טכניקת שחייה אופקית בצורת U להכנת זרע איכותי עם אינדקס פיצול DNA נמוך

פרוטוקול זה מתאר שיטה לסינון זרע איכותי עם אינדקס פיצול DNA נמוך על ידי שימוש במאפייני תנועתיות הזרע ותיגמוטקסיס. השיטה משתמשת בנתיב שחייה אופקי בצורת U, המאפשר לזרע איכותי להגיע לצד הנגדי דרך טיפות חיץ, בעוד שזרע מת, פסולת תאים וזיהומים אינם נכללים.

זרע אנושי הוא תערובת מורכבת הכוללת זרעונים תנועתיים בהדרגה, זרעונים לא תנועתיים, זרעונים לא תנועתיים, פסולת תאים ופלזמת זרע צמיגה. זרע איכותי מתייחס לזרעונים תנועתיים בהדרגה עם מורפולוגיה תקינה, שלעתים קרובות מציגים אינדקס פיצול DNA נמוך יותר (DFI) ופוטנציאל הפריה גבוה יותר. הכנת זרע איכותי היא שלב קריטי בטכנולוגיית רבייה בסיוע אנושי. שיטת הכנת הזרע המסורתית, צנטריפוגה שיפוע בצפיפות לא רציפה (DGC), גוזלת זמן ועתירת עבודה. צנטריפוגה חוזרת עלולה לפגוע ב-DNA של הזרע, ובכך להשפיע על ההפריה והתפתחות העובר לאחר מכן. מחקר זה מציג שיטת שחייה אופקית בצורת U (UHS) להכנת זרע הזרקת זרע תוך ציטופלזמית (ICSI), אשר מבטלת באופן משמעותי את ההשפעות המזיקות של צנטריפוגה על DNA הזרע. שיטת UHS כוללת יצירת נתיב UHS באמצעות מדיום הפריה בתוך צלחת הפעלה של ICSI. מיקרו-טיפת מדיום הפריה של 10 מיקרוליטר ממוקמת בנקודת ההתחלה בצד שמאל של נתיב UHS כדי להחזיק את הזרע. שתי טיפות חיץ נוספות של מדיום דישון של 10 מיקרוליטר ממוקמות במרווחים לאורך החלק האמצעי השמאלי של הנתיב, כאשר כל הטיפות מחוברות באמצעות מדיום הפריה. לאחר מכן המנה מכוסה בשמן תרבית ומודגרת למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם 6% CO₂ לאיזון. לאחר מכן, 3 מיקרוליטר זרע מתווספים למיקרו-טיפה בנקודת ההתחלה. זרעונים איכותיים שוחים לצד ימין של נתיב UHS, ומקלים על יניקתם לתוך מחט ההזרקה ICSI. זרע מת, פסולת תאים וזיהומים צמיגים אחרים נשארים ברובם בנקודה ההתחלתית או בטיפות החיץ. עיבדנו בו זמנית 21 דגימות זרע בטכניקות UHS ו-DGC והשווינו את ה-DFI שלהן. התוצאות הראו כי ה-DFI בקבוצת ה-DGC היה 5.5% ±-3.2%, בעוד שה-DFI בקבוצת UHS היה 1.7% ±-1.1%. ההבדל בין שתי הקבוצות היה מובהק סטטיסטית (P < 0.05).

טכניקות אופטימיזציה של זרע והכנת זרע ממלאות תפקיד מכריע בהשגת חלקיקי תאים מועשרים בזרעונים מעולים מבחינה מבנית ותפקודית, המהווה שלב מפתח בטכנולוגיית רבייה בסיוע אנושי¹. מטרת אופטימיזציית הזרע היא: (1) להפחית או להסיר פרוסטגלנדינים, תאים פעילים במערכת החיסון, נוגדנים נגד זרע, זרע לא נייד באיכות נמוכה, חיידקים ופסולת בפלזמת הזרע; (2) להפחית או לבטל את צמיגות הזרע; ו-(3) לקדם קיבולת זרע ולשפר את יכולת ההפריה. טכניקת הכנת זרע אידיאלית אמורה לשחזר אוכלוסיית זרע מתפקדת ביותר השומרת על שלמות ה-DNA ואינה גורמת לתפקוד לקוי באמצעות ייצור מיני חמצן תגובתיים (ROS) על ידי זרע ולויקוציטים².

