Name: post column derivatization using reaction flow high performance liquid chromatography columns
Uploaded: 2016-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
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This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Precaución: Por favor, consulte las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) para todos los materiales y reactivos antes de su uso (es decir, Pedidos de metanol). Asegurar el uso de todas las prácticas apropiadas de seguridad al manipular disolventes y cromatografía líquida de eluyente alta resolución (HPLC). Asegurar el uso apropiado de los controles de ingeniería de HPLC, balanza analítica y un detector de instrumentación, y asegurar el uso de equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos y zapatos cerrados). Nota: Este protocolo describe 3 métodos de flujo de reacción de derivatización post-columna (RF-PCD) técnicas, cada uno con un reactivo diferente específica a la naturaleza de un compuesto químico de interés. Para el análisis de ROS vaya a la sección &quot;1. La detección de ROS mediante DPPH •&quot;, para el análisis de aminas primarias véase la sección &quot;2. Detección de aminas primarias usando fluorescamina&quot;, y para el análisis de compuestos fenólicos vaya a la sección &quot;3 . La detección de fenolesutilizando 4-aminoantipireno y ferricianuro de potasio &quot;. Use agua ultra pura (por ejemplo, agua Milli-Q) en todas partes. Nota: La conexión de la columna de RF se consigue en casi la misma forma que una columna de HPLC convencional con la principal diferencia es el número de accesorios de los extremos en una columna de RF. Accesorios utilizados para conectar una columna de HPLC estándar para el sistema de HPLC son capaces de ser utilizado para conectar una columna de RF al sistema de HPLC. 1. Detección de ROS Utilizando DPPH • <ol><li> Puesta en marcha de instrumento de HPLC <ol><li> Preparación del instrumento HPLC con 100% de agua en la línea A y 100% de metanol en la línea B como la fase móvil. Purgar las bombas de acuerdo con los requisitos del fabricante. </li><li> Configurar los componentes instrumentales de HPLC y la bomba de derivatización adicional como se ilustra en la Figura 4A. </li><li> Ajuste el detector de UV-Vis para analizar a una longitud de onda de 520 nm. </li></ol></li><li> Puesta en marcha decolumna de RF <ol><li> Conectar la entrada de la columna de RF al instrumento HPLC. </li><li> Conectar una longitud de 15 cm de tubo de 0,13 mm ID para el puerto de salida central de la columna de la RF. </li><li> Conectar un puerto de periféricos de salida al detector UV-Vis utilizando una longitud de 15 cm de tubo Identificación del 0,13 mm. </li><li> Conecte la línea de bomba de DPPH • a un puerto de periféricos de la salida de la columna de RF. </li><li> Bloquear el puerto de periféricos sin utilizar en la salida de la columna de RF usando un tapón de columna. </li><li> Llevar la velocidad de flujo de la bomba de HPLC a 1 ml min -1 a 100% de la línea B - 100% de metanol. </li><li> Equilibrar la columna con la fase móvil metanol 100% durante 10 min para una columna mm de longitud 4,6 mm ID x 100. Este tiempo debe hacerse a escala de acuerdo a las dimensiones de otras columnas, el usuario puede emplear. </li></ol></li><li> Preparación de DPPH • Reactivo <ol><li> Preparar una solución / ml 0,1 mg de DPPH • en metanol. </li&gt; <li> Sonicar el matraz que contiene el DPPH • reactivo para 10 min. </li><li> Tapar el matraz en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. </li><li> Purgar el DPPH • bomba con el preparado de DPPH • Reactivo de acuerdo con los requisitos del fabricante. </li></ol></li><li> Sintonizar la salida de la columna de RF <ol><li> Se pesan exactamente dos recipientes limpios y secos. Etiquetar un recipiente como un elemento central y el otro como periférico. </li><li> Recoger el efluente que sale del puerto central en el recipiente de marcado central para 1,0 min. </li><li> Volver a pesar el recipiente de puerto central y calcular el peso del flujo desde el puerto central de la siguiente manera: Peso del puerto central (g) = peso final del puerto central del buque (g) - Peso inicial del puerto central del buque (g) </li><li> Repetir los pasos 1.4.2 y 1.4.3 para el efluente que sale de la UV-Vis que está unido al puerto de periféricos de la columna de RF y calcular el peso de la embarcación puerto de periféricos comosiguiente: Peso del puerto de periféricos (g) = peso final del puerto de periféricos de buques (g) - Peso inicial del puerto de periféricos de buques (g) </li><li> Calcular el porcentaje de la corriente procedente de los puertos centrales y periféricas de la siguiente manera: % Puerto central = Peso del puerto central (g) / (Peso del puerto central (g) + Peso del puerto de periféricos (g)) x 100 % De puerto de periféricos = Peso del puerto de periféricos (g) / (Peso del puerto central (g) + Peso del puerto de periféricos (g)) x 100 </li><li> Asegúrese de que la relación de segmentación entre el flujo central y el flujo periférico es 30:70 (central: periférica). Si el flujo central está por encima de 30%, disminuir la cantidad de salida de flujo mediante la adición de una longitud de tubo de id 0,13 mm a la salida del puerto central. Si el flujo central está por debajo de 30% de disminución de la longitud de la tubería mm 0,13 desde el puerto central. </li><li> Repita el paso 1.4.1 a la 1.4.6 hasta que una relación de segmentación de 30:70 (central: periférica) se logra. </li><li> Ajuste el caudal de la DPPH • bomba de reactivo de 0,5 ml min-1. Nota: La columna de RF configurado con DPPH • reactivo está listo para su análisis. Ahora se pueden inyectar las muestras. </li></ol></li><li> Pon ejecutar condiciones de parada <ol><li> Una vez que todas las muestras se han inyectado, lo que indica que la carrera ha terminado, detener el flujo de la bomba del reactivo de derivatización. </li><li> Retire la línea de DPPH • bomba de reactivo desde el puerto de periféricos y el tapón del puerto. </li><li> Equilibrar la columna con la fase móvil en la que se va a guardar, permitiendo la fase móvil