Name: post column derivatization using reaction flow high performance liquid chromatography columns
Uploaded: 2016-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
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This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Attention: S&#39;il vous plaît se référer à des fiches de données de sécurité (FDS) pour tous les matériaux et réactifs avant utilisation (c. -à- FS pour le méthanol). Assurer l&#39;utilisation de toutes les pratiques de sécurité appropriées lors de la manipulation des solvants et chromatographie liquide haute performance (HPLC) éluant. Veiller à l&#39;utilisation appropriée des contrôles techniques de HPLC analytique équilibre et détecteur instrumentation, et d&#39;assurer l&#39;utilisation des équipements de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse, pantalon de longueur, et des chaussures fermées). Remarque: Ce protocole décrit 3 méthodes de flux de réaction dérivatisation post-colonne (RF-PCD) techniques, chacune avec un réactif différent spécifique à la nature d&#39;un composé chimique d&#39;intérêt. Pour l&#39;analyse des ROS passez à la section «1. Détection des ROS en utilisant DPPH •&quot;, pour l&#39;analyse des amines primaires voir section &quot;2. Détection des amines primaires en utilisant fluorescamine&quot;, et pour l&#39;analyse des composés phénoliques passez à la section &quot;3 . La détection des phénolsen utilisant 4-aminoantipyrine et ferricyanure de potassium &quot;. Utiliser de l&#39; eau ultra-pure (par exemple, l&#39; eau Milli-Q) tout au long. Remarque: la connexion de la colonne HF est réalisée pratiquement de la même manière qu&#39;une colonne de HPLC classique avec la différence majeure étant le nombre de raccords d&#39;extrémité sur une colonne RF. Les raccords utilisés pour connecter une colonne de HPLC standard pour le système HPLC peuvent être utilisés pour connecter une colonne RF au système HPLC. 1. Détection des ERO Utilisation DPPH • <ol><li> Mise en place d&#39;instrument HPLC <ol><li> Préparation de l&#39;instrument HPLC avec 100% d&#39;eau sur la ligne A et 100% de methanol à la ligne B en tant que phase mobile. Purger les pompes selon les exigences du fabricant. </li><li> Mettre en place les composants instrumentaux HPLC et la pompe de dérivation supplémentaire , comme illustré sur la figure 4A. </li><li> Régler le détecteur UV-Vis à analyser à une longueur d&#39;onde de 520 nm. </li></ol></li><li> Mise en place decolonne RF <ol><li> Relier l&#39;entrée de la colonne de RF à l&#39;instrument CLHP. </li><li> Connecter une longueur de 15 cm de 0,13 mm id tube à l&#39;orifice de sortie central de la colonne HF. </li><li> Connecter un orifice périphérique de sortie du détecteur UV-Vis en utilisant une longueur de 15 cm de 0,13 mm Tuyau id. </li><li> Connectez la ligne de pompe DPPH • à un port périphérique sur la sortie de la colonne de RF. </li><li> Bloquer le port de périphérique utilisé sur la sortie de la colonne RF en utilisant un bouchon de colonne. </li><li> Porter le débit de la pompe HPLC de débit à 1 ml min -1 à 100% de la ligne B - 100% de methanol. </li><li> Équilibrer la colonne avec la phase mobile 100% de methanol pendant 10 minutes pour une colonne de longueur mm 4,6 mm DI x 100. Ce temps doit être adapté en fonction des dimensions des autres colonnes, l&#39;utilisateur peut employer. </li></ol></li><li> Préparation du DPPH • réactif <ol><li> Préparer une solution / ml 0,1 mg de DPPH • dans le méthanol. </li&gt; <li> Soniquer le flacon contenant le DPPH • réactif pendant 10 min. </li><li> Couvrir le flacon dans du papier pour éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Purger le DPPH • pompe avec le prêt DPPH • réactif selon les exigences du fabricant. </li></ol></li><li> Réglage de la sortie de la colonne HF <ol><li> Peser deux navires propres et secs. Etiqueter un navire comme un élément central et l&#39;autre périphérique. </li><li> Recueillir l&#39;effluent sortant du port central dans le récipient étiqueté central pour 1,0 min. </li><li> Repeser le récipient de port central et calculer le poids de l&#39;écoulement depuis l&#39;orifice central de la manière suivante: Poids de Port centrale (g) = Poids final de Port Central navire (g) - Poids initial de Port Central navire (g) </li><li> Répéter les étapes 1.4.2 et 1.4.3 de l&#39;effluent sortant de l&#39;UV-Vis qui est attaché au port périphérique de la colonne HF et de calculer le poids du récipient de port périphérique quesuit: Poids du port périphérique (g) = Poids final du port périphérique navire (g) - poids initial du port périphérique navire (g) </li><li> Calculer le pourcentage du flux provenant des orifices centraux et périphériques comme suit: % Port Central = Poids de Port centrale (g) / (poids de Port centrale (g) + Poids du port périphérique (g)) x 100 % Port périphérique = Poids du port périphérique (g) / (poids de Port centrale (g) + Poids du port périphérique (g)) x 100 </li><li> Assurer le rapport de segmentation entre le flux central et le flux périphérique est 30:70 (central: périphérique). Si l&#39;écoulement central est supérieure à 30%, de diminuer la quantité de flux sortant en ajoutant une longueur de 0,13 mm Tuyau identifiant à la sortie de l&#39;orifice central. Si l&#39;écoulement central est inférieure à 30% diminuer la longueur de 0,13 mm tube du port central. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.4.1 à 1.4.6 jusqu&#39;à ce qu&#39;un rapport de segmentation de 30:70 (central: périphérique) est atteint. </li><li> Réglez le taux de la D d&#39;écoulementPPH • pompe de réactif à 0,5 ml min -1. Remarque: La colonne RF mis en place avec DPPH • réactif est maintenant prêt pour l&#39; analyse. Les échantillons peuvent maintenant être injectés. </li></ol></li><li> Déposer exécuter des conditions d&#39;arrêt <ol><li> Une fois que tous les échantillons ont été injectés, ce qui indique que la course est terminée, arrêter le débit de la pompe de réactif de dérivatisation. </li><li> Retirez le DPPH • ligne de pompe de réactif du port périphérique et boucher le port. </li><li> Équilibrer la colonne avec la phase mobile dans laquelle il doit être stocké en permettant à la phase mobile de passer à travers la colonne à 1 ml min - 1 pendant 10 min. </li><li> Arrêter l&#39;écoulement de la pompe de la phase mobile de l&#39;instrument CLHP. </li><li> Remplacer le DPPH • réactif avec du méthanol et purger la pompe supplémentaire. Remarque: Le système HPLC peut maintenant être arrêté. </li></ol></li></ol> 2. Détection de Amines primaires Utilisation Fluorescamine <ol><li> Préparation de la phase mobile <ol><li> Préparer 1 L d&#39;une solution 10 mM d&#39;acétate d&#39;ammonium, en ajustant le pH de la solution à 9,0 avec de 5 M d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium avant la dilution au volume. </li><li> Ajouter 52,6 ml d&#39;acétonitrile (ACN) dans le tampon d&#39;acétate d&#39;ammonium pour obtenir une phase mobile prémélangée de 95:05 (tampon: ACN). </li></ol></li><li> Mise en place d&#39;instrument HPLC <ol><li> Préparation de l&#39;instrument HPLC avec le tampon préparé préalablement mélangé à la ligne A en tant que phase mobile. Purger la pompe selon les exigences du fabricant. </li><li> Mettre en place les composants instrumentaux HPLC et la pompe de dérivation supplémentaire , comme illustré sur la figure 4A. </li><li> Fixer une bobine impulsion de l&#39;amortisseur à la pompe de dérivation. </li><li> Mettre en place le détecteur de fluorescence (FLD) avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 390 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 475 nm. </li></ol></li><li> Mise en place de la colonne RF <ol><li> Connectez el&#39;entrée e de la colonne de RF à l&#39;instrument CLHP. </li><li> Connecter une longueur de 15 cm de 0,13 mm id tube à l&#39;orifice de sortie central de la colonne HF. </li><li> Connecter un port périphérique sortie de la colonne HF au détecteur FLD en utilisant une longueur de 15 cm de 0,13 mm Tuyau id. </li><li> Connecter la ligne de la pompe à dérivatisation à un port périphérique sur la sortie de la colonne HF. </li><li> Bloquer le port de périphérique utilisé sur la sortie de la colonne RF en utilisant un bouchon de colonne. </li><li> Amener le débit de la pompe HPLC de débit à 1 ml min -1 à 100% de la ligne A - 10 mM de tampon d&#39;acétate d&#39; ammonium à pH 9, prémélangée avec 5% d&#39; ACN. </li><li> Equilibrer la colonne avec la ligne A phase mobile 100% pendant 10 min pour une colonne de longueur mm 4,6 mm id x 100. Ce temps peut être mis à l&#39;échelle en fonction des dimensions des autres colonnes, l&#39;utilisateur peut employer. </li></ol></li><li> Préparation du réactif à la fluorescamine <ol><li> Faire 100 ml d&#39;un ml -1 fluorescamine réactif 0,1 mg. </li> &lt;li&gt; Soniquer pendant 1 min. </li><li> Couvrir de papier d&#39;aluminium pour éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Purger la pompe de réactif avec le réactif fluorescamine préparé selon les exigences du fabricant. </li></ol></li><li> Réglage de la sortie de la colonne HF <ol><li> Peser deux navires propres et secs. Etiqueter un navire comme un élément central et l&#39;autre périphérique. </li><li> Recueillir l&#39;effluent sortant du port central dans le récipient étiqueté central pour 1,0 min. </li><li> Peser le récipient central et calculer le poids de l&#39;écoulement de l&#39;orifice central de la manière suivante à l&#39;étape 1.4.3. </li><li> À répéter les étapes 2.5.2 2.5.3 de l&#39;effluent sortant de la FLD qui est attaché au port périphérique de la colonne HF et de calculer le poids pour périphérique de la façon suivante à l&#39;étape 1.4.4. </li><li> Calculer le pourcentage du flux provenant des orifices centraux et périphériques comme suit dans l&#39;étape 1.4.5. </li><li> Assurer le rapport de segmentation entre le flux central et périphériquedébit est 43:57 (central: périphérique). Si l&#39;écoulement central est supérieur à 43%, de diminuer la quantité de flux sortant en ajoutant une longueur de 0,13 mm Tuyau identifiant à la sortie de l&#39;orifice central. Si l&#39;écoulement central est inférieure à 43%, diminuer la longueur de 0,13 mm tube du port central. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.5.1 à 2.5.6 jusqu&#39;à ce qu&#39;un rapport de segmentation de 43:57 (central: périphérique) est atteint. </li><li> Régler le débit de la pompe de la phase mobile de débit à 0,7 ml min -1. </li><li> Réglez la pompe de dérivation à l&#39; écoulement à 0,1 ml min -1. Remarque: La colonne RF mis en place avec le réactif fluorescamine est maintenant prêt pour l&#39;analyse. Les échantillons peuvent maintenant être injectés. </li></ol></li><li> Déposer exécuter des conditions d&#39;arrêt <ol><li> Une fois que tous les échantillons ont été injectés, ce qui indique que la course est terminée, arrêter la pompe de dérivation. </li><li> Retirer la ligne de pompe de dérivation du port périphérique et le bouchon. </li><li> Équilibrer la colonne avec la phase mobilelaquelle il doit être stocké en permettant à la phase mobile de passer à travers la colonne à 1 ml min - 1 pendant 10 min. </li><li> Arrêter l&#39;écoulement de la pompe de la phase mobile. </li><li> Remplacer le réactif fluorescamine avec de l&#39;acétonitrile et purger la pompe de