Name: two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices
Uploaded: 2018-03-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Canadian Institutes of Health Research, Natur- und ingenieurwissenschaftlichen Forschung Rat (NSERC Discovery Grant) und der Savoy-Stiftung unterstützt. OC wurde durch ein Ph.d.-Stipendium von NSERC unterstützt.

Alle Versuche wurden gemäß den Richtlinien des Tierschutzes Tier-Schutz-Ausschuss des Université Laval und des Canadian Council on Animal Care durchgeführt.
1. Vorbereitung (Optional: bereiten Sie 1 Tag im Voraus)
<ol><li>Bereiten Sie drei Arten von künstlichen Liquor cerebrospinalis (ACFS) Lösung (Normal, Saccharose und Recovery-Lösungen, 1 L; siehe Tabelle 1). Anpassen die Osmolalität der Lösungen für 300 ± 10 mOsm25 und kühlen der ACFS Saccharose bis zu einem in der Nähe des Gefrierpunktes (0-4 ° C). Hinweis: Die Verwendung von eine natriumarme Schneidelösung (ACFS-Saccharose) hilft die Lebensfähigkeit der Neuronen in den oberflächlichen Schichten des akuten Scheiben26zu bewahren.</li>
	<li>Bereiten Sie 0,75 mL Patch-Lösung, die eine rote Fluorophor (z.B.Alexa-594) enthält und eine grüne synthetische Kalzium-Indikator (z.B.Oregon Green BAPTA-1; siehe Tabelle 1). Biocytin enthalten (siehe Tabelle 1) in die Patch-Lösung, wenn post Hoc morphologische Identifikation der aufgezeichneten Zellen erforderlich ist.</li>
	<li>Anpassen der Osmolalität die Lösung für 280 ± 5 mOsm und pH 7,35 ± 0,5. Halten Sie die Lösung im Kühlschrank oder auf Eis zu allen Zeiten. Hinweis: Wahl des Indikators Kalzium sollte auf die dynamische Bandbreite und die Art der untersuchten Ca2 + Ereignisse ausgesagt werden.</li>
	<li>Mit einer Mikropipette Puller, bereiten Sie Patch Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren (siehe Tabelle der Materialien) mit ≈ 2 µm Tipp (Pipette Widerstand von 3-5 MΩ) und Stimulation Pipetten aus Borosilikat Theta-Glaskapillaren (siehe Tabelle des Materialien) mit 2 bis 5 µm Spitze. Hinweis: Die Puller-Einstellungen, um Pipetten von gleichem Durchmesser und Form werden der Abzieher-Filament-Typ und die Rampe Testergebnisse für eine bestimmte Art von Glas bestimmt.</li>
</ol>(2) hippocampal Slice-Vorbereitung
<ol><li>Die Maus zu betäuben (P13-20; vom Stamm und Geschlecht der Maus wird bestimmt durch die experimentelle Frage) mit 1 mL Isofluran auf ein Papiertuch innerhalb einer Inhalation Narkose Kammer platziert. Wenn das Tier tief betäubt ist, wie ein Mangel an Bewegung und langsame Atmung belegt, entfernen Sie sie aus der Narkose Kammer und enthaupten mit einer Guillotine.</li>
	<li>Setzen Sie den Schädel durch Schneiden Sie die Haut mit einer kleinen Schere von der Rückseite des Schädels an der Nase. Verwenden Sie ein paar kleine Mini-Knochen-Rongeurs, um ein Loch auf der Bregma Ebene zu machen. Dann verwenden Sie die Schere kaudalen, rostral Schnitt entlang der sagittale Naht zu machen. Greifen Sie mit der Rongeurs der Rückseite der einzelnen Schädel Klappe und Aufzug nach oben und nach außen, um den Schädel für jede Hemisphäre zu entfernen.</li>
	<li>Nachdem das Gehirn voll ausgesetzt ist, unterbieten Sie die Sehnerven mit einem kleinen Spatel. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel und steckte es in eine Petrischale mit ständig sauerstoffreiches, kalten ACFS Saccharose (siehe Tabelle 1 für Saccharose-Konzentration).<ol>