para pasar a través de la columna a 1 ml min -1 para 10 min. </li><li> Detener el flujo de la bomba de la fase móvil en el instrumento de HPLC. </li><li> Vuelva a colocar el DPPH • reactivo con metanol y purgar la bomba adicional. Nota: El sistema HPLC puede ahora ser apagado. </li></ol></li></ol> 2. Detección de aminas primarias Uso de FLUORESCamina <ol><li> Preparación de la fase móvil <ol><li> Preparar 1 L de una solución de acetato de amonio 10 mM, ajustando el pH de la solución a 9,0 con hidróxido de amonio 5 M antes de la dilución al volumen. </li><li> Añadir 52,6 ml de acetonitrilo (ACN) al tampón de acetato de amonio para obtener una fase móvil premezclada de 95:05 (tampón: ACN). </li></ol></li><li> Puesta en marcha de instrumento de HPLC <ol><li> Preparación del instrumento HPLC con el tampón preparado pre-mezclado de la línea A como fase móvil. Purgar la bomba de acuerdo con los requisitos del fabricante. </li><li> Configurar los componentes instrumentales de HPLC y la bomba de derivatización adicional como se ilustra en la Figura 4A. </li><li> Adjuntar una bobina amortiguador de impulsos a la bomba de derivación. </li><li> Puesta en marcha del detector de fluorescencia (FLD) con una longitud de onda de excitación de longitud de onda de 390 nm y emisión de 475 nm. </li></ol></li><li> Puesta en marcha de la columna de RF <ol><li> Conectar THe entrada de la columna de RF al instrumento HPLC. </li><li> Conectar una longitud de 15 cm de tubo de 0,13 mm ID para el puerto de salida central de la columna de la RF. </li><li> Conectar un puerto de periféricos de salida de la columna de RF al detector FLD utilizando una longitud de 15 cm de tubo de Identificación del 0,13 mm. </li><li> Conecte la línea de bomba de derivación a un puerto de periféricos de la salida de la columna de RF. </li><li> Bloquear el puerto de periféricos sin utilizar en la salida de la columna de RF usando un tapón de columna. </li><li> Llevar la velocidad de flujo de la bomba de HPLC a 1 ml min -1 a 100% de la línea A - 10 mM acetato de amonio tampón de pH 9, premezclado con 5% de ACN. </li><li> Equilibrar la columna con la línea de una fase móvil 100% durante 10 min para una columna mm de longitud 4,6 mm ID x 100. Este tiempo puede hacerse a escala de acuerdo a las dimensiones de otras columnas, el usuario puede emplear. </li></ol></li><li> Preparación de reactivo de fluorescamina <ol><li> Hacer 100 ml de un reactivo de 0,1 mg ml -1 fluorescamina. </li> &lt;li&gt; Someter a ultrasonidos durante 1 minuto. </li><li> Cubrir con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. </li><li> Purgar la bomba de reactivo con el reactivo fluorescamina preparados de acuerdo con los requisitos del fabricante. </li></ol></li><li> Sintonizar la salida de la columna de RF <ol><li> Se pesan exactamente dos recipientes limpios y secos. Etiquetar un recipiente como un elemento central y el otro como periférico. </li><li> Recoger el efluente que sale del puerto central en el recipiente de marcado central para 1,0 min. </li><li> Volver a pesar el recipiente central y calcular el peso de la corriente desde el puerto central de la siguiente manera en el paso 1.4.3. </li><li> Repetir los pasos 2.5.2 a 2.5.3 para el efluente que sale de la FLD que está conectado al puerto de periféricos de la columna de RF y calcular el peso para periférica de la siguiente manera en el paso 1.4.4. </li><li> Calcular el porcentaje de la corriente procedente de los puertos centrales y periféricas de la siguiente manera en el paso 1.4.5. </li><li> Asegúrese de que la relación de segmentación entre el flujo central y el periféricoflujo es 43:57 (central: periférica). Si el flujo central está por encima de 43%, disminuir la cantidad de salida de flujo mediante la adición de una longitud de tubo de id 0,13 mm a la salida del puerto central. Si el flujo central está por debajo de 43%, disminuir la longitud de la tubería mm 0,13 desde el puerto central. </li><li> Repita el paso 2.5.1 a 2.5.6 hasta una proporción de 43:57 segmentación (central: periférica) se logra. </li><li> Ajuste el caudal de la bomba de fase móvil a 0,7 ml min-1. </li><li> Ajuste la bomba de derivación a fluir a 0,1 ml min-1. Nota: La columna RF configurar con el reactivo de fluorescamina está ahora lista para el análisis. Ahora se pueden inyectar las muestras. </li></ol></li><li> Pon ejecutar condiciones de parada <ol><li> Una vez que todas las muestras se han inyectado, lo que indica que la carrera ha terminado, parar la bomba derivatización. </li><li> Retire la línea de la bomba de derivación desde el puerto de periféricos y el tapón. </li><li> Equilibrar la columna con la fase móvil enque se va a guardar, permitiendo la fase móvil para pasar a través de la columna a 1 ml min -1 para 10 min. </li><li> Detener el flujo de la bomba de la fase móvil. </li><li> Vuelva a colocar el reactivo fluorescamina con acetonitrilo y purgar la bomba de derivación. Nota: El sistema HPLC puede ahora ser apagado. </li></ol></li></ol> 3. La detección de fenoles utilizando 4-aminoantipireno y ferricianuro potásico <ol><li> Preparación de la fase móvil <ol><li> Preparar 1 L de una solución de acetato de amonio 100 mM, ajustando el pH de la solución a 9,0 con hidróxido de amonio 5 M antes de la dilución al volumen. </li><li> Añadir 52,6 ml de metanol a la solución tampón de acetato de amonio para obtener una fase móvil premezclada de 95: 5 (tampón: metanol). </li></ol></li><li> Puesta en marcha de instrumento de HPLC <ol><li> Preparación del instrumento HPLC con el tampón preparado pre-mezclado de la línea A como fase móvil. Purgar la bomba de acuerdo con el fabricante; S requisitos. </li><li> Configurar los componentes instrumentales de HPLC y las dos bombas de reactivos adicionales, como se ilustra en la Figura 4B. </li><li> Adjuntar una bobina amortiguador de impulsos a cada una de las bombas de reactivos. </li><li> Ajuste el detector de UV-Vis para analizar a una longitud de onda de 500 nm. </li></ol></li><li> Puesta en marcha de la columna de RF <ol><li> Conectar la entrada de la columna de RF al instrumento HPLC. </li><li> Conectar una longitud de 15 cm de tubo