本协议的总体目标是提供详细的指导，以便使用微型 E1A2 来评估全球 mRNA 拼接变化。这是一个快速、廉价和简单的工具，用于评估目标蛋白在替代拼接调节中的功能，而无需特殊制度或实验室条件。首先培养具有稳定表达兴趣基因的 HEK 293 细胞。
使用0.25%的EDTA将细胞分割，然后在6井板中每井镀30万个细胞，在37摄氏度的5%二氧化碳中孵育24小时。24 小时后，检查汇合，并在 70 到 80% 汇合时转染 HEK 293 稳定细胞。用移液器小心地去除细胞培养介质，然后加入两毫升完整的DMEM介质，不含抗生素，并将板放回孵化器中。
用透射缓冲器准备一根管子，然后加入两微克pMTE1A DNA、涡流，并加入两微升转染试剂。再次漩涡，在室温下孵育10分钟。从孵化器中取出板，小心地加入转染混合物。
转染后六小时，将四环素添加到 HEK 293 稳定细胞中，用于 Nek4 表达感应。转染后24小时，使用荧光显微镜验证细胞形态和转染效率。使用移液器去除细胞培养介质，然后使用化疗添加细胞培养介质。
再孵育细胞24小时。要收集RNA，丢弃细胞培养基，并直接向井中加入0.5至1毫升RNA提取试剂。如果油井非常汇合，请使用一毫升RNA提取试剂来改善RNA质量。
用移液器使细胞同质化，并将其转移到1.5毫升离心机管中。立即进行RNA提取，或将样品储存在零下80摄氏度。将样品解冻在烟气罩中，在室温下孵育五分钟。
加入0.1至0.2毫升氯仿，大力搅拌，然后在室温下孵育3分钟。离心机在12，000倍G和4摄氏度下15分钟，然后收集上水相并转移到一个新的1.5毫升离心机管。收集约60%的总体积，但不收集DNA或有机相。
加入0.25至0.5毫升的等丙醇，通过倒置四次搅拌样品。在室温下孵育10分钟，然后在12，000次G下离心，在4摄氏度下孵化10分钟，并丢弃超高纳特。用乙醇清洗RNA颗粒两次，离心机用7，500次G清洗5分钟，然后丢弃乙醇。
将多余的乙醇倒置在纸巾上，然后将管子放在烟罩内打开，将颗粒部分干燥5至10分钟。将RNA颗粒重新悬浮在DEPC处理水的15微升中。通过测量 230、260 和 280 纳米的吸收量来量化总RNA 并验证 RNA 质量。
为了验证RNA总质量，使用2.5%的次氯酸钠溶液的1.2%预处理1%的玫瑰凝胶，持续30分钟。使用总RNA的一到两微克执行 cDNA 合成。将RNA、一个寡头d-T微升、一个DNTP微升和无核酸酶水组合到12微升。
在65摄氏度的温度下，在热循环器中孵化反应5分钟。从热循环器中取出样品，加入四个反转录酶缓冲器的微升、DTT 的两个微升和核素酶抑制剂的一个微升。在37摄氏度下孵育两分钟。
加入一微升热稳定反转录酶，在37摄氏度下孵育50分钟。在 70 摄氏度下灭活酶 15 分钟。执行文本手稿中描述的 PCR，然后将 PCR 产品的 20 到 25 微升加载到含有核酸污渍的 3%玫瑰凝胶上，然后以 100 伏特的速度运行约一小时。
拍摄凝胶，避免任何带饱和，并使用图像处理软件量化带。631、493 和 156 基对的波段分别对应于 13S、12S 和 9S 等同形。从软件的文件菜单，打开图像文件，并将其转换为灰色刻度。
调整亮度和对比度，必要时消除离群值噪声。使用矩形选择工具在第一车道周围绘制矩形，然后通过分析、凝胶和选择第一车道命令或使用键盘快捷方式选择它。使用鼠标单击并按住第一车道上的矩形中间，然后将其拖至下一条车道。
去分析，凝胶，并选择下一个车道。对于所有剩余车道重复此步骤。在突出显示和编号所有车道后，请前往分析、凝胶和情节车道，绘制每个车道的轮廓图。
使用直线选择工具绘制一条线穿过每个峰值的基座，对应于每个波段，排除背景噪声。在关闭所有车道的峰值后，选择魔杖工具并单击每个峰值内。每个高亮峰值的结果窗口中应弹出测量结果窗口。
仅考虑 13S、12S 和 9S 峰值，对应于 631、493 和 156 基对频段。复制电子表格编辑器的强度数据，并汇总每个样本的所有三个频段的强度，然后计算每个等形体相对于总数的百分比。绘制每个等形的百分比，或相对于未经处理的样本的百分比差异。
含有E1A微基因的质粒用于通过评估每个同位素产生的mRNA比例来观察对替代拼接的影响。E1A 等形变异的基础表达取决于 E1A 表达的细胞线和时间。HEK 293 稳定细胞系（HEK 293 重组包含站点）与 HeLa 细胞相比显示较高的 13S 表达，但在 E1A 表达 48 小时后显示类似级别的 13S 和 12S 等形。
暴露在顺铂下的细胞显示，5个优质S-S拼接选择的转变有利于12S表达。这种效果在 HEK 293 中观察到稳定地表示旗空矢量，以及 Nek4 中的等形之一。在帕利塔塞尔治疗后，替代拼接的变化是非常谨慎的，但变化的方向在旗和Nek4表达细胞相反。
执行此协议时，使用未翻译和非反向转录酶控制以避免对内源性 E1A 表达的误解非常重要，主要是在使用 HEK 293 细胞时。获得阳性结果后，可以评估与化疗反应相关的特定基因的替代拼接。观察到某些效果后，这种简单的协议可以引导这些研究获得更一致的通路，例如，蛋白质在调节化疗反应中的替代拼接方面发挥作用。
