגיה מאפשרת זיהוי של ציטוקינים המופרשים על רמת תא בודד ובידוד רגיש של ציטוקינים, מפריש תאים קיימא. כדי תווית IL-17-מפריש תאים, ההשעיה של תא בודד splenocytes העכבר מוכן ועורר על 37 מעלות צלזיוס עם PMA / ionomycin לעורר הפרשת ציטוקינים. כדי לעצור את הפרשת התאים ממוקמים אז על קרח נחשפים מגיב IL-17 מלכוד נוגדן ספציפי דו הנקשרת CD45 על פני התא של לויקוציטים וכן IL-17 כפי שהוא מופרש ותפס ליד פני התא. הפרשת הוא מחדש אשר נכתבו על ידי הגדלת הטמפרטורה ל 37 ° C ו-IL-17 הוא לכוד על ידי מגיב תפוס. הפרשה היא נעצרה שוב, על ידי הצבת תאים על הקרח. כדי לזהות את IL-17 לכודים, תאים מודגרת עם IL-17-נוגדן ספציפי שנייה מצומדות כדי ביוטין ו נוגדן Anti-ביוטין-PE. תאים כעת ניתן לנתח באופן ישיר על ידי cytometry זרימה או מוכן בידוד והעשרה על ידי תיוג הבאים עם Anti-PE microbeads מצומדות.

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells at JoVE.com

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

הליך זה מתאר את זיהוי ובידוד של לויקוציטים עכבר TH17 כי להפריש באופן פעיל IL-17 על גירוי.

זיהוי ובידוד של Viable IL-17-מפריש תאים עכבר T

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

<a class="grey_button" href="/video/1044">
ChineseVersion
</a>


<a class="grey_button" href="/video/1233">
JapaneseVersion
</a>

detection-and-isolation-of-viable-mouse-il-17-secreting-t-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Views.  Miltenyi Biotec,GmbH.  ChineseVersion JapaneseVersion 

Video: Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Immunology and Infection

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

פנוטיפי אנליזה פונקציונלית של תאים תקינה T הופעל מבודדת מן עכברים הנגועים בנגיף לימפוציטית כרונית Choriomeningitis

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various pathological processes, including anti-helminth immunity, tissue repair, thermogenesis, and autoimmune diseases such as asthma and allergic rhinitis (AR). ILC2s permanently reside in peripheral tissues such as the skin, gut, lungs, and nasal cavity; however, there is limited information about their exact functions in nasal mucosal immunity. CD226 is an activating costimulatory molecule, mainly expressed on natural killer (NK) cells, T cells, and inflammatory monocytes. However, whether ILC2s express CD226 or play a role in the pathogenesis of ILC2s-related diseases remains unknown. Here, we established a method to isolate and identify ILC2s from the nasal mucosa and detected CD226 expression on ILC2s obtained from healthy and AR mice. Herein, we describe this protocol for the isolation and identification of ILC2s from mouse nasal mucosa, which will help explore the internal pathological mechanism of immunological disorders in nasal mucosal diseases.

Group 2 innate lymphoid cells (ILC2s), implicated in type 2 inflammation, mainly participate in response to helminth infection, allergic diseases, metabolic homeostasis, and tissue repair. In this study, a procedure to isolate ILC2s from murine nasal mucosa and detect the expression of CD226 is demonstrated.

בידוד תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 מרירית האף של העכבר כדי לזהות את הביטוי של CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

פענוח התחייבות מוקדמת של תאי T מסייעים לזקיקים בזיהום LCMV חריף

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, thus establishing long-term humoral immunity. During acute viral infection, the fate commitment of virus-specific TFH cells is determined in the early infection phase, and investigations of the early-differentiated TFH cells are crucial in understanding T cell-dependent humoral immunity and optimizing vaccine design. In the study, using a mouse model of acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection and the TCR-transgenic SMARTA (SM) mouse with CD4+ T cells specifically recognizing LCMV glycoprotein epitope I-AbGP66-77, we described procedures to access the early fate commitment of virus-specific TFH cells based on flow cytometry stainings. Furthermore, by exploiting retroviral transduction of SM CD4+ T cells, methods to manipulate gene expression in early-differentiated virus-specific TFH cells are also provided. Hence, these methods will help in studies exploring the mechanism(s) underlying the early commitment of virus-specific TFH cells.

מחבר זרקור: הבהרת המסלולים של התמיינות תאי TFH באתגרי LCMV חריפים

The current study showcases protocols for assessing the early fate commitment of virus-specific TFH cells and manipulating gene expression in these cells.

גישה להבחנה מוקדמת של תאי T CD4+ עוזר זקיקים ספציפי לווירוס בעכברים נגועים ב- LCMV חריף

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...

זיהוי ובידוד של Viable IL-17-מפריש תאים עכבר T

Transcript

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

העכבר נאיבי CD4

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

פנוטיפי אנליזה פונקציונלית של תאים תקינה T הופעל מבודדת מן עכברים הנגועים בנגיף לימפוציטית כרונית Choriomeningitis

ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter

בידוד תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 מרירית האף של העכבר כדי לזהות את הביטוי של CD226

גישה להבחנה מוקדמת של תאי T CD4⁺ עוזר זקיקים ספציפי לווירוס בעכברים נגועים ב- LCMV חריף

גישה להבחנה מוקדמת של תאי T CD4⁺ עוזר זקיקים ספציפי לווירוס בעכברים נגועים ב- LCMV חריף

גישה להבחנה מוקדמת של תאי T CD4⁺ עוזר זקיקים ספציפי לווירוס בעכברים נגועים ב- LCMV חריף