de 0,13 mm ID para el puerto de salida central de la columna de la RF. </li><li> Conectar un puerto de periféricos de salida de la columna de RF al detector de UV-Vis usando una longitud de 15 cm de tubo de Identificación del 0,13 mm. </li><li> Conectar cada reactivo (es decir, 4-aminoantipireno y ferricianuro de potasio) de la línea de la bomba a un puerto de periféricos en la salida de la columna de RF. </li><li> Llevar la velocidad de flujo de la bomba de HPLC a 1 ml min -1 a 100% de la línea A - 100 mM acetato de amonio tampón de pH 9, premezclado con 5% de metanol. </li><li> Equilibrar la columna won la línea A de la fase móvil 100% durante 10 minutos para una columna mm de longitud de 4,6 mm de diámetro x 100. Este tiempo puede hacerse a escala de acuerdo a las dimensiones de otras columnas, el usuario puede emplear. </li></ol></li><li> Preparación de reactivo de 4-aminoantipireno <ol><li> Preparar un tampón de acetato de amonio con un pH de 9 siguiendo el paso 3.1.1. </li><li> Pesar 150 mg 4-aminoantipireno y disolver en 100 ml de tampón de acetato de amonio preparada (pH 9). </li><li> Sonicar durante 1 min. </li><li> Cubrir con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. </li><li> Purgar la primera bomba de reactivo con el reactivo 4-aminoantipireno preparados de acuerdo con los requisitos del fabricante. </li></ol></li><li> Preparación de reactivo de ferricianuro de potasio <ol><li> Pesar 150 mg de ferricianuro de potasio y disolver en 100 ml de tampón de acetato de amonio (pH 9) preparado como en la etapa 3.1.1. </li><li> Sonicar durante 1 min. </li><li> Cubrir con papel de para evitar la exposición a la luz. </li><li> Purge la segunda bomba de reactivo con el reactivo de ferricianuro de potasio preparada de acuerdo con los requisitos del fabricante. </li></ol></li><li> Sintonización de la columna de RF <ol><li> Se pesan exactamente dos recipientes limpios y secos. Etiquetar un recipiente como un elemento central y el otro como periférico. </li><li> Recoger el efluente que sale del puerto central en el recipiente de marcado central para 1,0 min. </li><li> Volver a pesar el recipiente central y calcular el peso de la corriente desde el puerto central de la siguiente manera en el paso 1.4.3. </li><li> Repetir los pasos 3.6.2 a 3.6.3 para el efluente que sale de la UV-Vis que está unido al puerto de periféricos de la columna de RF y calcular el peso para periférica de la siguiente manera en el paso 1.4.4. </li><li> Calcular el porcentaje de la corriente procedente de los puertos centrales y periféricas de la siguiente manera en el paso 1.4.5. </li><li> Asegúrese de que la relación de segmentación entre el flujo central y el flujo periférico es 50:50 (central: periférica). Si el flujo central está por encima de 50%, disminuir elcantidad de flujo que sale por la adición de una longitud de tubo de id 0,13 mm para el puerto central de salida. Si el flujo central está por debajo de 50%, disminuir la longitud de la tubería mm 0,13 desde el puerto central. </li><li> Repita el paso 3.6.1 a la 3.6.6 hasta que una relación de segmentación de 50:50 (central: periférica) se logra. </li><li> Ajuste el caudal de la bomba 4-aminoantipireno a 0,5 ml min-1. </li><li> Ajuste el caudal de la bomba de ferricianuro de potasio y 0,25 ml min-1. Nota: La columna de RF establecido con los reactivos de dos componentes está ahora listo para su análisis. Ahora se pueden inyectar las muestras. </li></ol></li><li> Pon ejecutar condiciones de parada <ol><li> Una vez que todas las muestras se han inyectado la carrera ha terminado, lo que indica que la carrera ha terminado, deje de ambas bombas de reactivos. </li><li> Retire las líneas de la bomba de reactivo de los puertos periféricos y reemplazarlos con una pieza de 15 cm de tubo de 0,13 mm. </li><li> Equilibrar la columna con la fase móvil en which que se va a guardar, permitiendo la fase móvil para pasar a través de la columna a 1 ml min -1 para 10 min. </li><li> Detener el flujo de la bomba de la fase móvil en el instrumento de HPLC. </li><li> Reemplazan tanto los reactivos en el reactivo de bombas con metanol y se purgan las bombas adicionales según el requisito del fabricante. Nota: El sistema HPLC puede ahora ser apagado. </li></ol></li></ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-column+labeling+techniques+in+amino+acid+analysis+by+liquid+chromatography.">Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography.</a> Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).</li><li>Frei, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+Detectors+in+Modern+Liquid+Chromatography.">Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography.</a> Chromatographia. 15, 161-166 (1982).</li><li>Pravadil-Cekic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Reaction+Flow+Chromatography+for+the+Analysis+of+Amino+Acid:+Derivatisation+With+Fluorescamine+Reagent.">Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent.</a> Microchem. J. , (2015).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection:+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products.">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li><li>Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+On-Line+HPLC+Method+for+Detection+of+Radical+Scavenging+Compounds+in+Complex+Mixtures.">An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures.</a> Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).</li><li>Selim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Two-component+Post-column+Derivatisation+Method+Utilsing+Reaction+Flow+Chromatography.">A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography.</a> Microchem. J. 116, 87-91 (2014).</li><li>Bigley, F. P., Grob, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Phenols+in+Water+and+Wastewater+by+Post-column+Reaction+Detection+High-performance+Liquid+Chromatography.">Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+flow+chromatography+for+rapid+post+column+derivatisations:+The+analysis+of+antioxidants+in+natural+products.">Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products.</a> J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