<li>Wenn Gewebe aus älteren Mäusen erforderlich ist, führen Sie eine intrakardiale Perfusion mit einer Spritze (25G) gefüllt mit 20 mL eiskaltes ACFS Saccharose vor der Gehirn-Extraktion, um gute Qualität-Scheiben zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hippocampale Scheiben aus dem extrahierten tierischen Gehirn vorzubereiten.<ol>
<li>Lassen Sie die Gehirn Chill für ca. 2 min. Legen Sie ein Stück Filterpapier auf eine Petrischale mit Eis verpackt, das Gehirn auf dem Filterpapier zu übertragen. Die beiden Hemisphären zu sezieren.</li>
		<li>Kleben Sie die sezierten Hemisphären (die Ausrichtung richtet sich nach der experimentellen Ziel koronalen, transversale oder horizontale Scheiben zu erhalten) auf einen Vibratome Tisch und Tauchen Sie ihn in das Vibratome Fach gefüllt mit eiskalten sauerstoffreiches ACFS-Saccharose. Machen Sie 300 µm dicke Scheiben bei einer Temperatur von etwa 1 ° C durch die Verwendung einer Vibratome Kühler oder platzieren das Eis rund um das Vibratome Fach.</li>
		<li>Mit einem flachen Pinsel, reichern sich die Scheiben mit dem Hippocampus (bis zu 6 Scheiben pro Hemisphäre) in ein Bad mit Sauerstoff angereichertes ACFS-Recovery auf 37 ° c erhitzt</li>
		<li>Lassen Sie die Scheiben in der ACFS Recovery-Bad für mindestens 45 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahmen
<ol><li>Platz in einer Badewanne positioniert im Rahmen des Ziels eine hippocampale Scheibe inmitten (Vergrößerung: 40 x, numerische Apertur: 0,8) von einem Laserscanning-zwei-Photonen-Mikroskop. Ständig Durchspülen des Bades mit sauerstoffreichem ACFS-Normal mit einer Rate von 2,5-3 mL/min bei 30-32 ° C erhitzt.</li>
	<li>Verwenden Sie Infrarot-differential Interferenz-Kontrast (IR-DIC) oder Mikroskopie Dodt-SGC, um eine Zelle mit seiner Größe, Form und Position zu finden. Hinweis: Abhängig von der gezielten Neuron Bevölkerung einem transgenen Mausmodell lässt sich leicht Zellen von Interesse finden. In diesem Fall kann dieser Schritt mit einer fluoreszierenden Lichtquelle ersetzt werden.</li>
	<li>Füllen einer Stimulation-Pipette mit einer ACFS-Normal-Lösung enthält die rote Fluorophor (z.B.Alexa-594).</li>
	<li>Stellen Sie die Stimulation-Pipette (angeschlossen an eine elektrische Stimulation-Einheit) auf der Oberseite der Scheibe so ein, dass die Spitze in der gleichen Region wie die Zelle von Interesse ist.</li>
	<li>Setzen Sie nach der Patch-Pipette mit Patch Lösung füllen und Anhängen an eine Leiter Bühne ihn über das Stück, dass seine Spitze direkt oberhalb der Zelle von Interesse ist.</li>
	<li>Passen Sie eine Spritze in eine drei-Wege-Hahn und verbinden Sie es mit der Patch-Pipette durch das Kunststoffrohr. Injizieren Sie konstante Überdruck in der Patch-Pipette (≈ 0,1 mL) mit der Spritze. Halten Sie der Absperrhahn in "schließen" Stellung.</li>
	<li>Das Steuermodul Software Verstärker aktivieren und durch Anklicken des Buttons "VC" Voltage-Clamp-Modus wechseln. Öffnen Sie die Elektrophysiologie Datenerfassungs-Software (z.B., Clampex) für den Erwerb von elektrophysiologischen Signalen zu und klicken Sie auf das Symbol "Membran-Test" haben es ständig aussenden einer quadratischen Spannungsimpuls (5 mV, 10 ms), die notwendig ist, zu überwachen Widerstandsänderungen Pipette.</li>
	<li>Senken Sie die Patch-Pipette, bis es rechts oben auf die gezielte Zelle ist. Bei der Herstellung Kontakt mit der Zellmembran, den Druck durch Drehen der Absperrhahn in der "offenen" Position entfernen. Hinweis: Kontakt mit der Zellmembran wird erkannt, wenn eine geringe Erhöhung der Pipette Widerstand (≈ 0,2 MΩ) sieht man eine kleine Einbuchtung auf der Zelle entsteht durch Überdruck.</li>
	<li>Die Patch-Pipette mit einer leeren Spritze in den Absperrhahn eingebaut, bis die Pipette Widerstand der Software 1 GΩ erreicht zuweisen Sie einen leichten Unterdruck. Im Fenster "Membran-Test" der Datenerfassungs-Software, Klemmen Sie die Zelle bei-60 mV.</li>
	<li>Weiterhin negativen Druck, bis die Zelle geöffnet wird und die gesamte Zelle Konfiguration erreicht. Erkennung von diesem Zellstatus basiert auf die plötzliche Veränderung in der Pipette Widerstand (1 GΩ, 70-500 MΩ je nach Interneuron) und das Aussehen der großen kapazitiven Transienten im Fenster "Membran-Test".</li>
</ol>4. zwei-Photon Ca2 + Imaging
<ol><li>Bei Interesse an der exzitatorischen postsynaptischen Antworten hinzufügen, die GABA-A Rezeptor Blocker Gabazine (10 µM) und der GABA-B -Rezeptor-Blocker CGP55845 (2 µM) in der Badewanne ACFS.</li>
	<li>Im Kontrollmodul Software Verstärker setzen die Patch-Konfiguration an Strom-Klammer durch Klicken auf die Schaltfläche "CC" und Aufzeichnen der Zelle feuern Muster als Reaktion auf somatische Injektionen von depolarisierende Strom (0,8-1,0 nA, 1 s). Warten Sie mindestens 30 min für die Zelle mit den Indikatoren im Patch-Lösung gefüllt werden. Hinweis: Die Zelle feuern Muster und aktiven Eigenschaften lässt sich die Zelle Untertyp zu identifizieren; z. B.schnelle Spick Zellen. Es ist wichtig für die Konzentration der Indikator zur Stabilisierung durch Diffusion vor Beginn der Aufzeichnung Katzen (siehe Tabelle 2 für die Fehlersuche).</li>
	<li>AP-evozierten Katzen<ol>
<li>Starten Sie mithilfe des Bild-Datenerfassungs-Software Importieren von Bildern. Suchen Sie nach einem Dendriten des Interesses über das rote Fluoreszenz-Signal. Um eine sichtbare Antwort zu gewährleisten, wählen Sie zuerst eine proximale Dendrit (≤ 50 µm), wie die Effizienz der AP Backpropagation mit Abstand in GABAergen Interneuronen22deutlich zurückgehen kann.</li>
		<li>Vergrößern Sie die gezielte Region und wechseln Sie zum Werkzeug "rechteckige" in der Bild-Datenerfassungs-Software, die "Xt" (womit) Modus. Positionieren Sie den Scan über die dendritische Verzweigung von Interesse. Mit dem Laser Intensität Controllern in der Software zur Datenerfassung festgesetzt des zwei-Photonen-Lasers minimal Leistung wo Grundlinie grüne Fluoreszenz nur leicht sichtbar ist, Phototoxizität zu vermeiden.</li>
		<li>Erstellen Sie in der Elektrophysiologie Datenerfassungs-Software 'Protokoll'-Fenster und Bild-Datenerfassungs-Software eine Aufnahme-Testversion der gewünschten Dauer mit einer somatischen Stromeinspeisung der gewünschte Amplitude.<ol>
<li>Mit der Bild-Datenerfassungs-Software, klicken Sie auf "Aufnehmen" und erwerben Sie der Fluoreszenz kontinuierlich für 1-2 S. wiederholen die Bildaufnahme 3-10 Mal. Warten Sie mindestens 30 s zwischen Einzelscans lichtbedingten zu vermeiden. Wenn Linescans an mehreren Punkten entlang einem Dendriten zu erwerben, nehmen sie in zufälliger Reihenfolge-Effekte zu vermeiden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synaptisch-evozierten Katzen<ol>
<li>Suchen Sie nach einem Dendriten des Interesses über das rote Fluoreszenz-Signal.</li>
		<li>Legen Sie die Stimulation Pipette auf der Oberfläche der Scheibe über die Dendriten von Interesse. Senken Sie langsam die Stimulation Pipette einrastet, Bewegung, um nicht zu stören, die ganz-Zell Konfiguration zu minimieren. Positionieren Sie die Pipette auf 10-15 µm aus dem Dendriten.</li>
		<li>Um den Speicherort der synaptischen Microdomains in Aspiny Dendriten zu visualisieren, in der Bild-Datenerfassungs-Software wechseln Sie zu der 'Xt' (womit) Modus und positionieren Sie die Linie entlang der dendritischen Zweig von Interesse.</li>
		<li>Erstellen Sie im "Protokoll" Fenster (der Elektrophysiologie Datenerfassungs-Software) und Bild-Datenerfassungs-Software eine Aufnahme-Studie, die die Stimulationseinheit nach dem Test Start auslöst.</li>
		<li>Mit der Software zur Datenerfassung, klicken Sie auf "Aufnehmen", entlang der Dendrit kontinuierlich für 1-2 S. Wiederholung Erwerb 3-5mal, Scannen warten 30 s zwischen den Scans, lichtbedingten zu verhindern. Hinweis: Die Länge der Scan kann abhängig von der evozierten Ereignis Kinetik angepasst werden, sondern sollte zur Vermeidung von lichtbedingten minimiert werden (siehe Tabelle 2 für die Fehlersuche).</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 4.5.5 unter verschiedenen Bedingungen (z.B. unterschiedlicher Intensität/Länge der Stimulation, Einführung eines pharmakologischen Blocker usw.) abhängig von der konkreten Frage in Angriff genommen.</li>
		<li>Die Übernahme zu stoppen, wenn die Zelle Anzeichen zeigt für eine Verschlechterung der Gesundheit: Depolarisation unter-45 mV, Anstieg der Basislinie Ca2 + Level, morphologische Verschlechterung der Dendriten (z.B., Blebbing, Fragmentierung, siehe Tabelle 2 für die Fehlersuche).</li>
		<li>Vorläufige Informationen über die Zellmorphologie und notieren Sie den Speicherort der Stimulation Pipette, einen Z -Stapel der Zelle in den Rot-Kanal zu erwerben. Mit der Software zur Datenerfassung in "Xyz" eingestellt, die Grenzen des oberen und unteren Stapel Bild die gesamte Zelle mit allen Prozessen enthalten. Die "Schrittweite" auf 1 µm und initiiert die Stack-Erfassung über die Schaltfläche "Aufnehmen".</li>
		<li>Wenn die Z-Stapel-Übernahme abgeschlossen ist, verwenden Sie die Option "Maximale Projektion" in der Software alle fokalen Pläne des Stapels zu überlagern und überprüfen die Qualität der Akquisition. Dann, zurücknehmen Sie langsam die Patch-Pipette aus der Scheibe.</li>
		<li>Beheben Sie die Scheibe für die post-Hoc morphologische Identifikation, schnell entfernen Sie die Scheibe aus dem Bad mit einem flachen Pinsel zu, und legen Sie es zwischen zwei Filterpapiere in eine Petrischale ACFS gefüllt. Ersetzen Sie der ACFS mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) Lösung und lassen Sie die Schale im 4 ° C oder im Kühlschrank über Nacht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Immunohistochemistry für Post Hoc morphologische Identifikation von aufgezeichneten Zellen
Hinweis: Nach 1 Nacht der Fixierung in PFA, kann die Scheibe im Phosphatpuffer (PB) mit Natriumazid (0,5 %) bis zu 1 Monat aufbewahrt werden.
<ol><li>Legen Sie die Scheibe in Tris gepufferte Salzlösung (TBS) mit Triton x-100 (0,3 %) und durchführen Sie 4 Wäschen (5-10 min).</li>
	<li>Legen Sie die Scheibe in TBS-Triton 0,3 % mit 10 % normalem Ziegenserum (NGS) für 1 h.</li>
	<li>Setzen Sie die Scheibe in TBS-Triton 0,3 % mit 1 % NGS und einer Streptavidin konjugiert Fluorophor (z.B.Alexa Fluor 546 konjugiert Streptavidin, 1: 200) für Übernachtung Inkubation.</li>
	<li>Waschen Sie 4 Mal (5-10 min) in TBS.</li>
	<li>Montieren Sie Scheiben auf Objektträger und Bild mit einem konfokalen Mikroskop. Um eine vollständige Zelle Rekonstruktion haben, erwerben ein Z-Stapel (Schrittweite: 1 µm) mit einem 20 X Objektiv. Für imaging eine Alexa-546-konjugiert Label festgelegt verwenden Sie 543 nm Laser und eine 515-560 nm Erkennung filtern.</li>
</ol>6. Analyse der Katzen
<ol><li>Die Fluoreszenz-Werte aus den Regionen von Interesse (ROIs) in die womit Bilder von den roten und grünen Kanäle extrahieren und Durchschnittswerte der mehrere Wiederholungen für jede Bedingung um Rauschen zu reduzieren. Hinweis: Wenn womit Erwerb entlang der Dendriten durchgeführt wird, ist es möglich, Extrahieren von Daten aus mehreren ROIs, die dendritischen Microdomains (2 bis 5 µm) entsprechen kann, und damit die Studie von Ca2 + Signal Abschottung.</li>
	<li>Drücken Sie für jede ROI die Änderungen in Ca2 + Amplitude als: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> Hinweis: Hier G ist der Fluoreszenz-Wert aus den Grün-Kanal; G0 ist der Ausgangswert für die Fluoreszenz von den Grün-Kanal während der Pre-Stimulationsdauer; R ist der Fluoreszenz-Wert aus dem roten Kanal18. Als zwei-Photon Erregung stark lokalisiert ist und keine signifikanten Hintergrund erzeugt, ist Subtraktion des Hintergrundfluoreszenz nicht erforderlich.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons.">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li><li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration.">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li><li>Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Dendritic+Spines.">Structure and Function of Dendritic Spines.</a> Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).</li><li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis.">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li><li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated.">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li><li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines.">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li><li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons.">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li><li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2++signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons.">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li><li>Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+compartmentalized+regulation+of+dendritic+Ca2++signaling+in+hippocampal+interneurons.">Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+nonlinearities+switch+the+direction+of+synaptic+plasticity+in+fast-spiking+interneurons.">Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons.</a> J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).</li><li>Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thespread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+release+of+Ca2++from+IP3-sensitive+stores+evoked+by+synaptic+activation+of+mGluRs+paired+with+backpropagating+action+potentials.">Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials.</a> Neuron. 24, 727-737 (1999).</li><li>Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+subthreshold+Ca(2+)+signals+in+spines+of+hippocampal+neurons.">NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++imaging+of+mouse+neocortical+interneurone+dendrites:+contribution+of+Ca2+-permeable+AMPA+and+NMDA+receptors+to+subthreshold+Ca2++dynamics.">Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics.</a> J Physiol. 551, 67-78 (2003).</li><li>Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dendritic+calcium+spikes+in+mouselayer+5+low+threshold+spiking+interneurones:+implications+for+control+of+pyramidal+cell+bursting.">Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting.</a> J Physiol. 558, 465-478 (2004).</li><li>Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+single+synapses+in+brain+slices.">Functional imaging of single synapses in brain slices.</a> Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Sci STKE. 219, pl5 (2004).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+rationing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing.</a> Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+compartmentalization+and+regulation+of+postsynaptic+CaTs+in+inhibitory+interneurons.">Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons.</a> Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).</li><li>Guet-McCreight, A., Camir&#233;, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+semi-automated+strategy+to+develop+multi-compartment+models+that+predict+biophysical+properties+of+interneuron-specific+3+(IS3)+cells+in+hippocampus.">Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus.</a> eNeuro. 3, 1-26 (2016).</li><li>Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+and+activity-dependent+dynamics+of+action+potential-evoked+Ca2++signals+in+dendrites+of+hippocampal+inhibitory+interneurons.">Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons.</a> J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).</li><li>Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+mechanisms+and+long-term+potentiation+in+cortical+inhibitory+interneurons.">Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons.</a> Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).</li><li>Camir&#233;, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Signaling+in+Inhibitory+Interneurons:+Local+Tuning+via+Group+I+Metabotropic+Glutamate+Receptors.">Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors.</a> Front Physiol. 3, 259 (2012).</li><li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation.">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li><li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices.">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li><li>Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+two-photon+uncaging:+anovel+approach+to+mapping+glutamate+receptors.">Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors.</a> Neuron. 19, 465-471 (1997).</li><li>Salom&#233;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+usingacousto-optic+deflectors.">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).</li><li>Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector.">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li></ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt finanzielle oder sonstige Interessenkonflikte.

Die hier gezeigte Methode veranschaulicht, wie die Kombination der zwei-Photonen-Ca2 + Bildgebung und Patch-Clamp Elektrophysiologie verwendet werden kann, für das Studium dendritischen Ca2 + Signalisierung in neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten. Diese Methode ermöglicht eine Überwachung der beiden lokalen Ca2 + Erhebungen hervorgerufen durch elektrische Stimulation oder Backpropagating AP in dendritischen Segmenten und somatische Reaktion der Zelle. Dies macht es ein ausgezeichnetes Werkzeug zu untersuchen, wie die verschiedenen Teile der dendritischen Struktur integrieren Eingänge und kommunizieren mit dem Soma. Aber angesichts der Länge des Experiments, besonderes Augenmerk geschenkt werden die Zellgesundheit durch eine Einschränkung der Nutzung der Laserleistung für imaging der lichtbedingten Dendriten zu vermeiden. Dies kann auch durch die Zoom-Stufe verringert, verringert die Dauer des Scans und Erhöhung der Scangeschwindigkeit während der Bildaufnahme. Imaging Interneuron Dendriten führt zusätzliche Herausforderungen. Dendriten dieser Zellen haben keine Stacheln, ist entlang der Dendriten Scannen empfohlen, um die Lokalisierung der postsynaptischen Ca2 + Microdomains zu erleichtern. Darüber hinaus sind eine hohe endogene Ca2 + -Bindungskapazität, Ca2 + Erhebungen im Interneuron Dendriten kleiner und langsamer als in die Dendriten der Pyramidenzellen erzeugt. Dies erfordert mehrere womit Bilder für sowie eine ausreichend lange Dauer der einzelnen Linescans im Durchschnitt um Ca2 + Signal Kinetik angemessen zu beschreiben.
Lokale elektrischer Stimulation mit bipolaren Theta-Glaselektrode stellt ein nützliches Werkzeug zur Charakterisierung von dendritischen postsynaptischen Ca2 + Microdomains. Jedoch kann es noch aktivieren verschiedene "en passant" Axone in einer bestimmten Region gelegen. Die Anzahl der Eingänge aktiviert in diesem Fall ist unbekannt und kann mit zusätzlichen Berechnungswerkzeuge nur geschätzt werden. Zwei-Photonen-Glutamat uncaging27, die gleichzeitige Stimulation der mehrere einzelne Synapsen ermöglicht, stellt eine gute Alternative für lokale dendritischen Ca2 + Antworten zu entlocken. Diese Methode ist weit verbreitet für das Studium der wichtigsten Zellen, die klar definierte exzitatorische postsynaptischen Strukturen (Stacheln), aber ist nicht geeignet für die Untersuchung von Interneuronen, die sich insgesamt haben eine niedrige Wirbelsäule Dichte. Uncaging Glutamat entlang der Interneuron Dendrit wie es zu den wichtigsten Zellen angewendet wird würde unweigerlich aktivieren mehrere extrasynaptic Mechanismen der Ca2 + 9,10, so dass es schwierig zu interpretieren-Signalisierung der Beobachtungen.
In den letzten zehn Jahren bot Fortschritte in den optischen Technologien verbesserte zeitlichen Auflösung für zwei-Photonen-Ca2 + Bildgebung. Einer der vielversprechendsten ist RAM Mikroskopie (Rampe) durch akusto-optischen Deflektoren (Bevollmächtigten)28,29. Anders als konventionelle Raster Scannen scannt Rampe ausgewählte Punkten des Interesses bei hoher Frequenz, die durch die hohe Geschwindigkeit der Trägheit-freie Anweisungsbefugten ermöglicht wird. Es ist ideal für die gleichzeitige Untersuchung von mehreren dendritische Verzweigungen, da es nicht auf Punkte angelegt in einem linearen Muster beschränkt. Jedoch möglicherweise die höhere zeitliche Auflösung von der Anweisungsbefugten angeboten nicht erforderlich, wenn Ca2 + -Ereignisse dauerhaft Hunderte von Millisekunden innerhalb der gleichen Brennweite Plan imaging. Darüber hinaus kann die Position der Punkte innerhalb der gleichen Struktur des Interesses Scannen schwierig sein, Kontrolle durch Mikro-Drifts bei Slice Vorbereitungen verbunden mit einer hohen Durchblutung-Rate für gutes Stück Qualität erforderlich ist. Daher ist der hoher zeitlicher Auflösung (500-700 Hz) womit basierende Erwerbsmethode in diesem Artikel vorgestellten noch vorteilhaft, wenn Ca2 + Signale in einzelne dendritische Verzweigungen imaging.

Der Beitrag eines Neurons, Netzwerk-Aktivität richtet sich weitgehend nach der dynamischen Natur der synaptischen Eingänge, die er empfängt. Traditionell, stützte sich die vorherrschende Methode der Charakterisierung synaptische Aktivität in Nervenzellen auf somatische ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen von postsynaptischen Ströme, hervorgerufen durch elektrische Stimulation von Axonen der Passage. Einzige Aktivität der proximal befindet sich Synapsen wird jedoch in diesem Fall1wahrheitsgemäß gemeldet. Darüber hinaus wurden um die Synapse-spezifische Mechanismen zu beurteilen, Aufnahmen von Paaren von Neuronen und von Dendriten an einem bestimmten Ort zur Synapsen von Interesse und die Mechanismen der dendritischen Integration bzw. Ziel. Ein wichtiger Durchbruch auf dem Gebiet der synaptischen Physiologie wurde durch eine Heirat von optischen und elektrophysiologische Techniken erreicht. Zwei-Photon Erregung Laser-scanning-Mikroskopie (2PLSM) in Kombination mit Ca2 + Bildgebung und optogenetische Tools kann enorme Details der dynamischen Organisation der synaptischen Aktivität an bestimmten neuronalen Verbindungen im Gehirnscheiben in offenbaren. Vitro und in Vivo.
Einige wesentliche Vorteile hat 2PLSM von den herkömmlichen, ein Photon Erregung Mikroskopie2abheben: (1) aufgrund einer nichtlinearen Natur der zwei-Photonen-Anregung die Fluoreszenz nur im fokalen Volumen erzeugt, und vertreten alle emittierte Photonen nützliche Signale (keine Notwendigkeit für Lochkamera); (2) längere Wellenlängen, in 2PLSM, durchdringen das Gewebe Streuung effizienter; Darüber hinaus sind die gestreute Photonen zu verdünnen, Hintergrundfluoreszenz und zwei-Photon Erregung zu produzieren; (3) lichtbedingten und Phototoxizität sind auch auf der Brennebene beschränkt. Die 2PLSM bleibt daher trotz der hohen Kosten der 2-Photonen-Systeme im Vergleich zu herkömmlichen konfokale Mikroskope, eine Methode der Wahl für hochauflösende Untersuchung der neuronalen Struktur und Funktion in dicken lebendes Gewebe.
Die erste Anwendung des 2PLSM im Streuung Gewebe war es, die Struktur und Funktion der dendritischen Dornen3Bild. 2PLSM in Kombination mit Ca2 + Bildgebung ergab, dass Wirbelsäulen-Funktion als isolierten biochemischen Fächer. Da in vielen neuronalen Arten gibt es eine 1: 1-Entsprechung zwischen Dornen und einzelne Synapsen4, wurde zwei-Photon Ca2 + imaging bald ein nützliches Werkzeug, das die Aktivität der einzelnen Synapsen bei intaktem Gewebe5Berichterstattung, 6,7,8. Darüber hinaus wurde 2PLSM-basierte Ca2 + Bildgebung erfolgreich um die Aktivität der einzelnen Calciumkanäle und die nichtlinearen Wechselwirkungen zwischen der inneren und synaptischen maßgearbeitet überwachen sowie Zustand und aktivitätsabhängige bewerten eingesetzt Regulierung von Ca2 + Signalisierung in neuronalen Dendriten5,6,7,8,9,10,11.
Calcium ist ein allgegenwärtiges intrazellulären zweite Bote, und seine subzelluläre räumlich-zeitliche Organisation bestimmt die Richtung des physiologischen Reaktionen von Änderungen in der synaptischen Stärke bei der Regulierung von Ionen-Kanäle, Dendriten und Wirbelsäule Wachstum als Zelle Tod und überleben. Dendritische Ca2 + Erhebungen erfolgen über Aktivierung des mehrere Wege. Aktionspotentiale (APs), Backpropagating, die Dendriten öffnen Voltage-gated Kalzium-Kanäle12 und produzieren relativ globale Ca2 + Transienten (Katzen) in Dendriten und Stacheln13. Synaptische Übertragung ist verbunden mit der Aktivierung der postsynaptischen Ca2 +-durchlässigen Rezeptoren (NMDA, Ca2 +-durchlässigen AMPA und Kainate),6,14,15Katzen auslösen synaptische. Schließlich werden in Dendriten unter bestimmten Bedingungen11,12,13,16Supralinear Ca2 + Ereignisse generiert.
Zwei-Photonen-Ca2 + Bildgebung in Kombination mit Patch-Clamp elektrophysiologische Aufnahmen beschäftigt synthetische Ca2 +-empfindliche fluoreszierenden Indikatoren, die in der Regel durch die Patch-Elektrode während der gesamten Zelle Aufnahmen geliefert werden . Eine Standardmethode zur Quantifizierung von Ca2 + Dynamik basiert auf der dual-Anzeige Methode17,18. Er verwendet zwei Fluorophore mit gut getrennten Emissionsspektren (z.B., eine Kombination aus einem roten Ca2 +-unempfindliche Farbe mit grünen Ca2 + Indikatoren, wie Oregon Green BAPTA-1 oder Fluo-4) und hat mehrere Vorteile gegenüber der einzigen Indikator Methode. Erstens, eine Ca2 +-unempfindlich Farbstoff wird verwendet, um suchen kleine Strukturen von Interesse (dendritische Verzweigungen und Stacheln) wo Ca2 + Bildgebung erfolgen. Zweitens wird das Verhältnis zwischen den grünen und roten Fluoreszenz (ΔG/R) als Maß für die [Ca2 +], berechnet, ist weitgehend unempfindlich gegen Veränderungen der Grundlinie Fluoreszenz aufgrund der schwankenden [Ca2 +]017 , 18. Darüber hinaus können Fluoreszenz Änderungen in Bezug auf absolute Ca2 + -Konzentrationen19kalibriert werden.
Eine allgemeine Beschwerde beim laufen zwei-Photon Ca2 + bildgebender Experimenten in akuten Scheiben ist Zelle Gesundheit und Stabilität der Bildaufnahme durch die hohe Laserleistung, die in der Regel verwendet. Zusätzlich in Ca2 + bildgebenden Experimenten gibt es Besorgnis über die Störung und erheblichen Überschätzung der subzellulären Ca2 + Dynamik da Ca2 + Indikatoren als hochmobile exogene Ca2 + handeln Puffer. Somit hängt die Wahl der Ca2 + