מדידת פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית in vivo באמצעות מחוון מתח מקודד גנטית

פרוטוקול זה מתאר את היישום של מחווני מתח מקודדים גנטית (GEVIs) ממוקדי מיטוכונדריה. GEVIs אלה מציעים יתרון משמעותי על פני צבעים פוטנציאליים מסורתיים של ממברנה מיטוכונדריאלית על ידי מתן אפשרות לניטור ספציפי, in vivo ובזמן אמת של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית.

פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (MMP, ΔΨ_m) הוא קריטי לתפקודים מיטוכונדריאלים, כולל סינתזת ATP, הובלת יונים, יצירת מיני חמצן תגובתיים (ROS) וייבוא חלבונים המקודדים על ידי הגרעין. שיטות קיימות למדידת ΔΨ_m משתמשות בדרך כלל בצבעי קטיון ליפופיליים, כגון רודמין 800 וטטרמתילרודמין מתיל אסטר (TMRM), אך אלה מוגבלות על ידי ספציפיות נמוכה ואינן מתאימות היטב ליישומי in vivo . כדי להתמודד עם מגבלות אלה, פיתחנו פרוטוקול חדשני המשתמש במחווני מתח מקודדים גנטית (GEVIs). מחווני מתח מקודדים גנטית (GEVIs), המייצרים אותות פלואורסצנטיים בתגובה לשינויים בפוטנציאל הממברנה, הוכיחו פוטנציאל משמעותי לניטור ממברנת הפלזמה והפוטנציאלים העצביים. עם זאת, היישום שלהם על ממברנות מיטוכונדריאליות נותר לא נחקר. כאן, פיתחנו GEVIs ממוקדי מיטוכונדריה מבוססי חלבון המסוגלים לזהות תנודות ΔΨm בתאים ובקליפת המוח המוטורית של בעלי חיים חיים. אינדיקטור הפוטנציאל המיטוכונדריאלי (MPI) מציע גישה לא פולשנית לחקר דינמיקת ΔΨ_m בזמן אמת, ומספק שיטה לחקירת תפקוד המיטוכונדריה בתנאים נורמליים ופתולוגיים כאחד.

מיטוכונדריה הם אברונים חיוניים בתאים אוקריוטיים, המשמשים כספקי האנרגיה העיקריים באמצעות ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) תוך ביצוע מגוון פונקציות חיוניות אחרות, כגון סינתזת מטבוליטים, חציצה של יוני סידן, ייצור חום וויסות הישרדות התאים¹. תפקידיהם קריטיים במיוחד ברקמות מטבוליות מאוד כמו המוח והלב, שם הם מסייעים בשמירה על הומאוסטזיס תאי. פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (MMP, Ψ_m) הוא מרכזי בתהליכים אלה, כולל הנעת סינתזת ATP באמצעות זרחון חמצוני, הקלה על הובלת מטבוליטים ויונים על פני הממברנות המיטוכונדריאליות ותרומה ליצירת מיני חמצן תגובתיים (ROS)^2,3. MMP משפיע גם על המורפולוגיה והדינמיקה המיטוכונדריאלית⁴, כולל מיטופגיה (פירוק סלקטיבי של המיטוכונדריה)⁵ואפופטוזיס (מוות תאי מתוכנת)⁶. שמירה על Ψ_m מתאים חיונית לתפקוד התאי; חוסר הוויסות שלו קשור לפתולוגיות רבות, כולל מחלות ניווניות, אי ספיקת לב וסרטן. השיטות הנוכחיות למדידת Ψ_m התבססו בעיקר על שימוש בצבעים קטיוניים ליפופיליים, כולל TMRM (טטרמתילרודמין מתיל אסטר), TMRE (טטרמתילרודמין אתיל אסטר), רודמין 123, ספרנין O, רודמין 800, DiOC6, JC-1 ^וכו'7. עם זאת, למולקולות פלואורסצנטיות אלו יש מספר מגבלות. צבעים אלה חסרים ספציפיות לתאים, רגישים למרווה, וחלקם רעילים. בנוסף, הם יכולים להתפזר עם הזמן, וכאשר ΔΨ המיטוכונדריאלי אובד, הם דולפים החוצה, מה שהופך אותם לבלתי מסוגלים להצביע על פוטנציאל הממברנה של מיטוכונדריה דה-פולריזציה. יתר על כן, צבעים מבוססי רודמין כמו TMRM ו-TMRE רגישים לטמפרטורה⁸, מה שמחייב התייחסות מדוקדקת להשפעות הטמפרטורה על הקרינה של הצבע, במיוחד בעת מדידת מתח הממברנה המיטוכונדריאלית במהלך פעילויות פיזיולוגיות הכוללות תרמוגנזה תאית.