RF-PCD permite la mezcla eficiente del reactivo de derivatización con el efluente después de la columna de HPLC sin el uso de bobinas de reacción, reduciendo al mínimo los efectos de ensanchamiento de las bandas y la mejora de rendimiento de la separación. métodos RF-PCD también han demostrado mejoras en la respuesta de la señal con respecto al método de detección. Camenzuli et al. 28 fue el primero en reportar el uso de columnas de flujo de reacción con DPPH • para la detecci...

cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplada con la columna posterior derivatización (DCP) es una poderosa herramienta que es útil para resolver una serie de problemas en el laboratorio de análisis. Se puede utilizar para detectar compuestos que son de otro modo indetectable con la suite de detectores disponibles 1,2, aumentar la señal del analito diana, lo que permite límites inferiores de detección y cuantificación 3-5 o selectivamente derivatizar un analito diana a fin de evitar 6 efectos de la matriz. Reacciones de PCD comúnmente usados ​​incluyen la reacción de aminas, tales como aminoácidos, con orto-phthaladehyde 7-9, ninhidrina 9,10 o fluorescamina 11,12, la derivatización de las especies reactivas de oxígeno (ROS) con el 2,2-difenil- 1-picrylhydrazil radicales DPPH (•) o 13,14 2,2&#39;-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS) 15,16, y el uso del reactivo de yoduro-azida para derivatizar azufre ccompuestos ontaining 17,18. Hay, sin embargo, numerosos inconvenientes a la utilización de reacciones de PCD con sistemas de HPLC 6. Principalmente entre estos es el uso de bobinas de reacción entre el punto de adición del reactivo de derivatización (s) y el detector, que permiten tiempo para la mezcla y la reacción se produzca 8. Estos bucles de reacción a menudo tienen volúmenes de 500 l o más, lo que es significativo en comparación con el volumen del resto del sistema de HPLC 19. El uso de estos reacción alto volumen bucles de resultados en el aumento ensanchamiento de los picos en comparación con lo que se observaría sin la presencia del bucle de reacción. Esto se traduce en más cortos picos más amplios, que tienen límites más altos de cuantificación y detección y negativamente los efectos que la resolución cromatográfica. Las figuras 1 y 2 destacan el deterioro de la forma de los picos que resultan de la adición de varios volúmenes de bucle de reacción post columna. Este análisisse realizó con una composición de fase móvil de 94% de metanol y 6% de agua Milli-Q. La velocidad de flujo de la fase móvil fue de 1 ml / min, el volumen de inyección fue de 20 l y la longitud de onda análisis fue 265 nm. Las bobinas de diferentes volúmenes muertos de 20 l a 1000 l se insertaron entre la columna y el detector para simular los efectos de bucle de reacción volumen muerto en los métodos de PCD. Estos bucles se prepararon a partir de tubo de acero inoxidable de diámetro interno 0,5 mm. El experimento se realizó en un sistema HPLC que consta de un controlador (SCL-10AVP), una baja presión del gradiente de la válvula (FCL-10ALVP), una bomba (LC-20AD), un inyector (SIL-10ADvp), y un detector de PDA ( SPD-M10ADVP). La fase móvil se bombea a través de un desgasificador antes de la introducción en el sistema de HPLC. La separación se realizó usando un identificador de 5 micras columna de 250 mm x 4,6 mm. Las condiciones experimentales fueron elegidos para ser típica de las reacciones de PCD que recientemente han sido publicados en la literatura. losmás simple, la configuración más común de post reactor de columna se denomina un reactor tubular no segmentado que es efectivamente un tubo largo y delgado a través del cual el líquido puede fluir y la reacción puede tener lugar. En este pico del sistema ensanchamiento depende no sólo el volumen muerto añadido al sistema, sino también el diámetro interior del tubo como se destaca por Iijima et al. 8. Por otra parte, la geometría de la bobina juega un papel importante en la ampliación de la marca observada. Stewart 20 declaró que bobinado del reactor cambia los perfiles de flujo secundarias, lo que resulta en un mejor mezclado, lo que significa que el volumen muerto puede ser minimizado. Se ha dicho que ensanchamiento de los picos no es significativa cuando se utiliza un punto tubular abierta bobina 21. Cuando el ensanchamiento de los picos es excesivamente grande, otros tipos de reactores también pueden ser considerados 20,22. Estos pueden incluir reactores de lecho o reactores de flujo segmentados. Estos reactores son particularmente útiles para reacciones lentas que de otro modo requirbucles e gran reacción. Como reactores tubulares no segmentados son los tipos más comunes de los reactores utilizados en aplicaciones de PCD, el resto de este artículo trata con este tipo de configuración del reactor. El diseño de la columna de flujo de reacción (RF) incorpora un accesorio en el extremo de varios puertos que permite a la fase móvil para salir (o entrar) la columna a través de un puerto único situado en la región central radial de la columna o tres puertos situados en el exterior región de la pared de la columna (véase la Figura 3). Estas dos corrientes se separan usando un accesorio en el extremo que contiene una frita porosa central que está rodeado por un anillo impermeable que está a su vez rodeado por una frita de vidrio poroso exterior que se extiende a la pared de la columna. Debido al flujo transversal anillo impermeable central no es posible entre las dos regiones porosas. Durante cromatografía de flujo de reacción, el reactivo (s) de derivatización se bombea contra la dirección de flujo de la fase móvil en una o two de los puertos exteriores de la columna el flujo de reacción. El eluyente de la columna se mezcla con el reactivo (s) de derivatización en la frita exterior y se pasa al detector a través de un puerto exterior libre. flujo de reacción se puede utilizar ya sea para una derivatización solo reactivo (1 puerto para el reactivo de derivatización, 1 puerto para pasar el eluyente de la columna al detector y 1 puerto bloqueado) o un sistema de reactivos dual (2 puertos para los reactivos de derivatización y 1 puerto para pasar el eluyente de la columna al detector). El flujo de la corriente central o bien se puede utilizar para detectar el eluyente de la columna no derivatizado, con eficacia de detección de multiplexación 23, o pasado a los residuos. Una de las principales técnica de sintonización que está disponible cuando se ejecuta la cromatografía de RF-PCD es la relación de los flujos central y periférico. La relación óptima para cada derivatización depende de una serie de factores tales como si se detecta o se pasa a perder el flujo central. Por lo tanto una vez que la relación óptima se ha determinado, Se debe asegurar que la relación de flujo correcta se consigue antes de cada carrera se realiza. Se ha encontrado que el uso de una frita para mezclar la corriente de la columna de eluyente y el reactivo de derivatización en los resultados de RF-PCD en una mezcla más eficiente en comparación con técnicas de mezcla tradicionales que emplean típicamente un volumen muerto cero pieza en T o de bajo volumen muerto W- pieza a mezclar las dos corrientes. Esto ha permitido el uso de bucles de reacción relativamente pequeñas, o incluso la eliminación de la del circuito de reacción en conjunto. La reducción de los resultados de la reacción de tamaño de bucle en picos más agudos en comparación con los métodos tradicionales de derivatización post-columna. Esto significa que, a pesar del hecho de que no todo el eluyente de la columna se derivatiza, una mayor relación señal-ruido se observan y por lo tanto los límites inferiores de detección y cuantificación se puede lograr. cromatografía de flujo de reacción se ha desarrollado para superar las dificultades con la adaptación de la reacción PCDs a modernas columnas de HPLC y los sistemas, en particular la pérdida de eficacia provocada por banda ensanchamiento debido a las grandes columnas poste volúmenes muertos causados ​​por la necesidad de emplear bucles de reacción de gran volumen. Los procesos de mezcla más eficientes en RF-PCD en comparación con PCD convencionales significan que los volúmenes de bucle de reacción más pequeño se pueden emplear conduce a un aumento de la eficacia de separación observada. Además cromatografía RF-PCD muestra tanto el aumento de la señal y el ruido disminuyó en comparación con las técnicas convencionales de PCD que resulta en límites inferiores de detección y cuantificación en comparación con los métodos convencionales de PCD. Una ventaja adicional de RF-PCD comparación con los métodos convencionales de PCD es la capacidad de controlar la corriente no derivatizado que eluye desde el puerto central de la columna de la RF, así como la corriente de derivatizado que eluye de la región periférica de la columna. RF-PCD es una forma relativamente nueva pero prometedora técnica que muestra muchas ventajas sobre los métodos tradicionales de PCD. <p class="jove_content"&gt; Conexión de la columna de RF se consigue en casi la misma forma que una columna de HPLC convencional con la principal diferencia es el número de accesorios de los extremos en una columna de RF. Accesorios utilizados para conectar una columna de HPLC estándar para el sistema de HPLC son capaces de ser utilizado para conectar una columna de RF al sistema de HPLC.

