Preparación de los reactivos <ol><li> Hacer un tampón que contiene PBS con BSA (0,5%), y 2 mM EDTA. Debido a que las burbujas de aire pueden bloquear columnas MACS separación, el buffer debe ser desgasificado y almacenado a 2-8 ° C antes de su uso. </li><li> Usamos medio RPMI 1640 que contenía 5% de suero de ratón. El medio de cultivo no debe contener BSA o FCS, ya que estos compuestos alteran la especificidad de la estimulación de las células. </li><li> La IL-17 de ratón Ensayo secreción - Enriquecimiento de células y kit de detección de Miltenyi Biotec-. El kit contiene los siguientes componentes: la IL-17 Reactivo de captura, la IL-17 de detección de anticuerpos (Biotina), el anti-biotina-PE, y el MicroBeads Anti-PE. </li></ol> Estimular los esplenocitos <ol><li> Este protocolo se realiza en presencia de un control positivo y negativo, como esplenocitos estimulados y de contraste de las células T. Este protocolo se lleva a cabo mediante una técnica estéril. </li><li> Prepare una suspensión de células individuales de esplenocitos de ratón que fueron aislados usando el disociador gentleMACS ™. La concentración de células debe ser determinado a través de recuento de células. Que sedimenten las células a 200 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Después de la centrifugación, se aspira el sobrenadante de la bolita con una pipeta. No se decanta el tubo para evitar la pérdida de la pastilla. </li><li> Ahora, volver a suspender las células en el medio de cultivo y luego agregar a un pozo. Añadir medio suficiente para una concentración de diez millones de células por ml y cinco millones de células por centímetro cuadrado. </li><li> Para estimular una respuesta inmunológica en las células resuspendidas, añadimos ionomicina (1 mg / ml) y PMA (10 ng / mL) a la muestra y mezclar la solución pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. A continuación, los pozos están etiquetados en consecuencia. </li><li> Ahora, vamos a incubar las células durante 3 horas a 37 ° C sin que se mezclen para iniciar el período de estimulación. Proceder a la IL-17 análisis de 3 horas desde el inicio de la estimulación, por lo que planificar en consecuencia. </li><li> Para detener la secreción de las células se colocan sobre hielo y recoger las células estimuladas con cuidado pipeteando arriba y abajo con tampón frío. Las células se transfieren desde el pozo a un tubo y se lavan por segunda vez. </li><li> Para asegurarse de que todas las células se recogen, es una buena idea revisar su plato con un microscopio. Si las células siguen unidos, usted puede recoger las células que quedan por aclarar el plato con un tampón frío. Cualquier grupo de células en suspensión de células se pueden eliminar utilizando los filtros de pre-separación. </li></ol> Etiquetado de las células con el reactivo de captura <ol><li> Es de suma importancia señalar, que esta prueba funciona de manera óptima si menos del 2% de células IL-17-secretoras están presentes. </li><li> Si la concentración de las células secretoras de IL-17 se espera que sea superior al 2% ajustar el volumen en consecuencia. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="la figura 8" width="500" height="162" /></li><li> Un riesgo potencial de este procedimiento es la contaminación cruzada de los reactivos de captura, lo que puede ocurrir durante el etiquetado cuando el anticuerpo bi-específicos se une a una célula T no secretor y las trampas de la IL-17 secretada por un linfocito vecinos, generando así los falsos positivos. </li><li> Con el fin de evitar este problema, es fundamental que las células se enfríe antes de que el etiquetado y el trabajo con tampón frío para disminuir la difusión de la IL-17 y evitar esta contaminación cruzada. Además de mantener las células en frío, que deben mantenerse a una concentración definida. </li><li> Para comenzar el procedimiento de etiquetado, utilizamos diez millones de células en un tubo de 15 ml con cierre. Si es mayor el número de células tienen que ser utilizados, simplemente escala de todos los volúmenes en consecuencia. Una vez que la concentración óptima de la célula se ha obtenido, se lavan las células mediante la adición de 10 ml de solución tampón frío. </li><li> Centrifugar las células a 300 g durante 10 minutos en una centrífuga refrigerada (2-8 ° C). </li><li> Tras la centrifugación, aspirar el sobrenadante por completo con una pipeta. No se decanta el sobrenadante, ya que dará lugar a la pérdida de células y de los volúmenes imprecisos. Repita el