Fabricación interna sencilla de columnas capilares de ultra alto rendimiento con el enfoque FlashPack. El objetivo de este procedimiento es introducir un protocolo optimizado para el empaquetado rápido y fácil de columna capilar de ultra alto rendimiento para el análisis proteómico LC-MS. La proteómica moderna se basa en la espectrometría de masas junto con la cromatografía líquida capilar de ultra alto rendimiento.
La separación de péptidos se realiza principalmente en columnas capilares con un diámetro interno de 75 micrómetros. A la par con los productos comerciales, es posible preparar columnas capilares internamente. Las columnas preparadas a medida demuestran cualidades de separación similares a las analogías comerciales, al tiempo que ahorran mucho dinero y permiten la personalización del sorbente y el tamaño de la columna.
Aquí demostramos un procedimiento de embalaje optimizado para la fabricación interna de columnas capilares, que llamamos FlashPack. La idea detrás de la optimización es empacar a partir de una concentración de lodo de sorbente muy alta, sin dejar de usar la misma configuración común de empaque de bombas de presión de 100 bar. Esto requiere la ruptura continua de los grupos de sorbentes, que se forman alrededor de la entrada de la columna a alta concentración de sorbente y evitan que el nuevo material sorbente ingrese al capilar.
Técnicamente, lo logramos mediante el uso de una barra magnética como martillo, calentando y moviéndonos constantemente alrededor del capilar dentro del cable sorbente. FlashPack aplicado correctamente aumenta la tasa de embalaje hasta 10 veces. Eso lo hace adecuado para empacar sorbentes de ultra alto rendimiento de tamaño micro metricbeat más suave y para fabricar columnas muy largas de hasta un metro de longitud en tiempos razonables.
El procedimiento de preparación de columnas consta de cinco pasos. Tres pasos preparatorios, que incluyen el montaje de la estación de embalaje y la preparación de purines capilares y sorbentes. Luego, el capilar se empaqueta primero en la bomba de presión a una presión de 60 a 100 bar.
Le sigue la conexión del capilar envasado al sistema HPLC, empaquetando el sorbente a alta presión y el corte en columna al tamaño. El procedimiento FlashPack requiere que se realicen cambios en los pasos tres y cuatro del protocolo común. En primer lugar, preparamos una estación de embalaje.
Consiste en un tanque de gas nitrógeno con al menos 50 bares de presión de salida. El tanque está conectado a la válvula de ventilación de la bomba de presión, que se coloca en el agitador magnético. La salida de la válvula de ventilación se inserta en una botella de agua a través de un capilar ID PEEK estrecho, lo que permite un control fino de la despresurización.
A continuación, preparamos un capilar. El embalaje se puede hacer en un capilar fritado con una fritada de vidrio integrada formada a partir de Kasil y formamida. Otra opción es empacar en un capilar tirado preparado por un arrancador láser de sutter.
El capilar debe hacerse de 10 a 15 centímetros más largo que la longitud de la columna prevista. El siguiente video está preparado sobre el ejemplo de un empaque capilar emisor tirado. Proteja un extremo del emisor tirado con una punta de pipeta de carga de gel cortada.
Para obtener más información, consulte la versión de texto del manuscrito. La siguiente etapa es la preparación de purines sorbentes. Primero, coloque alrededor de 50 miligramos de sorbente seco en un tubo de centrífuga de 1.5 mililitros.
Ese será un vial de sorbente de stock. Este video fue preparado con el uso de Reprosil Pur C18 AQ 1.9 micro sorbente métrico del Dr.Maisch. Agregue un mililitro de metanol en el vial de sorbente de stock.
Vórtice durante 10 segundos. Y sonicar en un baño de sonicación durante otros 10 segundos. Deje que el sorbente se remoje bien durante 20 a 30 minutos, luego vórtice y sonice una vez más.
Prepare un vial de sorbente que funcione. Debe ser un vial de fondo cónico que encaje en la bomba. Puede ser otro tubo de centrífuga de 1,5 mililitros o cualquier otro vial dependiendo del diseño particular de la bomba de presión.
Utilizamos un tubo de tapón de rosca cónico cónico con faldón cortado a la altura de la bomba de presión. Vuelva a suspender el sorbente en el vial de sorbente de stock y transfiera 500 microlitros al vial de sorbente de trabajo junto con una barra magnética de dos por tres milímetros de tamaño. Cubra el vial de trabajo a un mililitro con metanol.
Deje que el vial de trabajo se mantenga sobre la mesa durante 10 minutos para que el sorbente se asiente por gravedad. El resultado de este paso debe ser un vial de fondo cónico con la capa inferior de sorbente suelto de alrededor de cuatro milímetros de altura. Si la capa es demasiado baja, y un poco más de sorbente del vial de stock.
Por lo tanto, el vial de trabajo preparado está destinado a la preparación de múltiples columnas durante meses. Si el vial de sorbente en funcionamiento permanece sin agitar durante más de dos horas, debe ser vórtice, sonicado y asentado por gravedad nuevamente antes de empacar. Cuando todo esté preparado, proceda a la etapa cuatro, empacando la bomba de presión.
Siempre use gafas protectoras cuando trabaje con capilares de sílice fusionados y la bomba de presión. Al mismo tiempo, no se recomiendan guantes protectores. Reducen severamente el sentido del tacto requerido para el manejo adecuado de capilares de pequeño diámetro y conducen a errores.
Coloque el vial de sorbente en la bomba de presión y fije todos los nudos con fuerza. Comience la rotación a 60 a 100 rondas por minuto, inserte el capilar emisor fritado o tirado en la bomba. Empuje hasta la parte inferior del vial, luego levántelo de dos a tres milímetros y fije el nudo.
Aplicar la fuerza mínima requerida para fijar el capilar. Compruebe que el capilar está correctamente fijado. Debe ser imposible mover el capilar sacándolo a mano.
Muy lentamente, abra la válvula de la bomba de presión mientras mantiene el extremo abierto del capilar apuntando lejos de su cara. Observe los pasos iniciales del proceso de embalaje. Inmediatamente después de la presurización, el sorbente llena el capilar y se vuelve no transparente durante toda la longitud.
Tan pronto como el sorbente comienza a empacarse dentro del extremo distal, la contrapresión aumenta, el flujo se ralentiza y la suspensión de sorbente uniforme dentro del capilar se reforma en varios paquetes de sorbente, separados por espacios libres de sorbente. El sorbente ya empaquetado es visible como una región de crecimiento continuo de color denso. Mantenga las regiones llenas de sorbente para que sean al menos el 70% de la longitud capilar con pequeños huecos libres de sorbente durante toda la duración del proceso de empaque.
Hay varios problemas comunes a tener en cuenta durante el proceso de embalaje. Requieren un ajuste de configuración en vuelo para mantener una entrega eficiente de sorbente en el capilar. El problema más frecuente es cuando el nuevo sorbente deja de entrar en el capilar mientras que el sorbente que ya está dentro sigue moviéndose.
En la mayoría de los casos, la entrada capilar se bloquea mediante grupos de sorbentes autoagregantes. Aplique estos pasos uno por uno hasta que se restaure el flujo de sorbente y, a continuación, omita el resto de los pasos relacionados con el problema. Aumente la velocidad de rotación a 500 disparos por minuto e inmediatamente reduzca a 60 RPM.
La mayoría de las veces restaura el flujo de sorbente. Compruebe que la velocidad de rotación sea de al menos 60 RPM durante el resto del proceso de embalaje. Si no ayuda, ventile brevemente la bomba de embalaje e inmediatamente presiónela de nuevo.
Si no ayuda, o el bloqueo vuelve a ocurrir, reposicione el capilar dentro de la capa sorbente. La ausencia del sorbente puede deberse a que el extremo abierto capilar está demasiado alto por encima de la barra magnética, por lo que el extremo de la columna no lo toca. O el capilar se coloca demasiado bajo y se pega en la parte inferior del vial.
Primero, ventile la bomba por completo, luego afloje la tuerca, empuje el capilar hacia el fondo y luego tire de él dos milímetros hacia atrás. Arregla la tuerca. Abra la válvula para presurizar la bomba y continúe empacando.
Más detalles sobre los problemas de embalaje se describen en la versión de texto del método. Siga empacando la columna hasta que se logre la longitud de la columna objetivo más cinco a siete centímetros. Detenga la rotación y despresurice muy lentamente la bomba.
Abra un poco la válvula de la bomba y espere a que la burbuja estalle dentro de la botella de agua para disminuir. Luego abra la válvula un poco más ancha y espere nuevamente a que la burbuja estalle para disminuir la velocidad. Por lo tanto, en pasos incrementales, libere la presión hasta que no salga gas de la válvula.
No abra la válvula de una sola vez. Conducirá a burbujeos dentro del capilar y el sorbente volverá al vial. Si eso sucede, presione la bomba hacia atrás y espere a que la columna se empaquete nuevamente.
Cuando el gas deje de salir de la válvula de ventilación, saque el capilar empaquetado de la bomba de presión. No deje que la columna se seque. Si no está conectado al sistema HPLC inmediatamente para un embalaje adicional, almacene el capilar envasado sumergiéndolo entero en una solución de etanol al 10%.