<table><tbody><tr><td>HPLC instrument</td><td>Agilent</td><td>1290 Series HPLC</td><td></td></tr><tr><td>Additional Pump(s) for derivatization system</td><td>Shimadzu</td><td>LC-20A</td><td></td></tr><tr><td>RF colum</td><td></td><td></td><td>Non-commercial</td></tr><tr><td>PEEK tubing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z227307</td><td></td></tr><tr><td>Column stoppers</td><td></td><td></td><td>Provided with column</td></tr><tr><td>PEEK tube cutter</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z290882</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Scale Balance</td><td></td><td></td><td>4-point analytical balance</td></tr><tr><td>Stop watch</td><td></td><td></td><td>Non-Scientific equiptment</td></tr><tr><td>Eluent collection vials</td><td></td><td></td><td>Any Small vial with a flat bottom will do, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, HPLC vials</td></tr><tr><td>HPLC Vials</td><td></td><td></td><td>Will depend on instrument used</td></tr><tr><td>Vessels for mobile phase and derivatization solution(s)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z232211</td><td></td></tr><tr><td>General Laboratory glassware</td><td></td><td></td><td>Volumetric Flasks, pippettes, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt; Quantity and volumes will depend on sample preparation method.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>DPPH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9132</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17836</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320145</td><td>Corrosive</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9015</td><td></td></tr><tr><td>4-aminoantipyrene&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics BVBA</td><td>AC103151000</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide&amp;nbsp;</td><td>AnalaR</td><td>B10204-30</td><td></td></tr></tbody></table>