טכנולוגיית הכנת הזרע הנפוצה ביותר כיום היא שיטת DGC. היתרונות של שיטה זו הם שיעור ההתאוששות הגבוה שלה³ וסטנדרטיזציה קלה. בשימוש מעשי, ניתן לבחור אותו בצורה גמישה על סמך איכות הדגימה עבור שיטת שיפוע בצפיפות כפולה⁴, שיטת mini-DGC או שיטת צנטריפוגה שיפוע חד-שכבתית⁵. ניתן להשתמש בשיטה זו להכנת זרע איכותי בעל חיוניות טובה, נקי מפסולת תאים, תאי דם לבנים מזוהמים, תאים שאינם נבט ותאי נבט מנוונים. עם זאת, החיסרון בשיטה זו הוא שהיא דורשת צנטריפוגה, שעלולה לגרום נזק ל-DNA זרע⁶.

השיטה המוצגת כאן אומצה מהמחקר המקורי של Baldini et ^al.7, שהתמקד בנדידת זרע אופקית בכלי הזרקה. שיטה שונה זו משלבת נתיב אופקי בצורת U להפרדת זרע איכותי עם חיוניות חזקה. זה מונע נזק ל-DNA הנגרם על ידי צנטריפוגה וממזער את ההשפעה של זרע מת, פסולת תאים וזיהומים צמיגים אחרים במהלך הליכי הזרקת זרע תוך ציטופלזמית (ICSI).

הגישה הספציפית כוללת שימוש במדיום דישון ליצירת נתיב UHS בצלחת ההפעלה של ICSI. מיקרו-טיפה של מדיום הפריה של 10 מיקרוליטר ממוקמת בנקודת ההתחלה השמאלית של נתיב UHS כדי להחזיק את הזרע. שתי טיפות חיץ נוספות של 10 מיקרוליטר ממוקמות במרווחים בחלק האמצעי השמאלי של נתיב UHS, וכל הטיפות מחוברות באמצעות מדיום הפריה. לאחר כיסוי ההתקנה בשמן גידול, המנה מודגרת למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם 6% CO₂ לשיווי משקל. לאחר מכן, 3 מיקרוליטר זרע מתווספים למיקרו-טיפה בנקודת ההתחלה בצד שמאל של נתיב UHS. זרע איכותי שוחה למסלול בצד ימין של נתיב UHS, ומקל על איסופו עם מחט ההזרקה ICSI. זרע מת, פסולת תאים וזיהומים צמיגים אחרים נשארים בעיקר במיקום המקורי או בטיפות החיץ.

השבב המיקרופלואידי מדמה את תהליך הברירה הטבעית במערכת הרבייה הנשית, ומאפשר בידוד אופטימלי של זרע איכותי מזרע ללא צנטריפוגה. זה קריטי לשיפור תנועתיות הזרע⁸, הפחתת אינדקס פיצול ה-DNA של הזרע⁹ ושיפור תוצאות ההריון¹⁰. עם זאת, הייצור של מכשירים כאלה הוא מורכב, יקר ומאתגר ליישום נרחב.

הפרוטוקול המתואר כאן מציע חלופה חדשנית, פשוטה ואפשרית. על ידי מינוף מאפייני תנועתיות הזרע, שיטה זו משיגה תוצאות דומות לאלו של טכנולוגיה מיקרופלואידית. הזרע המוכן מפגין חיוניות חזקה, מדדי פיצול DNA נמוכים, ומתאימים היטב לשימוש ב-ICSI.

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים העממי הראשון של האוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג (מספר אישור: KY-2024-181-01). הסכמה מדעת התקבלה מהמטופלים שהדגימות שלהם שימשו במחקר זה. ההליך צריך להתבצע על ידי צוות מנוסה בהתאם לנוהלי מעבדה טובים והנחיות קליניות^11,12. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים מסופקים בטבלת החומרים.