Las columnas de HPLC desconectadas se almacenan de la misma manera. Si no se planea más embalaje para hoy, saque el vial de sorbente de la bomba y ciérrelo herméticamente. Guárdalo para más adelante el embalaje de la columna.
Etapa cinco, embalaje de HPLC. Conecte el capilar empaquetado al sistema HPLC a través de la conexión HPLC. Inicie el flujo de disolvente orgánico alto.
Ajuste el flujo de acuerdo con la longitud empaquetada apuntando a alrededor de 300 bares. Para capilares empaquetados de 40 centímetros, use el caudal de 200-300 litros normales por minuto. Esté atento al sorbente suelto dentro del capilar que se está empaquetando, lo que aumenta la longitud total del paquete.
Sin detener el flujo, sumerja el cuerpo de la columna dos veces en el baño de sonicación. Es importante sumergir solo una parte del cuerpo de la columna. No sumerja los extremos de la columna y las conexiones capilares.
Cuando el lecho sorbente deje de encogerse, sumerja el cuerpo de la columna en el baño de sonicación dos veces más sin detener el flujo. Ejecute la columna durante 10 minutos adicionales a 300 bares. Detenga el flujo, espere a que la presión baje a menos de tres bares y desconecte la columna.
Inspeccione visualmente la columna para la falta de huecos y decoloraciones. Si se encuentra alguno, la sonicación bajo el flujo se puede repetir. Para experimentos críticos, considere hacer una nueva columna.
Corte la columna a la longitud deseada. El corte realizado correctamente es un requisito previo para la eficiencia de la columna. Haga una muesca en el recubrimiento de poliamida con el escriba.
Rompe parcialmente el capilar y separa dos piezas. Pulir la parte delantera de la columna en una oblea de cerámica o con película de lapping. Vuelva a conectar la columna al sistema LC mediante una conexión de ultra alta presión.
Inicie el caudal de trabajo al 2%B. El caudal de trabajo se ajusta de acuerdo con los parámetros de la columna. Por ejemplo, las columnas de identificación de 100 micrómetros se ejecutan a 500 nanolitros por minuto.
Espere a que la presión se equilibre y verifique la contrapresión de la columna. Una columna correctamente preparada da contrapresión proporcional a su longitud y características de sorbente. Por ejemplo, la columna capilar de 30 centímetros empaquetada con dos micrómetros de sorbente tiene una contrapresión de 450 a 500 bares al 2% de disolvente B.Si la columna producida da una contrapresión dentro del rango esperado, está lista para usar.
Si la contrapresión está fuera del rango esperado, algo está mal con la columna o con el sistema LC. El embalaje con FlashPack produce un embalaje capilar de 50 centímetros con 1,9 micrómetros de sorbente en menos de una hora a una presión de embalaje de 100 bar. Como ejemplo, producimos una columna de ultra alta presión ID de 30 centímetros y 100 micrómetros empaquetada en un capilar emisor tirado con sorbente ReprosilPur C18 AQ de 1,9 micrómetros.
El embalaje se realizó a 60 barras en capilar emisor tirado de 50 centímetros de largo. El capilar se empaquetó a 40 centímetros en 40 minutos con algo más de sorbente dentro del capilar no empaquetado. El capilar empaquetado se conectó al sistema HPLC y se ejecutó a 300 nanolitros por minuto con disolvente B, que en nuestro caso fue 80% acetonitrilo, 0.1% ácido fórmico.
La longitud final del paquete fue de 43 centímetros. La columna fue cortada 30 centímetros. A 500 nanolitros por minuto de flujo de trabajo con 99% de disolvente B, la columna dio la contrapresión de 275 bares, que está cerca del valor esperado.
Para probar la columna, separamos 50 fmol de una digestión tríptica de la proteína del citocromo C en un gradiente de 15 minutos de 2-50% B. Los picos cromatográficos fueron altamente simétricos con un cola mínimo. El promedio de FWHM fue de alrededor de tres segundos.
El protocolo descrito es capaz de producir columnas UHPLC en un embalaje común de 100 bares configurado en un tiempo razonable. Las columnas cortas de HPLC o UPLC se pueden empacar en minutos, mientras que las columnas largas de 30-50 centímetros se empaquetan en menos de una hora. El método es eficiente para empaquetar sorbentes con RP y cualquier otra química en cualquier ID de columna.
Las columnas producidas son reproduciblemente tan efectivas como cualquier otra columna comercial de tamaño similar y parámetros sorbentes.