post column derivatization using reaction flow high performance liquid chromatography columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

El primer método PCD que fue adaptado para su uso por RF-PCD fue la derivación de antioxidantes utilizando el radical 2,2-difenil-1-picrylhydrazil (DPPH •) 24. Esta reacción se introdujo por Koleva et al. 25 y se ha utilizado ampliamente desde entonces. La detección se basa en la decoloración del DPPH • radical en presencia de especies reactivas del oxígeno, por lo tanto, la presencia de los resultados de los antioxidantes en una caída en la absorbancia obs...

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Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Columna posterior derivatización usando la reacción en columnas de flujo Cromatografía Líquida de Alta

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

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Universidad San Sebastian

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Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Principles of Chromatography

SCIENTISTS IN ACTION

15.0K vistas.  University of Western Sydney. A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

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Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Puesta a punto del paralelo Columna de flujo segmentado y habilitación de detección de multiplexado

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

Investigación

Química

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Cortina Columna de flujo: optimización de la eficiencia y sensibilidad

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

A Robust Method for Packing High Resolution C18 RP-nano-HPLC Columns

The high complexity prevalent in biological samples requires chromatographic separations with high sensitivity and resolution to be effectively analyzed. Here we introduce a robust, reproducible and inexpensive protocol for preparation of a nano-flow reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) columns for on-line separation of analytical peptides before introduction into and detection by a mass-spectrometer in traditional bottom-up proteomics workflows. Depending on the goal of the experiment and the chemical properties of the analytes being separated, optimal column parameters may differ in their internal or outer diameters, length, particle size, pore size, chemistry of stationary phase particles, and the presence or absence of an integrated electrospray emitter at the tip. An in-house column packing system not only enables the rapid fabrication of columns with the desired properties but also dramatically reduces the cost of the process. The optimized protocol for packing a C18 AQ (aqueous) fused silica column discussed here is compatible with a wide range of liquid chromatographic instruments for achieving effective separation of analytes.