1. הכנת צלחת הפעלה ICSI

1. השתמש במדיום דישון של 20 μL כדי ליצור מסילות בצורת U בצלחת הפעולה ICSI (איור 1). אורך המסילה השמאלית של המסילה בצורת U צריך להיות כ-30 מ"מ, ואורך המסילה הימנית צריך להיות גם כ-30 מ"מ.
2. מוצצים מדיום הפריה של 10 מיקרוליטר בעזרת פיפטה ויוצרים טיפה עגולה בנקודת ההתחלה השמאלית של המסילה בצורת U. חבר אותו לנקודת ההתחלה השמאלית של המסלול בצורת U כדי להוסיף את תמיסת מלאי הזרע.
3. צור שתי טיפות חיץ בינוניות של 10 μL במרווחים בחלק האמצעי השמאלי של נתיב UHS. חבר את כל הטיפות למדיום ההפריה.
4. צור רצועה ארוכה של טיפת נוזל בצד ימין של הנתיב בצורת U באמצעות 2.5 מיקרוליטר פוליוויניל פירולידון (PVP). ודא שרצועת ה-PVP מקבילה לנתיב הימני של הנתיב בצורת U.
5. הכינו שש מיקרו-טיפות באמצעות מדיום עיבוד הביציות בצד ימין של רצועת ה-PVP, עם 20 מיקרוליטר לטיפה.
6. הוסף לתבשיל שמן תרבית של 7 מ"ל, וודא שהשמן מכסה את הנקודה הגבוהה ביותר של הטיפה. יש להניח אותו באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 6% CO₂ למשך הלילה לאיזון.

2. איסוף דגימות זרע

1. לספק למטופלים הנחיות ברורות בכתב ובעל פה לגבי איסוף דגימת הזרע. ודא שאיסוף הדגימות הושלם, והורה למטופלים להימנע משפיכה במשך 3-7 ימים לפני האיסוף.
2. אסוף זרע באמצעות אוננות לתוך כוס איסוף זרע מיוחדת חד פעמית, סטרילית ולא רעילה. ודא שכל השפיכה נאספת, והורה לאדם לדווח על כל אובדן של חלק כלשהו מהדגימה.
3. אמת את השמות, מסמכי הזיהוי התקפים וטביעות האצבע של בן הזוג של המטופל. סמן את השם ומספר הרשומה הרפואית של בן הזוג של המטופל על הגוף והמכסה של איסוף הזרע.
4. לאחר שהמטופל הגברי אסף זרע, העבירו את הדגימה פנים אל פנים בין הצוות למטופל. קח כמות קטנה של דגימת הזרע לאריזה ואחסון. ודא שהמטופל חותם באזור האריזה.
5. מספר ואחסן את הדגימות העטופות למשך שנתיים. רשום את פרטי המטופל, מספר הזיהוי והחתימות של הנמען והעדים ביומן עיבוד הזרע.
6. אם איש צוות כלשהו במרכז הרבייה מגלה את זהותו של מטופל חשוד, הפסק לקבל את הדגימה ואמת מחדש את זהות המטופל. אל תקבל שתי דגימות או יותר בו זמנית. אם יש חשד לבלבול בדגימות, הפסק לקבל אותן.

3. ניתוח דגימת זרע

1. שימו לב לצבע דגימות הזרע.
   הערה: זרע רגיל נראה הומוגני ולבן-אפרפר לאחר הנזלה. זרע עם ריכוז זרע נמוך מאוד עשוי להיראות שקוף. אם קיימים כדוריות דם אדומות, הזרע עשוי להיראות חום-אדמדם. אם המטופל סובל מצהבת או נוטל ויטמינים מסוימים, הזרע עשוי להיראות צהוב.
2. מדוד את נפח הזרע בשיטת השקילה, מדויק עד 0.1 מ"ל.
3. מניחים את דגימת הזרע בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15-30 דקות. שאבו אותו לתוך פיפטה חד פעמית מפלסטיק בעלת קדח רחב (קוטר של כ-1.5 מ"מ), המאפשרת לזרע לרדת על ידי כוח הכבידה. שימו לב לאורכו של כל חוט.
   הערה: שפיכה נוזלית רגילה יוצרת טיפות קטנות ובדידות. אם הצמיגות אינה תקינה, הטיפה תיצור חוט שאורכו יותר מ -2 ס"מ.
4. אם הזרע עדיין לא נוזל תוך 60 דקות, הוסף כמות שווה של מדיום הפריה. לאחר מכן, שאפו ונשפו שוב ושוב את התערובת באמצעות פיפטת העברה חד פעמית מפלסטיק עד שהיא מתנזלת לחלוטין.
5. מדוד את ערך ה-pH של הזרע באמצעות נייר בדיקת pH מדויק (pH 6.0-10.0).
6. קח 10 מיקרוליטר זרע נוזלי לחלוטין וטפטף אותו על תא ספירה של מקלר. העריכו את תנועתיות הזרע בשדה פי 200 עם מיקרוסקופ אופטי. שימו לב לנוכחות של אגלוטינציה של זרע ותאים שאינם זרע.
7. העריכו את ריכוז הזרע בשדה פי 200 באמצעות מיקרוסקופ אופטי.