dérivation. Remarque: Le système HPLC peut maintenant être arrêté. </li></ol></li></ol> 3. Détection de Phénols Utilisation 4-aminoantipyrine et Potassium Ferricyanide <ol><li> Préparation de la phase mobile <ol><li> Préparer 1 L d&#39;une solution d&#39;acétate d&#39;ammonium 100 mM, on ajuste le pH de la solution à 9,0 avec de 5 M d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium avant la dilution au volume. </li><li> Ajouter 52,6 ml de méthanol dans le tampon d&#39;acétate d&#39;ammonium pour obtenir une phase mobile prémélangée de 95: 5 (tampon: methanol). </li></ol></li><li> Mise en place d&#39;instrument HPLC <ol><li> Préparation de l&#39;instrument HPLC avec le tampon préparé préalablement mélangé à la ligne A en tant que phase mobile. Purger la pompe selon fabricant »; S exigences. </li><li> Mettre en place les composants instrumentaux HPLC et les deux pompes de réactif supplémentaires , comme illustré sur la figure 4B. </li><li> Fixer une bobine impulsion de l&#39;amortisseur à chacune des pompes de réactif. </li><li> Régler le détecteur UV-Vis pour analyser à une longueur d&#39;onde de 500 nm. </li></ol></li><li> Mise en place de la colonne RF <ol><li> Relier l&#39;entrée de la colonne de RF à l&#39;instrument CLHP. </li><li> Connecter une longueur de 15 cm de 0,13 mm id tube à l&#39;orifice de sortie central de la colonne HF. </li><li> Connecter un port périphérique sortie de la colonne RF au détecteur UV-Vis en utilisant une longueur de 15 cm de 0,13 mm Tuyau id. </li><li> Connecter chaque réactif ( par exemple, la 4-aminoantipyrine et du ferricyanure de potassium) , la ligne de la pompe à un orifice périphérique à la sortie de la colonne HF. </li><li> Amener le débit de la pompe HPLC de débit à 1 ml min -1 à 100% de la ligne A - 100 mM de tampon d&#39;acétate d&#39; ammonium à pH 9, prémélangée avec 5% de methanol. </li><li> Équilibrer la colonne wvec la ligne A phase mobile 100% pendant 10 min pour une colonne de longueur mm 4,6 mm id x 100. Ce temps peut être mis à l&#39;échelle en fonction des dimensions des autres colonnes, l&#39;utilisateur peut employer. </li></ol></li><li> Préparation du réactif 4-aminoantipyrine <ol><li> Préparer un tampon d&#39;acétate d&#39;ammonium avec un pH de 9 par suite de l&#39;étape 3.1.1. </li><li> Peser 150 mg de 4-aminoantipyrine et le dissoudre dans 100 ml de tampon d&#39;acétate d&#39;ammonium préparé (pH 9). </li><li> Sonication pendant 1 min. </li><li> Couvrir de papier d&#39;aluminium pour éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Purger la première pompe de réactif avec le réactif préparé 4-aminoantipyrine selon les exigences du fabricant. </li></ol></li><li> Préparation du réactif de potassium , le ferricyanure <ol><li> Peser 150 mg de ferricyanure de potassium et de se dissoudre dans 100 ml de tampon d&#39;acétate d&#39;ammonium (pH 9) préparés selon l&#39;étape 3.1.1. </li><li> Sonication pendant 1 min. </li><li> Couvrir de papier d&#39;aluminium pour éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Purge la seconde pompe de réactif avec le réactif de ferricyanure de potassium préparé selon les exigences du fabricant. </li></ol></li><li> Tuning de la colonne RF <ol><li> Peser deux navires propres et secs. Etiqueter un navire comme un élément central et l&#39;autre périphérique. </li><li> Recueillir l&#39;effluent sortant du port central dans le récipient étiqueté central pour 1,0 min. </li><li> Peser le récipient central et calculer le poids de l&#39;écoulement de l&#39;orifice central de la manière suivante à l&#39;étape 1.4.3. </li><li> Répéter les étapes 3.6.2 à 3.6.3 pour l&#39;effluent sortant de l&#39;UV-Vis qui est attaché au port périphérique de la colonne HF et de calculer le poids pour périphérique de la façon suivante à l&#39;étape 1.4.4. </li><li> Calculer le pourcentage du flux provenant des orifices centraux et périphériques comme suit dans l&#39;étape 1.4.5. </li><li> Assurer le rapport de segmentation entre le flux central et le flux périphérique est 50:50 (central: périphérique). Si l&#39;écoulement central est supérieure à 50%, diminuer laquantité de flux sortant en ajoutant une longueur de 0,13 mm, un tube d&#39;identification au centre port de sortie. Si l&#39;écoulement central est inférieure à 50%, diminuer la longueur de 0,13 mm tube du port central. </li><li> Répétez l&#39;étape 3.6.1 à 3.6.6 jusqu&#39;à ce qu&#39;un rapport de segmentation de 50:50 (central: périphérique) est atteint. </li><li> Régler le débit de la pompe 4-aminoantipyrine débit à 0,5 ml min -1. </li><li> Régler le débit de la pompe de ferricyanure de potassium d&#39;écoulement de 0,25 ml min -1. Remarque: La colonne RF mis en place avec les réactifs à deux composants est maintenant prêt pour l&#39;analyse. Les échantillons peuvent maintenant être injectés. </li></ol></li><li> Déposer exécuter des conditions d&#39;arrêt <ol><li> Une fois que tous les échantillons ont été injectés la course est terminée, ce qui indique que la course est terminée, arrêtez les deux pompes de réactif. </li><li> Supprimer les lignes de pompe à réactif à partir des orifices périphériques et les remplacer par un morceau de 0,13 mm Tuyau 15 cm. </li><li> Equilibrer la colonne avec la phase mobile dans which , il doit être stocké en permettant à la phase mobile de passer à travers la colonne à 1 ml min - 1 pendant 10 min. </li><li> Arrêter l&#39;écoulement de la pompe de la phase mobile de l&#39;instrument CLHP. </li><li> Remplacer les deux réactifs sur le réactif pompes avec du méthanol et purger les pompes supplémentaires selon l&#39;exigence du fabricant. Remarque: Le système HPLC peut maintenant être arrêté. </li></ol></li></ol>