מחווני מתח מקודדים גנטית (GEVIs), חלבונים המסוגלים לזהות שינויים בפוטנציאל הממברנה באמצעות אותות פלואורסצנטיים ^9,10, התגלו ככלים רבי עוצמה לניטור פוטנציאל הממברנה במגוון הקשרים תאיים¹¹. בעוד ש-GEVIs יושמו בהרחבה לחקר ממברנות פלזמה, חלה התקדמות מועטה בהתאמתם למדידת פוטנציאל הממברנה התוך-תאית, במיוחד עבור מיטוכונדריה. פרוטוקול זה מבקש לטפל בפער זה על ידי שימוש ב-GEVIs ממוקדי מיטוכונדריה שיכולים לנטר את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית במבחנה וב-vivo. על ידי הוספת רצף אותות מיטוכונדריאלי ל-GEVIs הקיימים, ניתן למקד GEVI מתאים למיטוכונדריה¹². אינדיקטורים פוטנציאליים מיטוכונדריאלים אלה (MPI) יספקו תובנות חדשות לגבי הפיזיולוגיה המיטוכונדריאלית ויציעו פוטנציאל משמעותי לחקר תפקוד המיטוכונדריה במצבי מחלה שונים in vivo, וישפרו את ההבנה שלנו כיצד דינמיקה מיטוכונדריאלית תורמת לתהליכים תאיים נורמליים ופתולוגיים כאחד.

כל הטיפול והניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'נגג'ואו. עקר את כל המכשירים הכירורגיים לפני השימוש. עקוב אחר טכניקות אספטיות למניעת זיהום. לאחר שכל הנתונים נרכשו, החיות הומתו באמצעות מנת יתר של הרדמה ממליצה ואחריה עריפת ראשים.