4. איסוף ביציות

1. הכינו מנה לאיסוף ביציות (OPD) יום לפני שאיבת הביציות. הוסף 2.5 מ"ל של מדיום לעיבוד ביציות לתבנית תרבית סטרילית בגודל 35 מ"מ. לאחר מכן, מוסיפים 1.5 מ"ל שמן ומניחים את המנה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה לשיווי משקל.
2. הכינו שתי מנות לתרבית ביציות (OCD) יום לפני שאיבת הביציות. הוסף 1 מ"ל מדיום הפריה לטבעת הפנימית של צלחת תרבות באר מרכזית סטרילית, ואז הוסף 1 מ"ל שמן. הוסף 4 מ"ל של מדיום הפריה לטבעת החיצונית. מניחים את המנה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 6% CO₂ לאיזון למשך הלילה.
3. הפעל את כל תנורי החימום וצלחות החימום ומדוד את הטמפרטורה 30 דקות לפני שאיבת הביציות.
4. שטפו ידיים עם חומר חיטוי לידיים ושטפו היטב במים זורמים. ללבוש כפפות נקיות, סטריליות ונטולות אבק.
5. מחממים את צלחת התרבות הסטרילית על פלטפורמת חימום של 37 מעלות צלזיוס.
6. ודא בקפדנות את זהות המטופל לפני שאיבת הביציות.
7. שאפו נוזל זקיקי למבחנות סטריליות באמצעות לחץ שלילי, ולאחר מכן העבירו אותו מיד לאמבריולוגים במעבדה.
8. שפכו את כל הנוזל הזקיקי לתוך צלחות תרבית סטריליות וחפשו קומפלקסים של ביציות קורונה קומולוס (OCCCs) תחת סטריאומיקרוסקופ בהגדלה נמוכה. אסוף את ה-OCCCs באמצעות פיפטה והנח אותם ב-OPD לאחסון זמני ב-37 מעלות צלזיוס.
9. רשום את הכמות, הצבע, מספר הזקיקים ומספר ה-OCCCs בנוזל הזקיקים.
10. לאחר שאיבת הביציות, העבירו את ה-OCCCs ל-OCD באמצעות פיפטה סטרילית של פסטר. הניחו אותם במהירות בחממת תרבית (37 מעלות צלזיוס, 6% CO₂, 5% O₂ ולחות רוויה) למשך שעתיים.
11. הכינו צלחת של ארבע בארות, הוסיפו 0.5 מ"ל תמיסת היאלורונידאז לבאר הראשונה, ו -1 מ"ל של מדיום לעיבוד ביציות לכל אחת משלוש הבארות הנותרות. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
12. השתמש בפיפטה של פסטר כדי להעביר OCCCs משלב 4.10 להיאלורונידאז המכיל היטב למשך 30 שניות. לאחר מכן, העבירו את ה-OCCCs למדיום עיבוד ביציות המכיל היטב.
13. השתמש בצינור הפשטת ביציות בקוטר 150 מיקרומטר כדי לנשוף ולשאוף את ה-OCCCs כדי להסיר תאי גרנולוזה. לאחר מכן, השתמש בפיפטה חדשה של פסטר כדי להעביר את הביציות למדיום עיבוד הביציות לשטיפה. העבירו אותם ל-OCD אחר מאוזן מראש והניחו אותם באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 6% CO₂ .