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A. 1233, 8-15 (2012).</li><li>Zakrzewski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Methimazole+in+Pharmaceutical+Preparations+using+an+HPLC+Method+Coupled+with+an+Iodine-Azide+Post-Column+Reaction.">Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction.</a> J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).</li><li>Zakrzewski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+reversed-phase+HPLC+method+with+post-column+iodine-azide+reaction+for+the+determination+of+thioguanine.">Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine.</a> J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).</li><li>Gritti, F., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+measurements+of+the+true+column+efficiency+and+of+the+instrument+band+broadening+contributions+in+the+presence+of+a+chromatographic+column.">Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column.</a> J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).</li><li>Stewart, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post+cotumn+derivatization+methodology+in+high+performance+liquid+chromatography+(HPLC).">Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC).</a> Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).</li><li>Rigas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-column+labeling+techniques+in+amino+acid+analysis+by+liquid+chromatography.">Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography.</a> Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).</li><li>Frei, R. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection:+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products.">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li><li>Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+On-Line+HPLC+Method+for+Detection+of+Radical+Scavenging+Compounds+in+Complex+Mixtures.">An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures.</a> Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).</li><li>Selim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Two-component+Post-column+Derivatisation+Method+Utilsing+Reaction+Flow+Chromatography.">A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography.</a> Microchem. J. 116, 87-91 (2014).</li><li>Bigley, F. P., Grob, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Phenols+in+Water+and+Wastewater+by+Post-column+Reaction+Detection+High-performance+Liquid+Chromatography.">Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+flow+chromatography+for+rapid+post+column+derivatisations:+The+analysis+of+antioxidants+in+natural+products.">Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products.</a> J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