Here, we present and evaluate a protocol for making low cost reversed phase nano-flow liquid chromatography columns for peptide characterization using LC-MS/MS proteomic workflows.

The high complexity prevalent in biological samples requires chromatographic separations with high sensitivity and resolution to be effectively analyzed. ...

Bioquímica

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. However, capillary columns are much less robust in comparison to their higher flow countertypes. Because of easy contamination and blocking, they often need replacement. That makes them a markedly expensive part of the total LC-MS analysis cost. In-house packing of UHPLC capillary columns saves a lot of money and allows customization. However, the standard packing procedure in the 100-bar pressure bomb works well only for HPLC columns but is too slow for UHPLC sorbents. Here we provide a description of an optimized FlashPack protocol applied to the same 100-bar pressure bomb setup. The method is based on packing from ultra-high sorbent concentration slurry and is developed for in-house manufacturing of UHPLC capillary columns of unlimited length in reasonable time.

Here we present a protocol for the optimized FlashPack capillary column packing procedure. Application of an optimized protocol to a common 100-bar pressure bomb setup allows 10-times faster packing and manufacturing of long ultra-high performance capillary columns.

Fabricación interna sencilla de columnas capilares de ultra alto rendimiento con el enfoque FlashPack

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...

High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Source: Dr. Paul Bower - Purdue University
High-performance liquid chromatography (HPLC) is an important analytical method commonly used to separate and quantify components of liquid samples. In this technique, a solution (first phase) is pumped through a column that contains a packing of small porous particles with a second phase bound to the surface. The different solubilities of the sample components in the two phases cause the components to move through the column with different average velocities, thus creating a separation of these components. The pumped solution is called the mobile phase, while the phase in the column is called the stationary phase.
There are several modes of liquid chromatography, depending upon the type of stationary and/or mobile phase employed. This experiment uses reversed-phase chromatography, where the stationary phase is non-polar, and the mobile phase is polar. The stationary phase to be employed is C18 hydrocarbon groups bonded to 3-&#181;m silica particles, while the mobile phase is an aqueous buffer with a polar organic modifier (acetonitrile) added to vary its eluting strength. In this form, the silica can be used for samples that are water-soluble, providing a broad range of applications. In this experiment, the mixtures of three components frequently found in diet soft drinks (namely caffeine, benzoate, and aspartame) are separated. Seven prepared solutions containing known amounts of the three species are used, and their chromatograms are then recorded.

Operation of High-Performance Liquid Chromatography HPLC

Cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC)

Source: Dr. Paul Bower - Purdue University
High-performance liquid chromatography (HPLC) is an important analytical method commonly used to separate and ...

Educación

JoVE Science Education

Química analítica

Column Chromatography

Source: Laboratory of Dr. Jimmy Franco - Merrimack College
Column chromatography is one of the most useful techniques for purifying compounds. This technique utilizes a stationary phase, which is packed in a column, and a mobile phase that passes through the column. This technique exploits the differences in polarity between compounds, allowing the molecules to be facilely separated.1 The two most common stationary phases for column chromatography are silica gel (SiO2) and alumina (Al2O3), with the most commonly used mobile phases being organic solvents.2 The solvent(s) chosen for the mobile phase are dependent on the polarity of the molecules being purified. Typically more polar compounds require more polar solvents in order to facilitate the passage of the molecules through the stationary phase. Once the purification process has been completed&#160;the solvent can be removed from the collected fractions using a rotary evaporator to yield the isolated material.

Column Chromatography: Principle, Separation of Compounds from a Mixture

Cromatografía en columna

Source: Laboratory of Dr. Jimmy Franco - Merrimack College
Column chromatography is one of the most useful techniques for purifying compounds. This ...

Química orgánica

Principles Of Column Chromatography

The chromatography technique was first invented in 1901 by Michael S. Tswett, a Russian botanist, to separate plant pigments using organic solvents. Further, in 1941, Archer John Porter Martin and R. L. M. Synge modified the technique by packing silica gel into a column. A mixture of amino acids was then separated on the packed column using chloroform and water mixture as the mobile phase. This was the first report on column chromatography. At present, column chromatography is a widely used technique for separating various types of compounds from a sample mixture.
Factors Influencing Efficient Separation of Proteins 
Various parameters like column material, packing, and operational conditions such as flow rates and temperature determine the efficiency of separation by column chromatography.
The choice of column material or matrix determines the extent of interaction with the sample. The matrix material must be tightly and uniformly packed in the column. Air bubbles, debris, large particles, and precipitates interfere with the uniform flow of the solvent through the column, affecting its separation efficiency. The column should also be free from particulate matter.
The sample injected into the column should be clear and free from aggregates that might clog the column, hindering solvent flow. The flow rate of solvent also affects the separation. Very high or very low flow rates of solvents result in inefficient separation of compounds and impure preparations. Very high rates may also disturb the column packing, affecting process efficiency. In addition, the composition of elution buffer is also an important factor. It should be non-corrosive and compatible with the sample and also the column material to prevent in situ precipitation or dissolution.
Another operational parameter, temperature, also plays an important role in the process. It decides the stability of the sample, column material, and solvent buffer. Also, a constant temperature throughout the column efficiently resolves compounds. After completing the separation process, the columns must be washed thoroughly by repeatedly passing a suitable solvent to avoid sample contamination in further runs. Occasionally, the solvent is passed in a column in the reverse direction to remove any clogged material.
Limitations
Though a very widely used technique, the method still has some limitations. It is a very time-consuming method as the flow rates need to be slower for better resolution of the compounds. Also, large quantities of highly pure solvents required in the mobile phase make the process expensive. This also raises the scaling-up cost when higher yields of pure compounds are needed.