1. יישומי מבחנה

1. בניית פלסמיד
   1. השג את החיישן המואץ של פוטנציאל הפעולה 1 (ASAP1) וגנים ASAP3 מ-Addgene או סינתזה מהרצף. (ASAP1, מזהה הצטרפות NCBI: AHV90412.1, מזהה Addgene: 52519; ASAP3, מזהה Addgene: 132331).
   2. השתמש בפריימרים המפורטים בטבלה 1 עבור מבני פלסמיד.
   3. לביטוי בתאים, השתמש בווקטור EGFPN1 לבנייה.
      1. בתחילה, סנתז את רצף הגנים cox8 (NP_004065, חומצות אמינו 1-29) עם ארבע חזרות טנדם (4cox8) משני צדי אתרי הגבלה של NheI ו-XhoI. עכל גם את מקטע 4cox8 המסונתז וגם את וקטור EGFPN1 עם NheI ו-XhoI, ואחריו קשירה ליצירת וקטור 4cox8-EGFP.
      2. לאחר מכן, בצע הגברת PCR של רצף ASAP1 עם פריימר 1 ופריימר 2. עכל את שבר ה-ASAP1 ואת וקטור 4cox8-EGFP עם SalI ו-NotI, ואחריו קשירה ליצירת וקטור MPI-1 הסופי (MPI מייצג אינדיקטור פוטנציאל מיטוכונדריאלי).
         הערה: המפה הווקטורית של CMV-MPI-1 מתוארת באיור 1. ניתן לגשת לרצף המפורט מ-NCBI (מזהה הצטרפות: PQ678920).
   4. לביטוי ספציפי בנוירונים, בצע הגברת PCR של רצף מקדם hSyn מפלסמיד AAV-hSyn-EGFP (NCBI Accession ID: MH458079, Addgene ID: 50465) באמצעות פריימר 3 ופריימר 4.
      1. עכל גם את רצף hSyn וגם את וקטור 4cox8-EGFP עם AseI ו-NheI, ואחריו קשירה ליצירת וקטור hSyn-4cox8-EGFP. לאחר מכן, בצע הגברת PCR של רצף ASAP3 עם פריימר 1 ופריימר 2.
      2. עכל את וקטור hSyn-4cox8-EGFP ואת רצף ASAP3 עם SalI ו-NotI, ואחריו קשירה ליצירת וקטור hSyn-MPI-2.
         הערה: תנאי ה-PCR ישתנו בהתאם לאנזימים הספציפיים וטמפרטורות ההיתוך של הפריימר (Tm). תגובת PCR טיפוסית כוללת שלב דנטורציה ראשוני ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ואחריו 25-35 מחזורי דנטורציה (95 מעלות צלזיוס, 10 שניות), חישול (55 מעלות צלזיוס, 30 שניות) והארכה (72 מעלות צלזיוס, 30 שניות/קילו-בייט). שלב הארכה אחרון ב-72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות מבטיח סינתזה מלאה של המוצר, ואחריו החזקה ב-4 מעלות צלזיוס. טמפרטורת החישול צריכה להיות כ-5 מעלות צלזיוס מתחת ל-Tm של הפריימרים. עיין בהוראות היצרן לקבלת פרמטרי PCR אופטימליים. הפריימרים עבור ASAP1 ו-ASAP3 זהים.
2. הדמיה בתאים חיים
   1. הכן מדיום תרבית DMEM על ידי הוספת 10% סרום בקר עוברי ו-100 מ"ג/ליטר פניצילין/סטרפטומיצין למדיום.
   2. הכן ריאגנטים של טרנספקציה Ca²⁺ : 2.5 מול/ליטר CaCl₂, 2x HEBS (274 מילימול/ליטר NaCl, 10 ממול/ליטר KCl, 1.4 ממול/ליטר Na₂HPO₄, 15 מילימול/ליטר D-גלוקוז, 42 מילימול/ליטר HEPES, pH 7.07).
   3. הכן את המאגר של Tyrode לשמירה על התאים במהלך ההדמיה (145 ממול/ליטר NaCl, 3 ממול/ליטר KCl, 10 ממול/ליטר HEPES, 10 ממול/ליטר גלוקוז, pH 7.4).
   4. תרבית תאי הלה בצלחת תרבית 35 מ"מ המוזנת במדיום תרבית DMEM באינקובטור עם טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ואווירה של 5% CO₂/95% אוויר. הוסף 2-3 כיסויים לכל מנה כדי לאפשר לתאים לצמוח עליהם.
   5. העבירו את תאי הלה בשיטת משקעי סידן פוספט.
      1. כדי להעביר תאים, התחל בהחלפת מדיום התרבות הישן ב-2 מ"ל של DEM ללא סרום. לאחר 35 דקות, הכינו את תמיסת ה-DNA/Ca²⁺ על ידי ערבוב של 10 מיקרוגרם של DNA, 4 מיקרוליטר של CaCl₂ ו-ddH₂O לנפח סופי של 40 מיקרוליטר בצינור מיקרו-צנטריפוגה.
      2. הוסף 40 מיקרוליטר של 2x HEBS לתמיסת DNA/Ca²⁺ טיפתית תוך ערבוב נמרץ. בועות אוויר עם פיפטה לתערובת כדי להקל על משקעי סידן פוספט.
      3. לאחר 25 דקות, הוסיפו 80 מיקרוליטר מתמיסת המשקעים הזו לצלחת עם התאים והחזירו אותה לחממה למשך 1-2 שעות נוספות. לאחר מכן, הסר את ה-DMEM שאינו בסרום ושטוף את התאים ב-15% גליצרול (מומס ב-PBS) למשך 2 דקות.
      4. לאחר שאיבת הגליצרול, הוסף 2 מ"ל של DMEM המכיל 10% FBS והמשך בתרבית התאים למשך 16-24 שעות.
   6. מניחים כיסויים עם תאים בתבנית תרבית של 35 מ"מ עם 2 מ"ל של מאגר טירוד וצובעים את התאים בצבע רודמין 800 על ידי הוספת 20 מיקרומול/ליטר רודמין 800 (מומס ב-ddH₂O) לצלחת לריכוז סופי של 50 ננומול/ליטר.
   7. הכן מיקרוסקופ פלואורסצנטי והגדר אותו עם המסננים המתאימים ומקור האור כדי לעורר את החלבון עם מקור אור של 488 ננומטר ולאסוף את הפליטה בין 490-540 ננומטר. עורר את צבע הרודמין 800 עם מקור אור של 633 ננומטר ואסוף את הפליטה בין 650-720 ננומטר.
   8. הכינו תמיסת קרבוניל ציאניד m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) ב-500 מיקרומטר (מלאי) והוסיפו לתאים לריכוז סופי של 5 מיקרומטר במהלך ההדמיה.
      הערה: ה-pH של תמיסת 2x HEBS הוא חיוני ליעילות הטרנספקציה. יש להתאים בזהירות את ה-pH ל-7.07 עם נתרן הידרוקסיד מוצק. ה-pH לא יכול להיות נמוך מ-7.01 או גבוה מ-7.12.

איור 1: מפה וקטורית של CMV-MPI-1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. יישומי in vivo

1. מבנה פלסמיד
   1. לביטוי in vivo , השתמש בנגיף AAV לצורך התמרה. השג את עמוד השדרה המבטא עבור אריזות AAV (מזהה Addgene: 46954 או 26968), המכיל רצפי חזרות טרמינל הפוכות (ITR) עבור אריזת נגיף AAV.
   2. בצע הגברת PCR של וקטור hSyn-MPI-2 (משלב 1.1.4) באמצעות פריימרים 5 ו-7 בטבלה 1.
   3. בצע הגברת PCR שנייה באמצעות אותה תבנית ופריימרים 6 ו-8 בטבלה 1.
   4. בצע PCR סופי באמצעות המוצר מה-PCR הראשון והשני (שלבים 2.1.2 ו-2.1.3) כתבנית ופריימרים 5 ו-8 בטבלה 1, ויצירת רצף hSyn-MPI-2 הסופי.
   5. עכל את רצף hSyn-MPI-2 ואת עמוד השדרה של pAAV עם MluI ו-EcoRI, ולאחר מכן קשירה כדי ליצור את המבנה הסופי של pAAV-hSyn-MPI-2. המפה הווקטורית של pAAV-hSyn-MPI-2 מודגמת באיור 2. ניתן לגשת לרצף המפורט מ-NCBI (מזהה הצטרפות: PQ678919).
      הערה: וקטור hSyn-MPI-2 מכיל אתר EcoRI פנימי שמקורו בעמוד השדרה המקורי של EGFPN1, אשר מוסר באמצעות פריימרים ששונו באסטרטגיית PCR חופפת (שלבים 2.1.2-2.1.4).
2. הכנה והתמרה של וירוסים
   1. תרבית תאי HEK293t בצלחת תרבית של 100 מ"מ המוזנת במדיום תרבית DMEM של 10% FBS בחממה עם טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ואטמוספירה של 5% CO₂/95% אוויר כדי להגיע למפגש של 70%.
   2. העברה משותפת של תאי HEK293t עם פלסמיד גן AAV, קפסיד (pAAV-DJ או pAAV9), ופלסמידים מסייעים (pHelper) בשיטת משקעי סידן פוספט. כמות ה-DNA עבור כל פלסמיד הייתה כדלקמן: גן: 10 מיקרוגרם, pHelper: 11 מיקרוגרם, קפסיד: 9 מיקרוגרם. כמות מגיב הטרנספקציה: 12 מיקרוליטר של CaCl₂, 120 מיקרוליטר של 2x HEBS.
   3. דגרו על התאים שעברו טרנספטציה לתקופה של 72 שעות כדי לאפשר ייצור נגיף.
   4. לאחר תקופת הדגירה, קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה ב -400 גרם. שוטפים את התאים עם PBS פעמיים ומשרים את התא ב -400 מיקרוליטר של PBS.
   5. קצור וירוסים מתרחיף תאים בארבעה מחזורים של שיטות הקפאה-הפשרה (37 מעלות צלזיוס ו-80 מעלות צלזיוס). צנטריפוגה את הליזאט ב-13,500 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו את הגלולה. הסופרנטנט מכיל את נגיף ה-AAV.
   6. בצע PCR בזמן אמת כדי לקבוע את הטיטרציה של הנגיף המוכן. פרוטוקול מפורט לקביעת טיטרציה של AAV ניתן למצוא בכתובת https://www.addgene.org/protocols/aav-titration-qpcr-using-sybr-green-technology/.
   7. יש לאחסן את נגיף ה-AAV המוכן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
3. הזרקת וירוס סטריאוטקטית
   1. להרדים עכבר זכר C57/BL בוגר במשקל 24-26 גרם עם 3% נתרן פנטוברביטל באמצעות הזרקה תוך-צפקית במינון של 30 מ"ג/ק"ג. לאחר ההרדמה, קבע את העכברים על מכשיר סטריאוטקסי כדי לשמור על מיקום יציב לאורך כל ההליך.
   2. יש למרוח משחת עיניים וטרינרית כדי להגן על העיניים מפני נזקי אור ולשמור על לחות העיניים.
   3. השתמש בקרם הסרת שיער כדי להסיר שיער על ראש העכבר ולחשוף את הקרקפת.
   4. פתח את הקרקפת באמצעות מספריים לניתוח וחשוף את הגולגולת. טפלו בגולגולת עם 3% מי חמצן כדי לעקר ולדמיין ציוני דרך מרכזיים כמו אתרי ברגמה ולמבדה.
   5. כוונן את מיקום ראש העכבר כדי להבטיח שהגולגולת אופקית.
   6. השתמש במושך מיקרופיפטות הניתן לתכנות כדי למשוך פיפטות זכוכית לצורה ולגודל הרצויים להזרקות מדויקות. מלאו את המיקרופיפטה מזכוכית בשמן פרפין.
   7. מקם את המיקרו-פיפטה באתר היעד. בפרוטוקול זה, המטרה היא אזור M2 בצד ימין, תוך שימוש בקואורדינטות הבאות: AP (קדמי-אחורי), +1.94 מ"מ; ML (בינוני), +0.75 מ"מ; DV (דורסובנטרלי), -1.5 מ"מ.
   8. השתמש במקדחה חשמלית כדי ליצור חור קטן בגולגולת באתר המטרה.
   9. שאפו 500 נ"ל של וירוס בטיטר של 1.5 x 10¹¹ עותקי גנום למיליליטר (GC/mL) דרך קצה המיקרופיפטה. הזרקת 500 nL של וירוס לאתר היעד באמצעות משאבת הזרקה בקצב זרימה של 100 nL/min.
   10. לאחר ההזרקה, השאירו את הפיפטה במקומה למשך כ-5 דקות כדי לאפשר דיפוזיה לפני שתחזירו אותה בזהירות.
   11. השתלת סיב אופטי (קוטר 200 מיקרומטר, צמצם מספרי 0.37, אורך 2 מ"מ) לאתר ההזרקה.
   12. אבטח את הסיב האופטי במקומו באמצעות מלט דנטלי.
   13. לתפור את קרקפת העכבר בחוט ניילון 5-0 (מחט אסתטית Δ1/2 4x12) ולהחזיר אותו לכלוב הביתי שלו.
   14. הנח את כלוב הבית על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר עד שהוא מתאושש לחלוטין מההרדמה.
   15. כבה את כרית החימום ברגע שהחיה מתחילה להסתובב. אפשר עוד שעתיים של הסתגלות לטמפרטורת החדר (RT) לפני העברת העכבר למתקן הדיור.
   16. עכבר הבית במחזור אור של 12 שעות/חושך של 12 שעות בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס עם גישה אד ליביטום למזון ומים למשך 2-3 שבועות כדי לאפשר ביטוי ויראלי.
4. פוטומטריית סיבים
   1. חבר את הסיב האופטי המושתל בעכבר לכבל אופטי.
   2. חבר את הקצה השני של הכבל האופטי לגלאי שישמש ללכידת נתוני ההדמיה.
   3. לצורך הדמיה, השתמש במקור אור כדי לעורר את החלבונים באורך גל של 488 ננומטר. הגדר את הגלאי לאיסוף האור הנפלט באורכי גל הנעים בין 490 ננומטר ל-540 ננומטר.
   4. התאם את עוצמת אור העירור כדי לייעל את האות מבלי לגרום נזק לרקמת המוח.
   5. שנה את הרווחים של אות הפלואורסצנט כדי להבטיח אות ברור וחזק שנלכד על ידי הגלאי.
   6. כדי למנוע הלבנה מהירה של הקרינה, שתפחית את איכות ההדמיה, כוונן את עוצמת האור ואת הרווח של האות הפלואורסצנטי לפי הצורך.
   7. ערכו מבחן התנהגות עכברים.
   8. עקוב באופן רציף אחר תהליך ההדמיה במהלך בדיקת ההתנהגות.
5. ניתוח נתונים
   1. השתמש ב-Python וב-GNUplot כדי ליצור מפת חום של ניסויים ניסיוניים לייצוג חזותי של הנתונים. קודי המקור מסופקים בקובץ משלים 1.

