Während der Kalzium-Bildgebungsaufzeichnung bewegen sich die Zellen in alle Richtungen. Es wurden viele Werkzeuge entwickelt, um die X- und Y-Bewegung zu korrigieren, aber auch die Bewegung auf der Z-Achse muss explizit diagnostiziert und korrigiert werden. TACI ist ein benutzerfreundliches Open-Source-Image-J-Plug-in.
Es prüft die Z-Drift und analysiert die 3D-Calcium-Bildgebung mit Bewegung in alle Richtungen. Nachdem Sie die Fliegenlarven vorbereitet haben, spülen Sie sie dreimal in PBS aus. Pipettieren Sie 75 Mikroliter PBS in die Mitte eines Objektträgers.
Setzen Sie ein oder zwei Larven in PBS ein und platzieren Sie die Thermoelement-Mikrofonsonde in der Nähe der Larven. Decken Sie die Larven und die Thermoelement-Mikrosonde mit einem Glasdeckglas ab und versiegeln Sie es mit Nagellack. Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch.
Finden Sie den Fokus mit einem 25-fachen Objektiv und platzieren Sie den thermoelektrischen Kühler auf dem Objektträger. Konzentrieren Sie sich in konfokaler Software auf die interessierenden fluoreszierenden Zellen. Passen Sie die Laserleistung an, um eine Übersättigung zu vermeiden, und stellen Sie die erste und letzte Schichtposition in der Z-Stapeleinstellung ein.
Starten Sie gleichzeitig das Scannen des Z-Stapels und die Temperaturaufzeichnung. Steuern Sie das Netzteil, das den Peltier mit Strom versorgt, um die Oberflächentemperatur des Peltiers zu ändern. Stoppen Sie anschließend das Scannen des Z-Stapels und die Temperaturaufzeichnung.
Nachdem Sie das TACI Calcium Imaging Dot Jar heruntergeladen haben, installieren Sie das Plugin in Fidschi, indem Sie in der Menüleiste auf Plugins klicken und anschließend im Dropdown-Menü installieren. Starten Sie dann Fidschi neu und führen Sie das Plugin aus, indem Sie auf Plugins klicken und TACI Calcium Imaging auswählen. Wählen Sie die Umbenennungsfunktion, um die TIFF-Dateinamen in die gewünschte Struktur umzuwandeln.
Wählen Sie den Ordner aus, in dem die TIFF-Bilder umbenannt werden sollen, indem Sie auf Ordner durchsuchen klicken und warten, bis der Dateiname automatisch ausgefüllt wird. Überprüfen Sie die maximale T-Position und die maximale Z-Position. Stellen Sie sicher, dass die Parameterwerte für die max. T-Position und die max. Z-Position alle Ziffern enthalten.
Geben Sie die Position der einzelnen Parameter der Reihe nach ein. Wenn die TIFF-Dateinamen den Ausdruck und den Kanal nicht enthalten, lassen Sie den entsprechenden Parameterwert leer und wählen Sie NA in der Reihenfolge aus. Wenn ein Posttext vorhanden ist, wird er dem Parameter posttext hinzugefügt.
Klicken Sie auf Umbenennen, um einen Ordner mit demselben Namen zu erstellen, gefolgt von einem Unterstrich R.Beachten Sie, dass die TIFF-Dateinamen im Ordner umstrukturiert wurden, um mit der Funktion "Organisieren" kompatibel zu sein. Verwenden Sie als Nächstes die Funktion organisieren, um die TIFF-Bilder an derselben Z-Position in einem Ordner zu speichern. Wählen Sie den Ordner aus, in dem die T-Bilder organisiert werden sollen, indem Sie auf Ordner durchsuchen klicken.
Wenn die Parameter-CSV-Datei vorhanden ist, warten Sie, bis die Parameterwerte automatisch ausgefüllt wurden. Wenn die Parameter-CSV-Datei nicht vorhanden ist, geben Sie die Parameterwerte manuell ein. Stellen Sie sicher, dass die Parameterwerte von Phase und Kanal Buchstaben enthalten, falls vorhanden, während die Parameterwerte der T-Position und der Z-Position die größten Zahlen der T- und Z-Positionen sein sollten.
Wenn die Namen der Bilddateien die Phase oder den Kanal nicht enthalten, geben Sie NA ein. Erstellen Sie dann bei Bedarf Graustufen-TIFF-Bilder, indem Sie sicherstellen, dass das Kontrollkästchen R-Bilder grau deaktiviert ist. Klicken Sie auf Organisieren, um einen Ordner mit demselben Namen gefolgt von grauen Unterstrichstapeln zu erstellen und Ordner mit demselben Namen gefolgt von Unterstrich und der Z-Positionsnummer im Ordner zu generieren. Beachten Sie dann, dass die TIFF-Dateien nach Z-Positionen in entsprechende Ordner sortiert sind und dass eine Datei mit dem Namen param dot CSV generiert wird, in der die Parameter und ihre Werte zu finden sind.
Verwenden Sie nun Trackmate in Fidschi, um die Fluoreszenzintensitäten der interessierenden Zellen aus jeder Z-Position zu extrahieren. Öffnen Sie die TIFF-Bilder in einem Z-Positionsordner von Fidschi und führen Sie TRACKMATE aus, indem Sie auf Plugins klicken und Tracking auswählen, gefolgt von Trackmate. Passen Sie die Parameter mit DOG- oder LOG-Detektoren an.
