La preparación de muestras compatibles con espectrometría de masas de alta calidad para el análisis integral de proteomas de muestras oculares es fundamental para dilucidar los mecanismos moleculares y las vías de señalización implicadas en la salud y las enfermedades. El flujo de trabajo descrito representa un enfoque simple pero robusto para los estrictos pasos de preparación de muestras atendidos específicamente para el análisis de muestras limitadas en masa, como micro vasos sanguíneos oculares. Aunque el objetivo principal del estudio es establecer una metodología compatible con la MS para los vasos sanguíneos oculares, el flujo de trabajo descrito se puede aplicar ampliamente a varias muestras basadas en células y tejidos.
Generalmente, los individuos nuevos en este método pueden tener problemas porque la identificación y el aislamiento de la arteria ciliar posterior corta elegida, o ramas SPCA, pueden ser desafiantes. Los ojos porcinos frescos, junto con el nervio óptico y los tejidos extraoculares, se obtuvieron del matadero local inmediatamente post-mortem. Coloque el globo ocular en una cámara de disección que contenga el amortiguador Krebs-Henseleit helado.
Corta cuidadosamente los músculos y los tejidos circundantes con un par de tijeras de Mayo afiladas. Haz una incisión con un bisturí y corta el globo a lo largo del plano ecuatorial con un par de tijeras de Mayo afiladas hasta que el ojo se separe en las mitades anterior y posterior. Retire tanto cuerpo vítreo como sea posible de la mitad posterior del ojo usando un par de fórceps de patrón estándar.
Después de usar pasadores de disección para fijar cuidadosamente la mitad posterior del ojo, corte suavemente los tejidos conectivos que rodean el nervio óptico, para exponer la vasculatura retrobulbar subyacente con un par de tijeras de primavera Vannas estudiante. Aísle la arteria ciliar posterior corta paraóptica y distal junto con los tejidos conectivos circundantes con un par de pinzas de precisión tipo cinco y tijeras de capsulotomía Vannas. Retire suavemente los tejidos conectivos de los segmentos arteriales utilizando pinzas y tijeras con puntas extra finas antes de enjuagar las arterias aisladas en PBS helada para eliminar contaminantes y residuos de sangre.
Las arterias de la piscina de dos ojos para obtener una réplica biológica, luego pesan las muestras usando un equilibrio analítico. A cada tubo, agregue una mezcla de cuentas de óxido de circonio de 0,5 y un milímetro seguida de un reactivo de extracción de proteína tisular. Ahora, cargue los tubos de muestra en un homogeneizador de licuadora.
Ajuste el temporizador a dos minutos, establezca el nivel de velocidad en seis e inicie la homogeneización. Después de ejecutar, compruebe si las muestras son de homogeneización completa y mantenga las muestras sobre hielo entre cada carrera. Repita el ciclo hasta que las muestras estén completamente homogeneizadas.
Pipeta con cuidado homogeneizar en tubos de microcentrífugas frescas. Centrifugar las muestras a 10.000 veces G durante 20 minutos a cuatro grados Celsius para peletizar proteínas insolubles. Pipetear cuidadosamente el sobrenadante que contiene las proteínas solubles sin tocar la capa de pellets, y transferirlos a tubos de microcentrífuga fresca.
Añadir 200 microlitros de Extraction Buffer 2A y cinco microlitros de cóctel inhibidor de la proteasa a cada muestra de pellet. A continuación, suspenda el pellet varias veces con una pipeta. Utilice un homogeneizador ultrasónico para homogeneizar completamente el pellet.
Establezca la amplitud en 60 y circule a uno. Utilice una sonda de titanio, que sea adecuada para la homogeneización de muestras con volúmenes pequeños. Sumerja la sonda en la mezcla de pellets y tampón de extracción sobre hielo y pulse el botón de inicio.
Sonicar la muestra hasta que los grumos de pellets estén completamente homogeneizados, haciendo una pausa durante unos segundos entre cada sonicación. Compruebe visualmente si hay una homogeneización completa. Mezclar el homogeneizar varias veces con una pipeta para asegurarse de que no haya grumos.
Utilice dispositivos de filtro centrífugo con límite de tres kilodalton para este procedimiento. Inserte la unidad de filtro de corte de tres kilos de kilocilton en un tubo de microcentrífuga. Pipetear 200 microlitros de muestra homogeneizar a un dispositivo de filtro, y añadir 200 microlitros de agua desionizada en el mismo filtro.
Después de taparlo de forma segura, coloque la unidad de filtro en una centrífuga y gire durante 14.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, separe la unidad de filtro que contiene el concentrado de muestra del tubo de microcentrífuga que contiene el filtrado, descartando el filtrado. Reconstituir el concentrado añadiendo 400 microlitros de agua desionizada en la unidad de filtro.
