Este protocolo proporciona un método preciso y reproducible para cuantificar diez clases de lípidos diferentes de Saccharomyces cerevisiae utilizando un único método de extracción y un único método LC-MS. Este método permite la detección y cuantificación de especies isóbricas y lípidos isoméricas que tienen diferentes propiedades químicas y físicas. Para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae, añada primero 5 ml de solución estéril de 20% de glucosa en cada uno de los dos matraces Erlenmeyer que contengan un medio YNB estéril a una concentración final de 2% de glucosa.
Luego, utilice una pipeta estéril para transferir un volumen de un cultivo de levadura durante la noche que contenga cinco veces diez a las séptimas células de levadura en cada matraz y los matraces durante al menos 24 horas a 30 grados celsius con temblor rotacional a 200 revoluciones por minuto. Para la extracción de lípidos, determinar el número total de células de levadura por mililitro de cultivo y transferir cinco veces diez a las células séptimas en un tubo de centrífuga de 15 ml. Añadir agua nano-pura helada para llevar el volumen total hasta 15 ml y recoger las células por centrifugación.
Re-suspenda el pellet de levadura en 15 ml de tampón de bicarbonato de amonio iso-tonico helado para una segunda centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 1,5 ml de solución fresca de bicarbonato de amonio frío en frío. Al final de la centrifugación, almacene el pellet a 80 grados centígrados hasta la extracción. Para comenzar la extracción de lípidos, descongele el pellet celular sobre hielo antes de volver a suspender las células en 200 microlitros de agua nano-pura helada helada.
En una campana de humo, transfiera la suspensión celular a un vidrio de alta resistencia de 15 ml, atornille el tubo de centrífuga superior con una tapa forrada de politetrafluoroetileno y añada 25 microlitros de una mezcla interna de estándares de lípidos, preparado en metanol cloroformo 2:1. 100 microlitros de 425 a 600 perlas de vidrio lavado con ácido micromolar y 600 microlitros de un metanol cloroformo 17:1 al tubo. Vórtice el tubo a alta velocidad durante cinco minutos a temperatura ambiente para interrumpir las células.
Seguido de vórtices durante una hora a baja velocidad a temperatura ambiente para facilitar la extracción de lípidos. Al final de la extracción, incubar la muestra durante 15 minutos sobre hielo, para promover la precipitación proteica y la separación de las fases acuosas y orgánicas. Al final de la incubación, centrifuga la muestra para separar aún más la fase acuosa superior de la fase orgánica inferior y, en la campana de humos, utilice una pipeta de vidrio de borosilicato para transferir la fase orgánica inferior a un nuevo tubo centrífugo superior de tornillo de vidrio de alta resistencia de 15 ml con una tapa forrada de politetrafluoroetileno.
Coloque la fase orgánica inferior bajo el flujo de gas nitrógeno y, en la campana de humo, agregue 300 microlitros de una mezcla de metanol cloroformo 2:1 a la fase acuosa superior restante. Para facilitar el fosfatácido, fosfatidilserina, fosfatidilinositol y vórtice de extracción de cardiolípidos el tubo vigorosamente durante cinco minutos a temperatura ambiente antes de centrifugular la muestra. Utilice una pipeta de vidrio de borosilicato para transferir la fase orgánica inferior a la fase orgánica inferior bajo nitrógeno y evaporar el disolvente en las fases orgánicas combinadas en la campana de humo.
Luego, cierre los tubos de la película lipídica bajo el flujo de gas nitrógeno y almacene las muestras a 80 grados centígrados. Para la cromatografía líquida, la separación de los lípidos extraídos a 500 microlitros de una mezcla de agua nano-pura de aceto-nitrilo-2-propanol 63:35:5 a temperatura ambiente. Somete el contenido del tubo a una sonicación ultrasónica durante 15 minutos antes de vórtice del tubo tres veces durante diez segundos por vórtice como acaba de demostrar.
Transfiera 100 microlitros de la muestra a un vial de vidrio con un inserto utilizado para una placa de 24 pozos y elimine cualquier burbuja dentro de la plaquita. Coloque la plaquita en un pozo de una placa de 24 pozos y cargue una CSH de fase inversa C18 acoplada a una precolumna en el sistema de cromatografía líquida. Ajuste la temperatura de la columna a 55 grados centígrados y el flujo a 300 microlitros por minuto.
Una vez establecidos todos los parámetros, cargue diez microlitros de una extracción en blanco antes de cargar la primera muestra. Luego, separe las diferentes especies de lípidos utilizando el gradiente de cromatografía líquida, como se indica. Se generará un cromatograma iónico total representativo a partir de los datos LC-MS para los lípidos extraídos de las células.
Para el análisis espectrométrico de masas de los lípidos extraídos, cargue las muestras en un espectrómetro de masas equipado con una fuente de iones de ionización electropersión calentada y establezca los parámetros de análisis como se describe en la tabla. Utilice Fourier Transform Analyzer para detectar iones padres MS-1 con una resolución de 60.000 y dentro del rango de masa de 150-2000 daltons. A continuación, detecte los iones secundarios MS-2 utilizando los ajustes indicados en la tabla.
Para identificar y cuantificar diferentes lípidos de archivos LC-MS en tándem amplio, busque archivos sin procesar LC-MS que contengan datos MS-1 de exploración completa y datos MS-2 dependientes de datos para obtener ácidos grasos libres y noterificados, cardio-lípido, fitocerimida, fitofinoceno, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidlglicecerol, fosfatidlinositol, fosfatididlserina y triacylglycerol clases de lípidos utilizando una masa dividida por tolerancia de carga de cinco partes por millón para los iones precursores y diez partes por millón para los ions del producto. A continuación, siga las instrucciones proporcionadas en el manual del usuario del software para identificar las normas internas de lípidos y las especies de lípidos con composiciones inusuales de ácidos grasos. Este método lc-MS en tándem sensible permite la identificación y cuantificación de especies moleculares de lípidos a concentraciones tan bajas como 0,165 picomolares por microlitro.
Este límite de cuantificación difiere de las diferentes clases de lípidos dentro de una amplia gama de concentraciones. Este método se puede utilizar para aumentar la eficiencia de la ionización de lípidos mediante el uso de aditivos de fase móvil alternativos para la espectrometría de masas de ionización de electrospray. Cada uno de estos aditivos de fase móvil alternativos se puede utilizar tanto para las columnas LC de fase normal como de fase inversa.
El método de disociación inducida por colisión es beneficioso si se utiliza en combinación con el aditivo de fase móvil de acetato de amonio para el modo negativo de ionización electro-aspersión de espectrometría de masas, ya que, en estas condiciones, permite el aumento de la eficiencia de la fragmentación de iones lipídicos MS-1 en productos MS-2. Por el contrario, el método de disociación colisión de alta energía es favorable si se utiliza en combinación con el aditivo de fase móvil de formato de amonio para el modo positivo de espectrometría de masas de ionización electro-spray, ya que en estas condiciones, permite un aumento en la eficiencia de la fragmentación de iones lipídicos MS-1 en productos MS-2. No mezcle las fases mientras recoge la fase orgánica.
Cierre los tubos bajo el flujo de gas nitrógeno. Elimine cualquier burbuja dentro de la plaquita y conecte la columna en la dirección correcta. Si LC-MS no puede determinar la identidad de cualquier pico, se puede utilizar MS-NMR para deducir la estructura de esa molécula.