RF-PCD permet le mélange efficace du réactif de dérivatisation avec le post-colonne HPLC effluent sans l&#39;utilisation de bobines de réaction, minimisant ainsi les effets de l&#39;élargissement de bande et améliorer la performance de séparation. Méthodes RF-CPD ont également montré l&#39;amélioration de la réponse du signal par rapport au procédé de détection. Camenzuli et al. 28 a été le premier à signaler l&#39;utilisation de colonnes de flux de réaction avec DPPH •</sup...

Chromatographie haute performance liquide (HPLC) couplée à la colonne après dérivatisation (PCD) est un outil puissant qui est utile dans la résolution d&#39;un certain nombre de questions dans le laboratoire d&#39;analyse. Il peut être utilisé pour détecter des composés qui sont par ailleurs indétectable à la série de détecteurs disponibles 1,2, augmenter le signal de l&#39;analyte cible, ce qui permet aux limites inférieures de détection et la quantification ou de manière sélective 05/03 dérivatiser un analyte cible, afin d&#39;éviter les effets de matrice 6. Les réactions PCD couramment utilisés comprennent la réaction des amines, telles que des acides aminés, avec l&#39; ortho-phthaladehyde 7-9, ou ninhydrine 9,10 11,12 fluorescamine, la dérivatisation d&#39;espèces réactives de l&#39; oxygène (ERO) avec le 2,2-diphényl 1-picrylhydrazil radicaux DPPH (•) ou 13,14 2,2&#39;-azino-bis (acide 3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique (ABTS) 15,16, et l&#39;utilisation du réactif iodure azoture pour dériver du soufre ccomposés ontenant 17,18. Il existe, cependant, de nombreux inconvénients à l&#39;utilisation de réactions de PCD avec des systèmes HPLC 6. Parmi ceux - ci principalement l&#39;utilisation de bobines de réaction entre le point d&#39;addition du réactif de dérivatisation (s) et le détecteur, ce qui permet le temps de mélange et la réaction se produise 8. Ces réactions boucles ont souvent des volumes de 500 ul ou plus, ce qui est important par rapport au volume du reste du système HPLC 19. L&#39;utilisation de ces réactions à volume élevé entraîne une augmentation de boucles élargissement du pic par rapport à celle qui serait observée en l&#39;absence de la boucle de réaction. Il en résulte, des pics plus courts plus larges qui ont des limites plus élevées de quantification et de détection et négativement effets que la résolution chromatographique. Les figures 1 et 2 mettre en évidence la détérioration de la forme des pics qui résultent de l&#39;addition de divers volumes de boucle de réaction post-colonne. cette analysea été réalisée avec une composition de phase mobile de 94% de methanol et de 6% d&#39;eau Milli-Q. Le débit de la phase mobile d&#39;écoulement était de 1 ml / min, le volume d&#39;injection était de 20 ul et l&#39;analyse de la longueur d&#39;onde est de 265 nm. Des bobines de faire varier les volumes morts de 20 pi à 1000 pi ont été insérées entre la colonne et le détecteur pour simuler les effets de la boucle de réaction un volume mort dans les procédés de PCD. Ces boucles ont été préparés à partir d&#39;un tube de diamètre intérieur 0,5 mm en acier inoxydable. L&#39;expérience a été effectuée sur un système HPLC constitué d&#39;un dispositif de commande (SCL-10Avp), un faible gradient de pression de soupape (LCM-10ALVP), une pompe (LC-20ad), un injecteur (SIL-10ADVP), et un détecteur (PDA SPD-M10ADVP). La phase mobile est pompée à travers un dégazeur avant l&#39;introduction dans le système HPLC. La séparation a été effectuée en utilisant un x 4,6 mm id 5 um colonne de 250 mm. Les conditions expérimentales ont été choisies pour être typique de réactions PCD qui ont récemment été publiés dans la littérature. lela plus simple, la configuration du réacteur à colonne de poste le plus commun est appelé un réacteur tubulaire non segmenté qui est effectivement un long tube mince à travers lequel le liquide peut couler et la réaction peut avoir lieu. Dans ce pic système élargissement dépend non seulement sur ​​le volume mort ajouté au système, mais aussi le diamètre intérieur du tube , comme mis en évidence par Iijima et al. , 8. En outre, la géométrie de la bobine joue un rôle dans la marque élargissement observée. Stewart a indiqué que 20 l&#39; enroulement du réacteur modifie les profils d&#39;écoulement secondaire, ce qui entraîne un meilleur mélange, ce qui signifie que le volume mort peut être réduite au minimum. Il a été déclaré que l&#39; élargissement des pics est pas significative lors de l&#39; utilisation d&#39; un tube ouvert tricoté bobine 21. Lors de l&#39;élargissement du pic est trop grande, d&#39; autres types de réacteurs peuvent également être considérés 20,22. Ceux-ci peuvent comprendre des réacteurs à lit ou réacteurs à écoulement segmenté. Ces réacteurs sont particulièrement utiles pour des réactions lentes qui seraient autrement require grande réaction des boucles. Comme réacteurs tubulaires non-segmentés sont les types les plus courants de réacteurs utilisés dans les applications PCD, le reste de cet article traite de ce type de configuration du réacteur. La conception de la colonne d&#39;écoulement de réaction (RF) comprend un raccord d&#39;extrémité à orifices multiples qui permet la phase mobile pour sortir (ou entrée) de la colonne à travers un seul port situé dans la zone centrale radiale de la colonne ou trois ports situés à l&#39;extérieur région de paroi de la colonne (voir figure 3). Ces deux courants sont séparés au moyen d&#39;un raccord d&#39;extrémité contenant une fritte poreuse centrale qui est entourée par un anneau imperméable qui est à son tour entourée par une fritte poreuse externe qui se prolonge vers la paroi de la colonne. En raison de l&#39;écoulement imperméable bague de croix centrale est pas possible entre les deux régions poreuses. Au cours de la Chromatographie d&#39;écoulement de réaction, le réactif (s) de dérivation sont pompés à l&#39;encontre du sens d&#39;écoulement de la phase mobile dans une ou two des orifices extérieurs de la colonne d&#39;écoulement de réaction. L&#39;éluant de la colonne est mélangée avec le réactif (s) de dérivatisation dans la fritte externe et transmis au détecteur à travers un orifice externe libre. écoulement de réaction peut être utilisé soit pour un dérivé réactif unique (1 port du réactif de dérivatisation, 1 port pour passer l&#39;éluant de la colonne au détecteur et 1 port bloqué) ou d&#39;un système réactif à deux (2 ports pour les réactifs de dérivatisation et 1 port passer la colonne éluant au détecteur). Le débit du courant central peut soit être utilisé pour détecter l&#39;éluant de la colonne dérivatisé, la détection efficace de multiplexage 23, ou passé à perdre. Une technique de réglage principal qui est disponible lors de l&#39;exécution chromatographie RF-CPD est le rapport entre les flux centraux et périphériques. Le rapport optimal pour chaque dérivatisation dépend d&#39;un certain nombre de facteurs, tels que l&#39;écoulement central sera détecté ou transmis à déchets. Par conséquent, une fois que le rapport optimal a été déterminé, Il faut veiller à ce que le rapport de débit correct est réalisé avant chaque exécution en cours d&#39;exécution. Il a été constaté que l&#39;utilisation d&#39;une fritte pour mélanger le courant colonne d&#39;éluant et le réactif de dérivatisation dans les résultats RF-CPD dans un mélange plus efficace par rapport à des techniques de mélange classiques qui emploient typiquement une pièce en T à zéro du volume mort ou de faible volume mort W- pièce à mélanger les deux courants. Ceci a permis l&#39;utilisation de relativement petites boucles de réaction, voire la suppression de la boucle de réaction au total. La diminution des résultats de la taille de réaction en boucle pics plus par rapport aux méthodes traditionnelles de dérivatisation post-colonne. Cela signifie que, en dépit du fait que la totalité de l&#39;éluant de la colonne est dérivatisé, un plus grand rapport signal sur bruit sont observés et donc des limites inférieures de détection et la quantification peut être réalisée. Chromatographie d&#39;écoulement de réaction a été mis au point pour surmonter les difficultés d&#39;adaptation de la réaction de CPDs aux colonnes modernes de CLHP et de systèmes, en particulier la perte d&#39;efficacité causée par l&#39;élargissement de bande en raison de grands volumes morts après des colonnes causées par la nécessité d&#39;employer la réaction de grand volume boucles. Les procédés de mélange plus efficaces RF-PCD PCD par rapport au conventionnel signifie que le volume de la boucle de réaction inférieures peuvent être employées conduisant à une augmentation de l&#39;efficacité de la séparation observée. Par ailleurs Chromatographie RF-PCD montre à la fois le signal augmenté et diminué de bruit par rapport aux techniques de PCD classiques aboutissant à des limites inférieures de détection et la quantification par rapport aux méthodes de PCD classiques. Un autre avantage de la CPD-RF par rapport aux méthodes classiques de la CPD est la capacité à surveiller le courant dérivatisé qui est élué à partir de l&#39;orifice central de la colonne HF ainsi que le courant dérivé qui est élué à partir de la région périphérique de la colonne. RF-PCD est relativement nouvelle mais prometteuse technique qui affiche de nombreux avantages par rapport aux méthodes traditionnelles de PCD. <p class="jove_content"&gt; Connexion de la colonne HF est réalisée pratiquement de la même manière qu&#39;une colonne de HPLC classique avec la différence majeure étant le nombre de raccords d&#39;extrémité sur une colonne RF. Les raccords utilisés pour connecter une colonne de HPLC standard pour le système HPLC peuvent être utilisés pour connecter une colonne RF au système HPLC.