Principios de la cromatografía en columna

The chromatography technique was first invented in 1901 by Michael S. Tswett, a Russian botanist, to separate plant pigments using organic solvents. ...

Biología Celular

Analyzing Cells and Proteins

TÉRMINOS Y CONCEPTOS CLAVES

Types Of Column Chromatography

The stability and compatibility of column material with samples are crucial for efficient purification in chromatographic techniques. Various operating parameters such as pH, temperature, or solvent affect the packing of the column material, thereby determining the purification efficiency. The choice of column material also plays an essential role in deciding the operating parameters and can be modified based on the proteins that need to be purified.
Gel Filtration Chromatography 
When the protein&#39;s chemical nature is unknown, gel filtration chromatography is used for purification based on size. Matrices such as agarose, polyacrylamide, dextran derivatives, or silica beads are used for low-pressure systems, whereas polymeric resins are used for higher flow rates. The varying degree of cross-linking of these polymeric materials determines the pore size of the matrix, which decides the size range of proteins that can be separated.
Ion Exchange Chromatography
Ion-exchange chromatography can purify proteins based on their net charge at a particular pH determined by their isoelectric point or pI. The net charge on matrix resin is used to purify oppositely charged proteins by replacing the cations or anions from the matrix resin with the charged proteins. The resins are categorized based on the type of ion that is exchanged &#8212; positively charged proteins replace cations from cation-exchange resins, and vice versa. Strong ion exchangers with stability over a wide range of buffer pH include quaternary ammonium, sulfonate, and sulfopropyl resins. In contrast, weak ion exchangers that are effective only in a narrow pH range include diethyl aminoethyl (DEAE) or carboxymethyl (CM) resins.
Affinity Chromatography
Affinity chromatography involves immobilizing protein-specific antibodies or enzyme-specific substrates to the column material, usually agarose beads. For example, a column with the immobilized antibody of choice is prepared to separate specific antigens. When the mixed antigen sample is passed through the&#160; column, the target antigens bind to the immobilized antibodies and separate from the mixture. To separate recombinant proteins tagged with enzymes such as beta-galactosidase, the corresponding substrate Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG) is immobilized on the column to purify the enzyme.
High-pressure liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography (GC) are the most commonly used column chromatography techniques. In HPLC, the solvent flows at high pressure through a tightly packed column that improves efficiency. Gas chromatography analyzes volatile compounds by converting them to their gaseous forms upon heating. The volatilized sample is pushed through the column by inert gasses such as nitrogen and helium.

Tipos de cromatografía en columna

The stability and compatibility of column material with samples are crucial for efficient purification in chromatographic techniques. Various operating ...

High-Performance Liquid Chromatography: Introduction

High-performance liquid chromatography(HPLC), formerly referred to as High-pressure liquid chromatography, is a powerful technique used to separate, identify, and quantify components in complex mixtures. The term &#34;high pressure&#34; refers to using high pressure to push the liquid mobile phase through the tightly packed columns.
In HPLC, two phases play a critical role in the separation process:
<ol>
	<li>Mobile Phase: This is a liquid solvent that flows through the system, carrying the sample with it. The solvent is chosen based on its polarity to optimize the interaction with the analytes and the stationary phase. The &#34;polarity index&#34; serves as a guide to selecting the suitable solvent for separation.</li>
	<li>Stationary Phase: The stationary phase is a solid material, often silica-based, packed within the column. In reverse-phase HPLC, the stationary phase is typically derivatized silica, such as octadecyl (C18) silica. The small particle size of the packed material creates a high surface area, enhancing interactions with the analytes. To reduce undesirable interactions, such as those with unreacted silanol groups, the stationary phase is often end-capped with reagents like trimethylchlorosilane</li>
</ol>
Separation occurs as the analytes interact differently with both the mobile and stationary phases, depending on their chemical properties, which leads to differential migration through the column.
Sometimes, solute molecules bind irreversibly to the stationary phase, clogging the analytical column and decreasing its performance. To prevent this, a guard column is placed before the analytical column. A precolumn called a scavenger column may also be placed between the mobile phase reservoir and the injector. This ensures that the solvent enters the analytical column, which is already saturated with silica from the scavenger column, preventing unwanted reactions and extending the lifetime of the analytical column.
After the separation, analytes are detected by various detectors, depending on the characteristics of the compounds. The results are visualized as chromatograms, with peaks corresponding to the different components of the mixture. This provides both qualitative and quantitative data about the sample.

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