5. בחירת זרע ותפעול ICSI

1. הוסף 5 מיקרוליטר זרע למיקרו-טיפת מדיום ההפריה בנקודת ההתחלה השמאלית של המסלול בצורת U בצלחת ההפעלה ICSI, שהוכנה משלב 1.1 לשלב 1.6.
2. הנח את צלחת ההפעלה ICSI לתוך חממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 6% CO₂ למשך 30-60 דקות.
3. פתח את המיקרוסקופ ההפוך, מערכת ההפעלה של המיקרוסקופ ושלב חימום הבמה כדי להבטיח שכל הפקדים התפעוליים ישוחזרו לטווח הניתן לשליטה המקורי שלהם, מה שמאפשר פעולה חלקה ונוחה.
4. התקן את מחט ה-ICSI לתוך מחזיק המחט. תקן את מחזיק המחט על המיקרומניפולטור, כוונן את מחט האחיזה ומחט ההזרקה בעדשת האובייקטיביות פי 4, והתאם ברצף את הזוויות והמיקום שלהן כך ששתי המחטים יהיו יחסיות ומקבילות לבמה. בדוק את טווח התנועה של מחט ההפעלה מתחת לעדשת האובייקט × 20.
5. כוונן את הזווית והמיקום של מחט החזקת הביצית ומחט ההזרקה מתחת לעדשת האובייקט פי 4, כך ששני ראשי המחט יהיו יחסיים ומקבילים לבמה. הזז את מחט ההפעלה קדימה, אחורה, שמאלה וימינה. בדוק את טווח התנועה של מחט ההפעלה תחת יעדי 10x ו-20x.
6. הרם את מחט החזקת הביציות ומחט ההזרקה כדי להבטיח שהגובה בין שולחן הניתוחים לשולחן החימום מאפשר מיקום קל של כלי הניתוח מבלי לגעת במחט ההפעלה.
7. לאחר בדיקה כפולה, העבירו את הביציות שנבחרו משלב 4.12 למיקרו-טיפות בינוניות לעיבוד ביציות בצלחת ההפעלה ICSI, אחת לכל טיפה.
8. הנח את צלחת ההפעלה המכילה את הביצית על ה-hottagה של מפעיל המיקרוסקופ המוכן.
9. כוונן את אורך המוקד של המיקרוסקופ מתחת לעדשת האובייקטיבית פי 10 כדי להפוך את הקצוות של המיקרו-טיפות בתוך צלחת ההפעלה לברורים וגלויים.
10. הורד את מחט ההזרקה לתוך רצועת ה-PVP של צלחת ההפעלה ICSI. כוונן את המיקרוסקופ כדי להפוך את מחט ההזרקה לגלויה בבירור, ושאפו כמות קטנה של PVP לתוך מחט ההזרקה בו זמנית.
11. העבר את מחט ההזרקה לרצועה הארוכה בצד ימין של המסלול בצורת U וחלץ זרעונים איכותיים עם מורפולוגיה טובה ותנועתיות מתקדמת.
12. העבירו את הזרע לרצועת ה-PVP בצד ימין והניחו את הזרע בתחתית צלחת הניתוח.
13. לחץ בעדינות על מחט ההזרקה בחלק האמצעי או התחתון של זנב הזרע, משוך במהירות את מחט ההזרקה לאחור ושרוט את הזרע כדי לגרום לו לעצור.
14. שאפו את הזרע מהזנב לראש לתוך מחט ההזרקה.
15. העבירו את מחט ההזרקה לתוך טיפת המדיום לעיבוד הביציות המכילה את הביצית בצד ימין.
16. הורד את מחט החזקת הביצית והזיז בעדינות את הביצית כדי למקם את הגוף הקוטבי הראשון בשעה 12, תוך אבטחת הביצית.
17. התאם את המחט המיקרו-כירורגית ואת קרום הביציות לאותו מישור אופקי. דחוף את הזרע לקצה מחט ההזרקה.
18. עוברים אנכית דרך ה-zona pellucida בשעה 3 על הביצית וממשיכים להזריק את המחט עד שהיא מגיעה למרכז הביצית או חוצה מעט את המיקום המרכזי, עם נסיגה קלה של מחט ההזרקה.
    הערה: כאשר מתרחש ריפלוקס מהיר בציטופלזמה ובזרע, זה מצביע על כך שקרום הביצית נשבר והשאיפה נעצרה.
19. הזרקו לאט זרע לציטופלזמה של הביצית וצאו ממחט ההזרקה. עומק הזרקת הזרע לציטופלזמה צריך להיות כ- 50%-75% מקוטר הביצית.
20. לאחר משיכת מחט ההזרקה, כוונן את הלחץ השלילי של מחט החזקת הביציות כדי לשחרר את הביציות.
21. חזור על השלבים לעיל עד להזרקת כל הביציות הבוגרות.
22. העבירו את צלחת ה-ICSI מהפלטה החמה של המיקרוסקופ למיקרוסקופ הניתוח.
23. הסר את צלחת תרבות המחשוף מהחממה.
24. העבירו את ביצית הזרע שהוזרקה למיקרו-טיפה בצלחת תרבית מחשוף.
25. מניחים את צלחת תרבית המחשוף בחזרה לחממה של 37 מעלות צלזיוס, 6% CO₂, 5% O₂ .