<table><tbody><tr><td>HPLC instrument</td><td>Agilent</td><td>1290 Series HPLC</td><td></td></tr><tr><td>Additional Pump(s) for derivatization system</td><td>Shimadzu</td><td>LC-20A</td><td></td></tr><tr><td>RF colum</td><td></td><td></td><td>Non-commercial</td></tr><tr><td>PEEK tubing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z227307</td><td></td></tr><tr><td>Column stoppers</td><td></td><td></td><td>Provided with column</td></tr><tr><td>PEEK tube cutter</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z290882</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Scale Balance</td><td></td><td></td><td>4-point analytical balance</td></tr><tr><td>Stop watch</td><td></td><td></td><td>Non-Scientific equiptment</td></tr><tr><td>Eluent collection vials</td><td></td><td></td><td>Any Small vial with a flat bottom will do, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, HPLC vials</td></tr><tr><td>HPLC Vials</td><td></td><td></td><td>Will depend on instrument used</td></tr><tr><td>Vessels for mobile phase and derivatization solution(s)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z232211</td><td></td></tr><tr><td>General Laboratory glassware</td><td></td><td></td><td>Volumetric Flasks, pippettes, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt; Quantity and volumes will depend on sample preparation method.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>DPPH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9132</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17836</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320145</td><td>Corrosive</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9015</td><td></td></tr><tr><td>4-aminoantipyrene&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics BVBA</td><td>AC103151000</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide&amp;nbsp;</td><td>AnalaR</td><td>B10204-30</td><td></td></tr></tbody></table>