איור 2: מפה וקטורית של AAV-hSyn-MPI-2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר בניית הפלסמיד CMV-MPI-1, יכולתו למקד את המיטוכונדריה נבדקה בתאי הלה באמצעות הסמן המיטוכונדריאלי רודמין 800 לצביעה. ניסויי קו-לוקליזציה הראו רמה גבוהה של חפיפה בין אות הקרינה של MPI-1 לבין האות מרודאמין 800, מה שמצביע על כך ש-MPI-1 ממוקם בהצלחה במיטוכונדריה (איור 3).

איור 3: קולוקליזציה של MPI-1 עם מיטוכונדריה בתאי Hela. CMV-MPI-1 הועבר בתאי הלה ונצבע ברודמין 800, צבע רגיש לפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר הטרנספקציה של MPI-1 לתאי HeLa, נבדקה רגישות המתח של התאים על ידי הכנסת CCCP (קרבוניל ציאניד m-chlorophenyl hydrazone), מפרק מיטוכונדריאלי. הוספת CCCP לתאים הביאה לדפולריזציה של המיטוכונדריה. נעשה שימוש בצבע רגיש-למתח (rhodamin800), שניתן להבחין בו כירידה בקרינה של צבע רגיש-למתח (rhodamin800) או MPI-1 (איור 4).