6. הכנת זרע בשיטת DGC

1. הוסף 1.5 מ"ל של תמיסת צנטריפוגה בשיפוע בצפיפות של 45% למבחנה תחתונה חרוטית סטרילית של 15 מ"ל.
2. הוסף לאט 1.5 מ"ל של תמיסת צנטריפוגה שיפוע בצפיפות של 90% לתחתית תמיסת הצנטריפוגה של שיפוע בצפיפות של 45%, תוך שמירה על הממשק בין שני הנוזלים.
3. הוסף בעדינות את הזרע הנוזלי על תמיסת הצנטריפוגה והצנטריפוגה בשיפוע של 300 x גרם למשך 15 דקות (בטמפרטורת החדר).
4. הסר את הסופרנטנט והוסף כ-0.5 מ"ל ממשקעי הזרע הנותרים ל-3 מ"ל של מדיום הפריה. נושפים ומערבבים היטב.
5. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
6. פיפט את הסופרנטנט והשאיר כ-0.2 מ"ל משקעים.
7. הוסף כמות מתאימה של מדיום הפריה כדי להשהות מחדש את המשקעים, לספור את ריכוז הזרע וחיוניותו ולתעד. מניחים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 6% CO2 לשימוש מאוחר יותר.

7. איתור שלמות ה-DNA הגרעיני של הזרע (שיטת פיזור כרומטין זרע, SCD)

1. התאם את הטמפרטורה הפנימית ל-20-28 מעלות צלזיוס לפני ביצוע הניסוי. הסר את ערכת הריאגנטים ותן לה להתייצב בטמפרטורת החדר למשך 30-60 דקות.
2. הכן את תמיסת הדנטורציה: קח 0.8 מ"ל תמיסת דנטורציה מרוכזת והוסף אותה ל -100 מ"ל מים מזוקקים.
3. הכן את תמיסת האתנול של 70%: קח 26.65 מ"ל מים מזוקקים ו-70.35 מ"ל אתנול נטול מים כדי להכין את תמיסת האתנול של 70%.
4. הכן את תמיסת האתנול של 90%: קח 9.55 מ"ל מים מזוקקים ו-90.45 מ"ל אתנול נטול מים כדי להכין את תמיסת האתנול של 90%.
5. הנח את צינור האגרוז עם נקודת ההיתוך הנמוכה (המכיל 25 מיקרוליטר של תמיסת אגרוז עם נקודת התכה נמוכה) לתוך אמבט מים של 90-100 מעלות צלזיוס למשך 1-2 דקות עד שג'ל האגרוז נמס לחלוטין. לאחר מכן, הנח את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עד שהטמפרטורה קבועה.
6. קח 3-10 מיקרוליטר זרע לפני טיפול אופטימיזציה ותרחיף זרע לאחר טיפול אופטימיזציה. מוסיפים אותם לצינורות אגרוז שונים עם נקודת התכה נמוכה, ואז מערבבים היטב.
7. קח 30 מיקרוליטר מתרחיף האגרוז בעל נקודת ההיתוך הנמוכה המכיל זרע והפיל אותו על מגלשת זכוכית שטופלה מראש במצב אופקי.
8. מכסים בעדינות את זכוכית הכיסוי (בגודל 22 מ"מ על 11 מ"מ) בשקופית, והימנעו ככל האפשר מהיווצרות בועות.
9. מניחים את מגלשת הזכוכית שטופלה מראש במקרר בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, תוך שמירה על המגלשה במצב אופקי לאורך כל התהליך. הסר את מגלשת הזכוכית מהמקרר והחלק בעדינות כדי להסיר את זכוכית הכיסוי.
10. טבלו במהירות את מגלשת הזכוכית שטופלה מראש בתמיסת הדנטורציה למשך 7 דקות.
11. הסר את שקופית הזכוכית שטופלה מראש והשרו אותה במים מזוקקים למשך 5 שניות.
12. הסר את מגלשת הזכוכית שטופלה מראש והפוך אותה לעמוד זקופה. השתמש בנייר סינון כדי לספוג טיפות מים על פני השקופית, והימנע מלגעת באזור הדגימה.
13. טבלו את מגלשת הזכוכית שטופלה מראש במאגר הליזיס והגיבו במדויק למשך 20 דקות.
14. טבלו את השברים שטופלו מראש בתמיסת הכביסה למשך 3 דקות כדי לשטוף את תמיסת הליזה.
15. הסר את שקופית הזכוכית שטופלה מראש וטבל אותה בתמיסת אתנול של 70% למשך 2 דקות.
16. הסר את שקופית הזכוכית שטופלה מראש וטבל אותה בתמיסת אתנול 90% למשך 2 דקות.
17. הסר את שקופית הזכוכית שטופלה מראש וטבל אותה בתמיסת אתנול נטולת מים למשך 2 דקות.
18. הסר את מגלשת הזכוכית שטופלה מראש ותן לה להתייבש באוויר באופן טבעי.
19. הכינו את תמיסת הכתמים של רייט A ואת תמיסה B בבקבוק ריק חום ביחס של 1:1.
20. הנח את שקופית הזכוכית שטופלה מראש בצורה אופקית והוסף את תמיסת הצבע המעורב על השקופית, וודא שתמיסת הצבע מכסה את כל השקופית (כ-0.5-1 מ"ל תמיסת צבע).
21. לאחר צביעה למשך 5 דקות, יש לשטוף בעדינות את שקופית הויטראז' במים מזוקקים 10-15 פעמים כדי להסיר עודפי חומר מכתים.
22. הניחו לזכוכית להתייבש באופן טבעי והתבוננו בה תחת מיקרוסקופ אופטי בגובה 400×. ספרו יותר מ-200 זרע וקבעו את אחוז הזרע החריג עם טבעות הילה קטנות, ללא טבעות הילה וניוון.