Ändern Sie den Schwellenwert für den Blobdurchmesser und den Medianfilter. Stellen Sie die Filter ein, um die irrelevanten Signale zu entfernen. Legen Sie den maximalen Verbindungsabstand, den maximalen Abstand zum Schließen des Spalts und den maximalen Rahmenabstand zum Schließen des Spalts fest.
Exportieren Sie die Fluoreszenzintensitäten der interessierenden Regionen in eine CSV-Datei. Erstellen Sie für jedes Neuron einen Ordner und benennen Sie ihn mit der Neuronennummer. Ausgehend von Neuron Null.
Speichern Sie die CSV-Dateien mit den Fluoreszenzinformationen des entsprechenden Neurons im Ordner. Benennen Sie die CSV-Dateien als mittlere Intensität Z Positionsnummer Punkt CSV und enthalten Sie mindestens zwei Spalten, Position T und mittlere Intensität oder mittlere Intensität Kanal eins. Erstellen Sie die CSV-Datei mit dem Punkt der Hintergrundunterstrichliste, die die Informationen aller Neuronen in einem bestimmten Format enthält, beginnend mit Neuron Null.
Geben Sie die Neuronennummern ein, z. B. Neuron Null in Zeile eins. Geben Sie dann die Hintergrundintensität für jede analysierte Z-Position an. Wenn vier Z-Positionen für Neuron Null analysiert werden, geben Sie vier Hintergrundintensitätswerte unterhalb von Neuron Null ein.
Speichern Sie die erstellte Hintergrundliste, die CSV-Datei und die Ordner, die die CSV-Dateien der Fluoreszenzinformationen enthalten, in einem Ordner. Öffnen Sie TACI und wählen Sie die Extraktionsfunktion. Wählen Sie dann den Ordner aus, indem Sie auf Dateien durchsuchen klicken.
Die Hintergrunddatei wird automatisch ausgefüllt. Füllen Sie die größte Anzahl von T-Positionen für die Anzahl der T-Positionen aus. Klicken Sie auf Extrahieren, um einen Ergebnisordner zu erstellen, der die CSV-Dateien und -Diagramme jedes Neurons enthält.
Die CSV-Dateien enthalten die maximale Fluoreszenzintensität und Delta F über Delta Null an jeder T-Position. Die Diagramme sind Liniendiagramme von Delta-F-über-F-Null- gegenüber T-Positionen. Verwenden Sie die Zusammenführungsfunktion, um das Delta F über F Null von allen Neuronen zu mitteln.
Berechnen Sie das REM und zeichnen Sie das durchschnittliche Delta F über F Null über T Positionen. Wählen Sie den von der Extraktionsfunktion erstellten Ergebnisordner aus, indem Sie auf Dateien durchsuchen klicken. Geben Sie die Anzahl der T-Positionen mit der größten Anzahl von T-Positionen ein.
Klicken Sie auf Zusammenführen, um einen Ordner mit zusammengeführten Daten zu erstellen, einschließlich einer CSV-Datei mit zusammengeführtem Unterstrich und einem PNG-Diagramm mit durchschnittlichem Unterstrich DF-Unterstrich F Nullpunkt. Die CSV-Datei enthält den Durchschnitt und die SEM-Delta-Informationen F über F Null an jeder T-Position. Das Diagramm ist ein Liniendiagramm des durchschnittlichen Deltas F über F Null über T Positionen.
Die Kalzium-Bildgebung von kühlen Zellen der Fliegenlarven, die GCaMP sechs M exprimieren, zeigt im inaktiven Zustand bei 27 Grad Celsius kaum Fluoreszenz. Der intrazelluläre Kalziumspiegel stieg jedoch bei 10 Grad Celsius schnell an. Der Kalziumspiegel sank schnell, wenn die Temperatur erhöht wurde.
Die Kalziumbildgebung von Fliegenhirnneuronen, die GCaMP sechs F zum Zeitpunkt 0,1 exprimierten, zeigte Fluoreszenz in vier der sieben Neuronen, und die Intensität dieser Neuronen nahm mit der Zeit ab. In Gegenwart von Oktinal hellten sich mehrere Neuronen auf. Die Fluoreszenz von 10 Neuronen nahm zum Zeitpunkt 92 gleichzeitig zu, was darauf hindeutet, dass diese Pilzneuronen auf octinaler Geruch reagieren.
TACI kann überlappende Zellen trennen. In diesem maximalen Projektionsbild wurden zwei überlappende Neuronen identifiziert. Diese Neuronen wurden in der Orthro-Ansicht getrennt, was darauf hindeutet, dass diese Neuronen in verschiedenen Z-Positionen auftraten.
Die orangefarbene Zelle zeigte das stärkste Signal auf Z sieben, während die blaue Zelle das stärkste Signal auf Z 10 hatte. Die Veränderung der Fluoreszenz dieser beiden Zellen zeigte die verzögerte, aber starke Aktivierung der orangefarbenen Zelle. Während der Extraktion wird der maximale Fluoreszenzwert aller Z-Positionen, in denen ein Neuron auftritt, verwendet, um die Intensität des Neurons bei der entsprechenden Ablagerung darzustellen.
Wenn TACI zur Analyse einer großen Anzahl von Neuronen verwendet wird, muss eine Registrierung über Z-Positionen hinweg in eine neue Funktion aufgenommen werden, die mit Fluoreszenzinformationen organisiert wird. TACI bietet einen benutzerfreundlichen Open-Source-Berechnungsansatz für die 3D-Kapsel-Bildgebungsanalyse, um die Zellbewegung auf der Z-Achse zu überprüfen, wenn einzelne Zellen in mehreren Z-Positionen erscheinen.