post column derivatization using reaction flow high performance liquid chromatography columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

La première méthode PCD qui a été adapté pour être utilisé par RF-PCD est la dérivatisation d&#39;antioxydants en utilisant le radical 2,2-diphényl-1-picrylhydrazil (DPPH •) 24. Cette réaction a été introduit par Koleva et al. , 25 et a été largement utilisée depuis. La détection repose sur la décoloration du DPPH • radicalaire en présence d&#39;espèces réactives de l&#39; oxygène, d&#39; où la présence d&#39;anti - oxydants se traduit par u...

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Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Poster Colonne dérivatisation en utilisant la réaction Colonnes flux chromatographie liquide haute performance

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

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Principles of Chromatography

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15.0K vues.  University of Western Sydney. A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Vidéo: Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Tuning une colonne sectorielle écoulement parallèle et Activation de la détection multiplexée

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Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Rideau Colonne Débit: Optimisation de l&#39;efficacité et sensibilité

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A Robust Method for Packing High Resolution C18 RP-nano-HPLC Columns

The high complexity prevalent in biological samples requires chromatographic separations with high sensitivity and resolution to be effectively analyzed. Here we introduce a robust, reproducible and inexpensive protocol for preparation of a nano-flow reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) columns for on-line separation of analytical peptides before introduction into and detection by a mass-spectrometer in traditional bottom-up proteomics workflows. Depending on the goal of the experiment and the chemical properties of the analytes being separated, optimal column parameters may differ in their internal or outer diameters, length, particle size, pore size, chemistry of stationary phase particles, and the presence or absence of an integrated electrospray emitter at the tip. An in-house column packing system not only enables the rapid fabrication of columns with the desired properties but also dramatically reduces the cost of the process. The optimized protocol for packing a C18 AQ (aqueous) fused silica column discussed here is compatible with a wide range of liquid chromatographic instruments for achieving effective separation of analytes.

Here, we present and evaluate a protocol for making low cost reversed phase nano-flow liquid chromatography columns for peptide characterization using LC-MS/MS proteomic workflows.

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Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. However, capillary columns are much less robust in comparison to their higher flow countertypes. Because of easy contamination and blocking, they often need replacement. That makes them a markedly expensive part of the total LC-MS analysis cost. In-house packing of UHPLC capillary columns saves a lot of money and allows customization. However, the standard packing procedure in the 100-bar pressure bomb works well only for HPLC columns but is too slow for UHPLC sorbents. Here we provide a description of an optimized FlashPack protocol applied to the same 100-bar pressure bomb setup. The method is based on packing from ultra-high sorbent concentration slurry and is developed for in-house manufacturing of UHPLC capillary columns of unlimited length in reasonable time.

Here we present a protocol for the optimized FlashPack capillary column packing procedure. Application of an optimized protocol to a common 100-bar pressure bomb setup allows 10-times faster packing and manufacturing of long ultra-high performance capillary columns.

Fabrication simple de colonnes capillaires ultra-haute performance en interne avec l’approche FlashPack

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High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Source: Dr. Paul Bower - Purdue University
High-performance liquid chromatography (HPLC) is an important analytical method commonly used to separate and quantify components of liquid samples. In this technique, a solution (first phase) is pumped through a column that contains a packing of small porous particles with a second phase bound to the surface. The different solubilities of the sample components in the two phases cause the components to move through the column with different average velocities, thus creating a separation of these components. The pumped solution is called the mobile phase, while the phase in the column is called the stationary phase.
There are several modes of liquid chromatography, depending upon the type of stationary and/or mobile phase employed. This experiment uses reversed-phase chromatography, where the stationary phase is non-polar, and the mobile phase is polar. The stationary phase to be employed is C18 hydrocarbon groups bonded to 3-&#181;m silica particles, while the mobile phase is an aqueous buffer with a polar organic modifier (acetonitrile) added to vary its eluting strength. In this form, the silica can be used for samples that are water-soluble, providing a broad range of applications. In this experiment, the mixtures of three components frequently found in diet soft drinks (namely caffeine, benzoate, and aspartame) are separated. Seven prepared solutions containing known amounts of the three species are used, and their chromatograms are then recorded.

Operation of High-Performance Liquid Chromatography HPLC

La chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP)

Source: Dr. Paul Bower - Purdue University
High-performance liquid chromatography (HPLC) is an important analytical method commonly used to separate and ...

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Chimie analytique

Column Chromatography

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Column chromatography is one of the most useful techniques for purifying compounds. This technique utilizes a stationary phase, which is packed in a column, and a mobile phase that passes through the column. This technique exploits the differences in polarity between compounds, allowing the molecules to be facilely separated.1 The two most common stationary phases for column chromatography are silica gel (SiO2) and alumina (Al2O3), with the most commonly used mobile phases being organic solvents.2 The solvent(s) chosen for the mobile phase are dependent on the polarity of the molecules being purified. Typically more polar compounds require more polar solvents in order to facilitate the passage of the molecules through the stationary phase. Once the purification process has been completed&#160;the solvent can be removed from the collected fractions using a rotary evaporator to yield the isolated material.

Column Chromatography: Principle, Separation of Compounds from a Mixture

Chromatographie sur colonne

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Chimie organique

Principles Of Column Chromatography

The chromatography technique was first invented in 1901 by Michael S. Tswett, a Russian botanist, to separate plant pigments using organic solvents. Further, in 1941, Archer John Porter Martin and R. L. M. Synge modified the technique by packing silica gel into a column. A mixture of amino acids was then separated on the packed column using chloroform and water mixture as the mobile phase. This was the first report on column chromatography. At present, column chromatography is a widely used technique for separating various types of compounds from a sample mixture.
Factors Influencing Efficient Separation of Proteins 
Various parameters like column material, packing, and operational conditions such as flow rates and temperature determine the efficiency of separation by column chromatography.
The choice of column material or matrix determines the extent of interaction with the sample. The matrix material must be tightly and uniformly packed in the column. Air bubbles, debris, large particles, and precipitates interfere with the uniform flow of the solvent through the column, affecting its separation efficiency. The column should also be free from particulate matter.
The sample injected into the column should be clear and free from aggregates that might clog the column, hindering solvent flow. The flow rate of solvent also affects the separation. Very high or very low flow rates of solvents result in inefficient separation of compounds and impure preparations. Very high rates may also disturb the column packing, affecting process efficiency. In addition, the composition of elution buffer is also an important factor. It should be non-corrosive and compatible with the sample and also the column material to prevent in situ precipitation or dissolution.
Another operational parameter, temperature, also plays an important role in the process. It decides the stability of the sample, column material, and solvent buffer. Also, a constant temperature throughout the column efficiently resolves compounds. After completing the separation process, the columns must be washed thoroughly by repeatedly passing a suitable solvent to avoid sample contamination in further runs. Occasionally, the solvent is passed in a column in the reverse direction to remove any clogged material.
Limitations
Though a very widely used technique, the method still has some limitations. It is a very time-consuming method as the flow rates need to be slower for better resolution of the compounds. Also, large quantities of highly pure solvents required in the mobile phase make the process expensive. This also raises the scaling-up cost when higher yields of pure compounds are needed.