8. ניתוח סטטיסטי

1. לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה זמינה מסחרית.
2. השווה את ה-DFI (%) בין זרע מקורי, DGC ו-UHS באמצעות מבחן פרידמן.
   הערה: להשוואה זוגית של שתי שיטות, השתמש במבחן הדירוג החתום של Wilcoxon. קחו בחשבון ערך p ≤ 0.05 כמובהקות סטטיסטית.

שיטות UHS ו-DGC שימשו כדי לייעל את הטיפול ב-21 דגימות ולהשוות את מדד פיצול ה-DNA של הזרע בין שתי השיטות. השיטה המשתמשת במסלול UHS בצלחת ICSI יכולה להחליף את DGC, מה שעלול לגרום נזק לזרע. זרע איכותי עם תנועתיות פרוגרסיבית טובה שוחה בצורה חלקה לאורך קצה המסלול בצורת U (איור 2), מה שמקל על מחט ה-ICSI לתפוס אותם בנפרד. לזרע האיכותי המבודד באמצעות מסלול UHS יש DFI נמוך יותר (איור 3).

כדי להפיק את הנתונים המוצגים באיור 3, זוהה DFI של זרע איכותי שהופרד בשיטות DGC ו-UHS בשיטת פיזור כרומטין זרע (SCD). התוצאות הראו כי ה-DFI של זרע איכותי שהופרד על ידי DGC היה גבוה עד 5.5% ±-3.2%, בעוד שה-DFI של זרע איכותי שהופרד בשיטת UHS היה 1.7% ±-1.1% (P < 0.05) (טבלה 1).

איור 1: לוח הפעלה ICSI מוכן מראש. משמאל יש נתיב זרע בצורת U, עם טיפה עגולה בהתחלה להוספת זרע. שתי טיפות חיץ ממוקמות בנתיב השמאלי כדי לסנן זרע לא זז, פסולת תאים וזיהומים צמיגים. באמצע, יש רצועה ארוכה של PVP המשמשת לקיבוע זרע. בצד ימין, שש טיפות בינוניות לעיבוד ביציות מסודרות ברצף המשמש לשחרור ביציות ופעולות ניקוב ICSI. (A) תרשים סכמטי. (ב) השקפה מציאותית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: השוואה בין תמונות של טיפות חיץ וקצה המסלול הימני של נתיבים בצורת U. (A) טיפות חיץ מכילות כמות גדולה של תאים עגולים, זרע לא נייד, פסולת תאים, זיהומים וכו', מהזרע. (B) זרע איכותי מתפזר ושוחה קדימה בקצה הימני של מסלול UHS, מה שמקל על שאיבת מחט ICSI. הגדלה: פי 200. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תמונות מייצגות מבדיקת SCD של זרע באיכות גבוהה שהושגו על ידי DGC או UHS. (A) שקופית בדיקת SCD שעובדה באמצעות DGC, המציגה תאי זרע מקוטעים עם הילה מינימלית או ללא הילה כלל. תאי הזרע הנותרים מציגים הילות גדולות של DNA מפוזר, מה שמעיד על היעדר פיצול. (B) שקופית בדיקת SCD שעובדה בשיטת UHS, המדגימה תאי זרע לא מקוטעים עם הילות גדולות של דנ"א מפוזר. הגדלה: פי 100. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: מידע כללי על אוכלוסיית המחקר (n=21).