איור 4: שינויים פלואורסצנטיים רגישים למתח בתגובה לטיפול ב-CCCP. (A) תמונות פלואורסצנטיות של תאי HeLa המבטאים ביציבות MPI-1 לפני ואחרי הוספת המנתק CCCP בריכוז של 5 מיקרומטר. רודמין 800 שימש כאינדיקטור מסורתי לפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. (B) שינויים בעוצמת הקרינה של MPI-1 ורודמין 800 עם יישום CCCP (n = 14 תאים). קיצורים: T: זמן. נתון זה שונה באישור יאנג ^{ואחרים.12}. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר הזרקת נגיף hSyn-MPI-2 AAV לקליפת המוח M2 של העכבר, השינוי הקרינה נוטר במהלך הרדמה המושרה על ידי איזופלורן. הקרינה של MPI-2 פחתה בהרדמה (איור 5), מה שמרמז על ירידה ב-MMP במהלך התהליך הזה.

איור 5: פוטומטריית סיבים in vivo של MPI-2 בקליפת המוח M2 במהלך הרדמה המושרה על ידי איזופלורן. (A) תמונות שמראות את הקרינה של אזורי מוח אחרי הזרקת וירוס. האזור בו הושתל הסיב מסומן בקווים לבנים. תמונת הפלואורסצ שולבה עם מפת מוח של עכבר כדי להראות היכן בוצעה ההזרקה. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (B) שינויים בקרינה של MPI-2 שנצפו במספר ניסויים של הרדמה המושרה על ידי איזופלורן (n = 26 ניסויים שכללו 5 עכברים). קיצורים: T: זמן. הקו המקווקו מראה מתי הוחל איזופלורן. נתון זה שונה באישור יאנג ^{ואחרים.12}. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: פריימרים למבני פלסמיד.

קובץ משלים 1: קוד מקור לניתוח נתונים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

מתח הממברנה המיטוכונדריאלית נשמר על -120--180 mV בתנאי מנוחה ומשתנה עם שינויים במצב המטבולי. נכון לעכשיו, ניתן לבצע מדידה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בשיטות אלקטרופיזיולוגיות ושיטות צבע פלואורסצנטיות. הידוק טלאי מיטוכונדריה דורש בידוד של מיטוכונדריה והרס מבנים תאיים¹³. גישה זו עשויה להוביל למדידות החורגות מהתנאים הפיזיולוגיים. שיטת בדיקת הקרינה היא הגישה הנפוצה למדידת MMP. עם זאת, מולקולות פלואורסצנטיות אלה אינן יכולות להכתים תאים ספציפיים, נוטות להרוות, וחלק מהצבעים רעילים. יתר על כן, צבעים אלה אינם מתאימים ליישומי in vivo בשל המגבלות הטבועות בהם, כולל חוסר ספציפיות התא ושיווי המשקל לאורך זמן ארוך (~30 דקות).

פרוטוקול זה מספק שיטה חדשה לניטור MMP, במיוחד in vivo. המפתח לשיטה זו הוא למצוא GEVI מתאים שניתן למקד למיטוכונדריה על ידי מיזוג מסוף ה-N שלו לאות מיקוד מיטוכונדריאלי. מחקרים קודמים הראו שחלק מה-GEVIs, כמו Arclight ו-SomArchon, לא הצליחו להתמקם במיטוכונדריה¹². עם זאת, ניתן למקד משפחות חלבונים של חיישן פוטנציאל פעולה מואץ (ASAP) למיטוכונדריה על ידי היזוגן לאות מיקוד מיטוכונדריאלי¹².

השלב הראשוני של הפרוטוקול כולל בניית פלסמיד עם רצף חוזר של ארבע פעמים של COX8, שאינו אפשרי באמצעות PCR בשל אופיו החוזר על עצמו. במקום זאת, נעשה שימוש בסינתזת DNA או בשיטות הקשורות לאנזים כדי ליצור את רצף 4cox8. רצפי מיקוד מיטוכונדריאלים אחרים¹⁴, עשויים גם הם להתאים, מה שדרש ניתוח קולוקליזציה. החבילה של AAV חיונית ליישומי in vivo הבאים. הטיטרציה של AAV חייבת להיות מתאימה כדי להבטיח העברה יעילה מבלי לגרום לרעילות. כדי לשפר את היעילות, יש צורך בשינויים כגון אופטימיזציה של תנאי טרנספקציה. ניתן להשיג זאת על ידי התאמת כמויות ה-DNA והריאגנטים הטרנספקטיביים המשמשים, ובכך לשפר את יעילות הטרנספקציה. עבור העברת משקעים של סידן, ה-pH של HEBS הוא קריטי. זה לא יכול להיות נמוך מ-7.01 או גבוה מ-7.12.