Después de repetir la filtración tres veces, pipetee cuidadosamente el concentrado de muestra limpia en un microtubo limpio. Prepare las muestras para la electroforesis de gel unidimensional como se indica en el protocolo de texto, y mezcle bien con una pipeta. Caliente las muestras a 70 grados centígrados en un calentador de bloque seco durante 15 minutos y enfríe a temperatura ambiente.
Cargue cuidadosamente 50 microgramos de muestra por carril utilizando una pipeta, así como el estándar de proteína prestenido como marcador de masa molecular. Ejecute los geles durante aproximadamente 60 minutos a una tensión constante de 175 voltios. Al final de la carrera, retire cuidadosamente el gel de la placa de casete con un cuchillo de gel y transfiera el gel a una caja de tinción de gel.
Realice la fijación y tinción del gel como se describe en el protocolo de texto. Agitar los geles en la solución de tinción durante la noche para obtener los mejores resultados generales. Decantar cuidadosamente la solución de tinción y sustituir con 200 mililitros de agua desionizada antes de agitar los geles durante al menos siete a ocho horas en agua para limpiar el fondo.
Exémoda de las bandas proteicas del gel con nuevas cuchillas de microtomo limpias. Corte la banda en trozos pequeños y transfiera cuidadosamente las piezas de gel en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Añadir 500 microlitros de solución de detención que contengan bicarbonato de amonio y acetonitrilo de 100 mililitros.
Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos, con agitación ocasional. Pipetee cuidadosamente la solución de detención. Compruebe visualmente si hay tubos con mancha residual y repita este paso si las piezas de gel todavía están manchadas de azul.
Añadir aproximadamente 400 microlitros de solución de TDT recién preparada e incubar a 56 grados centígrados durante 30 minutos. Después de desechar la solución reductora con una pipeta, agregue aproximadamente 400 microlitros de solución IAA recién preparada e incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Retire el tampón alquilante con una pipeta y deseche.
Agregue 500 microlitros de acetonitrilo limpio a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos, hasta que las piezas de gel se encojan y se vuelvan opacas. Pipetear el acetonitrilo y secar al aire las piezas de gel durante cinco a 10 minutos bajo el capó. A continuación, pipetear 50 microlitros de solución de trippsina en cada tubo para cubrir completamente las piezas de gel, e incubar los tubos a cuatro grados centígrados.
Después de 30 minutos, agregue suficiente volumen de tampón de trippsina para cubrir completamente las piezas de gel si es necesario. Incubar las muestras durante la noche a 37 grados centígrados. Para realizar la extracción de péptidos, pipetee cuidadosamente la solución de péptido extraída de los tubos y transfiera a microtubos limpios.
Seque el sobrenadante en un evaporador de vacío centrífugo. Añadir 100 microlitros de tampón de extracción a cada tubo con piezas de gel, e incubar durante 30 minutos con agitación. Pipetear el sobrenadante en los mismos microtubos que contienen los péptidos extraídos según sus respectivas bandas, y secar en una centrífuga de vacío.
Proceder a la purificación de péptidos y análisis de iones de electrospray de cromatografía y electrospray MS/MS descritos en el protocolo de texto. La cantidad total de proteínas en muestras extraídas con cada tipo de detergente se representa aquí. El mayor rendimiento provino de los tejidos extraídos con tampón de extracción de proteína tisular, seguido de DDM, CHAPS, ASB-14 y el rendimiento más bajo de ACN y TFA.
Consistentemente, las proteínas totales identificadas también fueron las más altas en la muestra extraída del tampón de extracción de proteínas tisulares, y siguieron la misma tendencia que el rendimiento total. Aquí se muestra la comparación de los perfiles de proteína de electroforesis de gel de una dimensión de SPCA, antes y después de ser sometido a los pasos optimizados de preparación y limpieza de la muestra. En general, se observó un alto grado de frotis y una separación deficiente de las bandas proteicas en el carril tres.
Este perfil demuestra que las muestras pueden contener reactivo de extracción, y también contaminantes como lípidos y desechos celulares. Sin embargo, las muestras de SPCA que fueron separadas en sobrenadantes y pellets, y luego sometidas al protocolo optimizado, dieron lugar a perfiles ejemplares de electroforesis de gel unidimensional. El método optimizado para la extracción rápida, robusta y eficiente de proteínas de microvajillones oculares también se puede aplicar fácilmente a otras muestras a base de tejido.
Aquí se muestran perfiles proteicos del sobrenadante y el pellet de muestras de cerebro murino y tejido cardíaco. Al intentar este procedimiento, es importante recordar someter las muestras a una homogeneización completa, separar el sobrenadante del pellet y eliminar los contaminantes y los reactivos de extracción. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la oftalmología experimental y traslacional exploraran a fondo el proteoma de la vasculatura oscular utilizando los ojos porcinos como modelo.