השלב המרכזי בהפרדת זרע איכותי בשיטת UHS המתוארת במאמר זה הוא הקמת נתיב UHS עם טיפות חיץ. גם נתיב UHS וגם טיפות החיץ נוצרים באמצעות זרע שטוף והתקבל. נתיב UHS מנחה זרע איכותי לשחות בחופשיות ולהצטבר לאורך קצה המסלול, מה שמקל על איסוףו. טיפות החיץ מפחיתות את צמיגות הזרע, מסננות זרע מת, פסולת תאים וזיהומים אחרים. יש למזער את המרחק בין הצד הימני של נתיב UHS לרצועת ה-PVP המקבילה כדי להפחית את הזמן הנדרש לכל תנועת מחט ה-ICSI.

בהשוואה לשיטת שיפוע הצפיפות הלא רציפה, שיטת נתיב UHS כוללת פחות שלבי הפעלה ידניים עבור אנשי מעבדה, מה שעוזר להפחית את עוצמת העבודה שלהם. זרע איכותי המתקבל בשיטת נתיב UHS אינו עובר הליכי צנטריפוגה חוזרים ונשנים, וכתוצאה מכך DFI נמוך יותר. זה תורם יותר להפריה, תוצאות הריון ובטיחות הצאצאים¹³.

המגבלה העיקרית של הפרוטוקול המוצג כאן היא הסתמכותו הגבוהה על יכולת השחייה העצמית של זרע איכותי. שיטה זו אינה מתאימה לחולים עם זרע לא נייד לחלוטין. במקרים של אסתנוזוספרמיה קיצונית או אוליגוזוספרמיה קיצונית, שבה יש פחות זרע איכותי שיכול לשחות למסלול הנכון, זמן החיפוש אחר זרע איכותי עשוי להתארך. לפעמים, ייתכן שיהיה צורך לחפש זרע באיכות גבוהה מהמסלול השמאלי או טיפת החיץ. זרע מת, פסולת תאים וזיהומים צמיגים באזורים אלה עלולים לגרום לחסימה של מחט ה-ICSI, ובכך להאריך את כל הליך ה-ICSI ועלול להשפיע על שיעורי ההפריה.

השיטה המוצגת כאן אומצה מהמחקר המקורי של Baldini et ^al.7, שהתמקד בנדידת זרע אופקית בכלי הזרקה. בגישת Baldini et al., שלוש טיפות המחוברות על ידי מדיום תרבית קטן הקלו על נדידת הזרע האופקית מהטיפה הראשונה (שבה מוסיפים את הזרע) לטיפה השלישית (שם נשאב הזרע), עם שני גשרים המחברים בין הטיפות. עם זאת, בגישה זו, בשל המרחק הקטן שעליו נודדים זרעים איכותיים, הם עדיין לא הופרדו לחלוטין ממרכיבים אחרים בזרע. זרע או זיהומים צמיגים, במיוחד, עלולים לגרום להידבקות או חסימה של מחט ICSI, מה שמוביל לכשל בפעולת ICSI.

זרע נע עם DNA שלם מציג את המאפיין של תיגמוטקסיס, כלומר הם נוטים לשחות ליד קירות גבול¹⁴. מחקר אחר מצא כי תיגמוטקסיס משפיע באופן משמעותי על איכות הזרע המופרד¹⁵. בהתבסס על ממצאי המחקר הללו, תיגמוטקסיס ממלא תפקיד מכריע בהפרדת הזרע. למסלול בצורת U בשיטה זו יש גבול ארוך יותר, המאפשר תנועה חופשית של זרע איכותי, ומאפשר הפרדתם המוחלטת מזרע לא נייד, זיהומים ורכיבים אחרים. יתר על כן, זרע איכותי מצטבר בשולי המסלול, מה שמקל על האחיזה והתמרון במהלך הליך ה-ICSI.

לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בנתיב UHS בצלחת ICSI להפרדת זרע באיכות גבוהה. ההליך דורש פחות שלבים ידניים מכוח האדם, וכתוצאה מכך DFI נמוך של הזרע המופרד. שיטה זו מתאימה היטב לקידום ויישום במעבדות הפריה חוץ גופית .

למחברים אין מה לחשוף.

ללא.