ה-MPI עולה על צבעי MMP מסורתיים בכמה דרכים. זה מאפשר ניטור בזמן אמת של שינויים ב-MMP, יכולת שחסרה לצבעים מסורתיים בשל דרישתם לזמני שיווי משקל. הקידוד הגנטי של MPI מאפשר גם ביטוי ספציפי לסוג התא, תוך עקיפת חוסר הספציפיות של צבעים מסורתיים. בנוסף, MPI שומר על המיקוד המיטוכונדריאלי שלו גם עם דה-פולריזציה, בניגוד לצבעים מסורתיים, שמאבדים את המיקוד המיטוכונדריאלי שלהם בתנאים כאלה. יתר על כן, המיקוד המיטוכונדריאלי היציב של MPI הופך אותו למועמד מצוין ליישומי הדמיה in vivo .

למרות יתרונותיו, ל- MPI יש מגבלות מסוימות. פוטוהלבנה, בעיה נפוצה עם חלבונים פלואורסצנטיים, יכולה להוות דאגה עם MPI. ניתן להפחית זאת חלקית על ידי מזעור החשיפה לאור במהלך ההדמיה. יתר על כן, קיים פוטנציאל לחפיפה ספקטרלית בין MPI לפלואורופורים אחרים, מה שמחייב בחירה קפדנית של מסננים להדמיה מרובת צבעים. פלואורסצנטיות ברקע היא גורם הדורש תשומת לב. כדי להתמודד עם זה, ניתן להעביר תאים במשותף עם mCherry ממוקד מיטוכונדריה. אסטרטגיה זו עוזרת להבחין בין אותות אמיתיים לחיוביים כוזבים במהלך תהליך הניטור. הגרסה הנוכחית של ה-MPIs, כמו GEVIs אחרים המשמשים לזיהוי שינויים במתח קרום הפלזמה העצבי, יכולה לנטר רק תנודות בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, ולא ערכים מוחלטים. כדי לכייל את האותות ולהמיר אותם לערכי פוטנציאל ממברנה בפועל בוולט, שיטה מטרית יחס¹⁵, הכוללת היתוך עם חלבון פלואורסצנטי אחר, מבטיחה. ככל שמשפחת חלבוני ASAP ממשיכה להתפתח¹⁶, אנו צופים שיפורים נוספים ברגישות. זה מציע אפשרויות מלהיבות לפיתוח MPIs רגישים יותר בעתיד.

ה-MPI טומן בחובו הבטחה משמעותית למחקר בתחומים שונים, כולל ביו-אנרגטיקה, דינמיקה מיטוכונדריאלית ומודלים של מחלות. במדעי המוח, ניתן להשתמש בו כדי לנטר MMP בנוירונים, ומציע תובנות לגבי מחלות ניווניות הקשורות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה. בקרדיולוגיה, רגישות המתח הגבוה של MPI הופכת אותו למתאים לחקר מיטוכונדריה לבבית במודלים של איסכמיה ואי ספיקת לב. יתר על כן, בחקר הסרטן, ניתן להשתמש ב-MPI כדי לחקור את השינויים הביו-אנרגטיים האופייניים לתאים סרטניים, מה שתורם להבנה טובה יותר של מחלה מורכבת זו.

למחברים אין מה לחשוף.

אנו מודים לתמיכה של הקרן הלאומית למדעי הטבע (NSF) של סין: JSK (32071137 ו-92054103) ולמימון צוות המחקר והחדשנות המדעי של בית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת ג'נגג'ואו: JSK (ZYCXTD2023014).