paso de lavado, que consiste en agregar 10 ml de tampón frío, centrifugación y aspiración. </li><li> Ahora que tenemos una bolita de la pureza deseada, resuspender las células en 80 L de medio de cultivo frío. Para etiquetar ellos, ahora vamos a añadir 20 l de reactivo de captura del ratón IL-17. </li><li> Se incuban las células durante 5 minutos en hielo. </li><li> Después del período de incubación de 5 minutos en hielo, retire el tubo y diluir las células en 10 ml de 37 º C a medio caliente. A continuación, fijar el tubo en el rotador del tubo MACSmix e incubar el tubo a 37 ° C durante 45 minutos en movimiento continuo. El aumento de la temperatura a 37 ° C se reiniciará la secreción de citoquinas. </li></ol> Etiquetado de las células con anticuerpos de detección de IL-17 (biotina) y anti-biotina-PE <ol><li> Después del período de la secreción de 45 minutos a 37 ° C, se coloca el tubo en hielo inmediatamente. Esto evitará que la secreción de citoquinas. A partir de aquí es muy importante para mantener las células en hielo.Trabajar con un tampón frío se evitará la contaminación cruzada de los reactivos de captura. </li><li> Llenar el tubo con tampón frío y centrifugar a 300xg a 2-8 º C durante 10 min. Aspirar el sobrenadante por completo. Repita el paso de lavado una vez más. </li><li> El pellet de células se resuspende en 80 l de tampón frío y el tubo se coloca en el hielo. </li><li> Para evitar la unión inespecífica del anticuerpo, se recomienda la adición de reactivos FcR 10μl de bloqueo e incubar en hielo durante 5 min. Luego se añaden 20 L de ratón de detección de anticuerpos IL-17 (biotina), que se conjuga con biotina y se incuba durante 10 minutos en hielo. </li><li> Una vez más, lavar las células como lo hemos hecho antes mediante la adición de 10 ml de tampón frío y centrifugar a 300xg a 2-8 º C durante 10 min. </li><li> Ahora aspirar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 80 l de tampón frío. </li><li> Añadir 20 l de nuestra secundaria de anticuerpos, anti-biotina-PE. </li><li> Mezclar las células y la solución de anticuerpo secundario, y de nuevo se incuba el tubo durante 10 minutos en hielo. </li><li> Una vez que esta segunda incubación se completa, se lavan las células con 10 ml de tampón frío y centrifugar. </li><li> El pellet de ahora puede ser resuspendido en 500 L de tampón frío. </li><li> Si las células tienen que ser separados para el análisis de aguas abajo, pueden ser marcadas magnéticamente con Anti-PE-MicroBeads y separados de forma manual o automática utilizando columnas MACS y separadores de MACS. </li><li> Hemos completado el etiquetado de los esplenocitos y están listos para su análisis. </li></ol> FACS análisis <ol><li> Para nuestro análisis, vamos a comparar los esplenocitos estimulados y no estimulados por citometría de flujo. </li><li> Antes del análisis de citometría de flujo, las células se tiñeron con yoduro de propidio a 0,5 mg / ml a la puerta de las células muertas. El MACSQuant Analyzer ™ se ha cargado con 200.000 células por cada muestra y que ahora se va a mirar los gráficos de dispersión de la reactividad de los anticuerpos en relación a las muestras. Dos consideraciones importantes para el análisis de células raras - como la IL-17 células positivas - por citometría de flujo son los siguientes: <ul><li> establecimiento de una puerta en los linfocitos de la dispersión frontal versus gráfico de dispersión lateral </li><li> gating y las células muertas (teñidas con yoduro de propidio) y las células B (que puede causar la tinción de fondo inespecífica) para mejorar aún más la sensibilidad de detección </li></ul></li><li> Hemos utilizado CD4-APC anticuerpos para detectar las células T y los anticuerpos CD45R/B220-PerCP para detectar las células B. Vemos las propiedades de dispersión frontal y lateral de las muestras y aplicar una puerta en la población de linfocitos. </li><li> Una segunda puerta se aplicó para ver las células teñidas muertos y células teñidas B (eje Y). Estas células son excluidos del análisis de células T. </li><li> En este ejemplo, que es esencialmente nuestro control negativo, podemos ver que hay células IL-17 CD4 secretan muy pocos positivos en las muestras de T estimuladas - aproximadamente 0,003% (Figura 4). En cuanto a la población de células T estimuladas, podemos ver un gran número de células CD4 positivas las células T que secretan IL-17 - de 0.367% (Figura 5) antes de la separación y el 60,76% después de la separación magnética con tecnología MACS (Figura 5). </li></ol>