Principes de la chromatographie sur colonne

The chromatography technique was first invented in 1901 by Michael S. Tswett, a Russian botanist, to separate plant pigments using organic solvents. ...

Biologie Cellulaire

Unité 1

Analyzing Cells and Proteins

TERMES ET CONCEPTS CLÉS

Types Of Column Chromatography

The stability and compatibility of column material with samples are crucial for efficient purification in chromatographic techniques. Various operating parameters such as pH, temperature, or solvent affect the packing of the column material, thereby determining the purification efficiency. The choice of column material also plays an essential role in deciding the operating parameters and can be modified based on the proteins that need to be purified.
Gel Filtration Chromatography 
When the protein&#39;s chemical nature is unknown, gel filtration chromatography is used for purification based on size. Matrices such as agarose, polyacrylamide, dextran derivatives, or silica beads are used for low-pressure systems, whereas polymeric resins are used for higher flow rates. The varying degree of cross-linking of these polymeric materials determines the pore size of the matrix, which decides the size range of proteins that can be separated.
Ion Exchange Chromatography
Ion-exchange chromatography can purify proteins based on their net charge at a particular pH determined by their isoelectric point or pI. The net charge on matrix resin is used to purify oppositely charged proteins by replacing the cations or anions from the matrix resin with the charged proteins. The resins are categorized based on the type of ion that is exchanged &#8212; positively charged proteins replace cations from cation-exchange resins, and vice versa. Strong ion exchangers with stability over a wide range of buffer pH include quaternary ammonium, sulfonate, and sulfopropyl resins. In contrast, weak ion exchangers that are effective only in a narrow pH range include diethyl aminoethyl (DEAE) or carboxymethyl (CM) resins.
Affinity Chromatography
Affinity chromatography involves immobilizing protein-specific antibodies or enzyme-specific substrates to the column material, usually agarose beads. For example, a column with the immobilized antibody of choice is prepared to separate specific antigens. When the mixed antigen sample is passed through the&#160; column, the target antigens bind to the immobilized antibodies and separate from the mixture. To separate recombinant proteins tagged with enzymes such as beta-galactosidase, the corresponding substrate Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG) is immobilized on the column to purify the enzyme.
High-pressure liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography (GC) are the most commonly used column chromatography techniques. In HPLC, the solvent flows at high pressure through a tightly packed column that improves efficiency. Gas chromatography analyzes volatile compounds by converting them to their gaseous forms upon heating. The volatilized sample is pushed through the column by inert gasses such as nitrogen and helium.

Types de chromatographie sur colonne

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High-Performance Liquid Chromatography: Introduction

High-performance liquid chromatography(HPLC), formerly referred to as High-pressure liquid chromatography, is a powerful technique used to separate, identify, and quantify components in complex mixtures. The term &#34;high pressure&#34; refers to using high pressure to push the liquid mobile phase through the tightly packed columns.
In HPLC, two phases play a critical role in the separation process:
<ol>
	<li>Mobile Phase: This is a liquid solvent that flows through the system, carrying the sample with it. The solvent is chosen based on its polarity to optimize the interaction with the analytes and the stationary phase. The &#34;polarity index&#34; serves as a guide to selecting the suitable solvent for separation.</li>
	<li>Stationary Phase: The stationary phase is a solid material, often silica-based, packed within the column. In reverse-phase HPLC, the stationary phase is typically derivatized silica, such as octadecyl (C18) silica. The small particle size of the packed material creates a high surface area, enhancing interactions with the analytes. To reduce undesirable interactions, such as those with unreacted silanol groups, the stationary phase is often end-capped with reagents like trimethylchlorosilane</li>
</ol>
Separation occurs as the analytes interact differently with both the mobile and stationary phases, depending on their chemical properties, which leads to differential migration through the column.
Sometimes, solute molecules bind irreversibly to the stationary phase, clogging the analytical column and decreasing its performance. To prevent this, a guard column is placed before the analytical column. A precolumn called a scavenger column may also be placed between the mobile phase reservoir and the injector. This ensures that the solvent enters the analytical column, which is already saturated with silica from the scavenger column, preventing unwanted reactions and extending the lifetime of the analytical column.
After the separation, analytes are detected by various detectors, depending on the characteristics of the compounds. The results are visualized as chromatograms, with peaks corresponding to the different components of the mixture. This provides both qualitative and quantitative data about the sample.

Chromatographie liquide à haute performance : Introduction

High-performance liquid chromatography(HPLC), formerly referred to as High-pressure liquid chromatography, is a powerful technique used to separate, ...

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Résumé

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La chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP)

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Chromatographie liquide à haute performance : Introduction

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