Nuestra investigación se centra en la aplicación de la cromatografía por espectrometría de masas en el campo de los ácidos nucleicos, las proteínas peptídicas y el CDT. El desafío de este experimento radica en la separación de múltiples componentes de LNP y la determinación de componentes con concentraciones significativamente diferentes y problemas residuales. La ventaja de este protocolo es que logra una buena separación, un amplio rango lineal y una determinación actual de LNP a un bajo costo.
Para empezar, configure un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento, o HPLC, junto con un detector de dispersión de luz evaporativa. Instale la columna cromatográfica siguiendo la dirección de la flecha en la columna. Conecte un extremo a la salida del muestreador automático y el otro a la entrada del detector de dispersión de luz evaporativa.
Para preparar la fase A, mida y transfiera con precisión 1.387 microlitros de trietilamina y disuélvala en 1000 mililitros de agua. Mezcle bien y ajuste el pH a siete con ácido acético. Para preparar la Fase B, disuelva 1.387 microlitros de trietilamina en 1000 mililitros de metanol.
Mezclar bien y ajustar el pH a siete con ácido acético. Coloque la fase A y la fase B en la bandeja. Inicie el software LabSolutions y abra la ventana de análisis en tiempo real.
Haga clic en Archivo y seleccione Nuevo para crear un nuevo archivo de método, modifique el tiempo de parada de la cromatografía líquida a 15 minutos y haga clic en Aplicar a todo el tiempo de adquisición. A continuación, haga clic en Bomba y modifique los parámetros de la bomba. Seleccione el modo de análisis como gradiente binario de alta presión, o BGE, y ajuste el caudal a un mililitro por minuto.
Ajuste la concentración inicial de la bomba B al 80%Modifique el gradiente de fase móvil a tres minutos a 80%a cuatro minutos a 85%de 5.5 a 12 minutos al 100%y a 12.1 minutos, deje que la bomba regrese al 80%Ahora haga clic en Horno de columna y ajuste la temperatura del horno a 55 grados centígrados. Luego haga clic en ELSD para modificar la temperatura del tubo de deriva a 40 grados Celsius y guarde el método. Haga clic en Descargar y poner en marcha para iniciar y equilibrar el instrumento.
Pesa con precisión 10 miligramos de cada una de las cuatro sustancias estándar del componente de nanopartículas lipídicas por separado. Disuelva cada uno en un mililitro de metanol y vórtice hasta que se disuelva por completo para obtener soluciones madre con una concentración de 10 miligramos por mililitro para cada componente. Con una pipeta, transfiera con precisión 100 microlitros de cada solución madre a un vial de muestra.
Agregue 600 microlitros de metanol y mezcle bien para preparar una solución intermedia mezclada, una con una concentración de 1000 microgramos por mililitro. Ahora, transfiera con precisión 20 microlitros de cada solución madre a un vial de muestra. Agregue 920 microlitros de metanol y mezcle bien para preparar una solución intermedia mezclada dos con una concentración de 200 microgramos por mililitro.
Prepare una serie de soluciones patrón a diferentes concentraciones por dilución en serie. A continuación, con una pipeta, transfiera con precisión 100 microlitros de la muestra a un vial de muestra. A continuación, añada 900 microlitros de metanol y mezcle bien para asegurar una dilución diez veces mayor de las nanopartículas lipídicas y su disociación del fármaco de ácido nucleico.
Coloque las soluciones estándar y las soluciones de muestra en el muestreador automático del cromatógrafo de líquidos. Haga clic en lote en tiempo real en la barra de herramientas del asistente de la ventana de análisis en tiempo real. A continuación, haga clic en Nuevo en el menú Archivo para crear una nueva tabla de lotes.
En la tabla de lotes, introduzca el número de vial, el nombre de la bandeja, el archivo de datos y el volumen de inyección de las soluciones estándar y de muestra. Seleccione el archivo de método guardado y haga clic en guardar archivo por lotes en el menú Archivo. Espere hasta que la presión del cromatógrafo líquido y la línea de base del cromatograma sean estables.
A continuación, haga clic en iniciar lote en tiempo real en la barra de herramientas del asistente para iniciar la adquisición de datos. Para el análisis de datos, abra la ventana del navegador del software LabSolutions. Arrastre los datos de la solución estándar a la vista de resultados cuantitativos para establecer una curva de calibración.
Modifique los parámetros de procesamiento de datos haciendo clic en Editar en la vista de métodos. En la ventana de parámetros de integración, cambie el algoritmo de integración a I-PeakFinder y establezca el tipo de línea base en Base a Base. A continuación, en los parámetros de identificación, cambie el método de identificación a banda y establezca el ancho de banda predeterminado en 0,1 minutos.
Para modificar los parámetros cuantitativos, cambie el método cuantitativo a un estándar externo. Establezca el número de niveles de calibración en siete. A continuación, seleccione el tipo de curva de calibración como exponencialmente y modifique la configuración del compuesto.
Introduzca los nombres y las concentraciones de solución estándar de los cuatro componentes de las nanopartículas lipídicas. Haga doble clic en el vértice máximo para actualizar los tiempos de retención. Haga clic en Ver para completar la modificación de los parámetros de procesamiento de datos.
Ahora, modifique el tipo de muestra en la vista de resultados cuantitativos a punto de cálculo estándar. Ajuste los niveles de la solución estándar de uno a siete según las concentraciones. Una vez establecidas las curvas de calibración, haga clic en Archivo en la barra de menú y Guarde el archivo de método.
Arrastre los datos de muestra a la vista de resultados cuantitativos de la ventana del navegador. Observe los resultados de concentración mostrados de los cuatro componentes de nanopartículas lipídicas en las muestras. El análisis de la solución estándar de LNP logró una separación de línea base con un grado de separación mayor que 1.5 para los cuatro componentes, y no se observaron residuos en soluciones estándar de alta concentración.
La curva de calibración para los cuatro componentes exhibió coeficientes de correlación superiores a 0,999 dentro del rango de concentración de cinco a 250 microgramos por mililitro, lo que indica una excelente linealidad. El método mostró una alta reproducibilidad, con una desviación estándar relativa para un tiempo de retención de menos del 0,1% y una desviación estándar relativa para el área del pico de menos del 2% sobre la base de seis inyecciones repetidas de solución estándar de 10 microgramos por mililitro. El análisis de muestras reales de LNP diluidas 10 veces con metanol mostró concentraciones de componentes que oscilaban entre 150 microgramos por mililitro y 1.500 microgramos por mililitro, logrando una separación y sensibilidad consistentemente altas en múltiples fabricantes.