Todos los protocolos y hojas de datos están disponibles en www.miltenyibiotec.com. Advertencias Los reactivos contienen azida de sodio. En condiciones ácidas azida de sodio en ácido hidrazoico, que es extremadamente tóxico. Los compuestos de azida deben diluirse con agua antes de desecharlos. Se recomiendan estas precauciones para evitar depósitos en las tuberías, en las que pueden explotar.

Las células TH17 desempeñan un papel integral en la inmunidad adaptativa y la respuesta inflamatoria y son un componente clave en la conducción de la inflamación autoinmune. Este video documenta el uso del ratón Miltenyi de IL-17 Ensayo de secreción - Enriquecimiento de células y kit de detección (PE). Cuando se realiza este procedimiento, es importante tener una estimación de la frecuencia de células IL-17-secreción en su preparación de células de partida. La concentración de células apropiadas durante el período de etiquetado y la secreción de citoquinas evita la contaminación cruzada por otras células en la suspensión y asegura resultados fiables.

<table><tbody><tr><td>Mouse IL-17 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit (PE) </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Propidium Iodide Solution</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>FcR Blocking reagent, mouse </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dead Cell Removal Kit </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; Dissociator</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Starting Kit</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS Columns</td><td>Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS Separator</td><td>Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection and isolation of viable mouse il-17-secreting t cells

La secreción de citocinas MACS tecnología de ensayo permite la detección de citocinas en el nivel de células individuales y el aislamiento sensible de la secreción de citoquinas viable de células. Con el fin de la etiqueta IL-17-secretora de las células, una suspensión de células individuales de esplenocitos de ratón se prepara y se estimuló a 37 ° C con PMA / ionomicina para inducir la secreción de citoquinas. Para detener la secreción de las células se colocan en hielo y se exponen a la IL-17 reactivo captura un anticuerpo bi-específicos que se une a CD45 en la superficie celular de leucocitos y de IL-17, ya que es secretada y capturado cerca de la superficie celular. La secreción se vuelve a iniciadas por el aumento de la temperatura a 37 ° C y IL-17 es atrapado por el reactivo de captura. La secreción de entonces se detuvo de nuevo, mediante la colocación de las células en hielo. Para detectar la IL-17 atrapadas, las células se incubaron con un IL-17-específicas segundo anticuerpo conjugado con biotina y un anticuerpo anti-biotina-PE. Las células pueden ahora ser analizado directamente por citometría de flujo o preparados para el aislamiento y enriquecimiento de su posterior marcado con anti-PE MicroBeads conjugados.

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Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

Este procedimiento describe la detección y aislamiento de los leucocitos de ratón TH17 que secretan activamente IL-17 a la estimulación.

Detección y aislamiento de células viables Ratón T IL-17 Secretoras

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K vistas.  Miltenyi Biotec,GmbH.  ChineseVersion JapaneseVersion 

Video: Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Investigación

Inmunología e Infección

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Detección de True IgE que expresan las células del linaje B de ratón

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

El análisis fenotípico y funcional de las células reguladoras T activadas Aislado de la coriomeningitis linfocítica crónica por el virus ratones infectados

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

La visualización de IL-22 que expresan linfocitos utilizando ratones Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various pathological processes, including anti-helminth immunity, tissue repair, thermogenesis, and autoimmune diseases such as asthma and allergic rhinitis (AR). ILC2s permanently reside in peripheral tissues such as the skin, gut, lungs, and nasal cavity; however, there is limited information about their exact functions in nasal mucosal immunity. CD226 is an activating costimulatory molecule, mainly expressed on natural killer (NK) cells, T cells, and inflammatory monocytes. However, whether ILC2s express CD226 or play a role in the pathogenesis of ILC2s-related diseases remains unknown. Here, we established a method to isolate and identify ILC2s from the nasal mucosa and detected CD226 expression on ILC2s obtained from healthy and AR mice. Herein, we describe this protocol for the isolation and identification of ILC2s from mouse nasal mucosa, which will help explore the internal pathological mechanism of immunological disorders in nasal mucosal diseases.

Group 2 innate lymphoid cells (ILC2s), implicated in type 2 inflammation, mainly participate in response to helminth infection, allergic diseases, metabolic homeostasis, and tissue repair. In this study, a procedure to isolate ILC2s from murine nasal mucosa and detect the expression of CD226 is demonstrated.

Aislamiento de células linfoides innatas del grupo 2 de la mucosa nasal del ratón para detectar la expresión de CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

Descifrando el compromiso temprano de las células T auxiliares foliculares en la infección aguda por LCMV

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, thus establishing long-term humoral immunity. During acute viral infection, the fate commitment of virus-specific TFH cells is determined in the early infection phase, and investigations of the early-differentiated TFH cells are crucial in understanding T cell-dependent humoral immunity and optimizing vaccine design. In the study, using a mouse model of acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection and the TCR-transgenic SMARTA (SM) mouse with CD4+ T cells specifically recognizing LCMV glycoprotein epitope I-AbGP66-77, we described procedures to access the early fate commitment of virus-specific TFH cells based on flow cytometry stainings. Furthermore, by exploiting retroviral transduction of SM CD4+ T cells, methods to manipulate gene expression in early-differentiated virus-specific TFH cells are also provided. Hence, these methods will help in studies exploring the mechanism(s) underlying the early commitment of virus-specific TFH cells.

Autor destacado: Elucidación de las vías de diferenciación celular de TFH en desafíos agudos de LCMV

The current study showcases protocols for assessing the early fate commitment of virus-specific TFH cells and manipulating gene expression in these cells.

Acceso a la diferenciación temprana de células T CD4+ auxiliares foliculares específicas del virus en ratones infectados con LCMV agudo

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...

Detección y aislamiento de células viables Ratón T IL-17 Secretoras

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Capítulos en este video

Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

Detección de True IgE que expresan las células del linaje B de ratón

Ratón Naïve CD4

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

El análisis fenotípico y funcional de las células reguladoras T activadas Aislado de la coriomeningitis linfocítica crónica por el virus ratones infectados

La visualización de IL-22 que expresan linfocitos utilizando ratones Reporter

Aislamiento de células linfoides innatas del grupo 2 de la mucosa nasal del ratón para detectar la expresión de CD226

Acceso a la diferenciación temprana de células T CD4⁺ auxiliares foliculares específicas del virus en ratones infectados con LCMV agudo

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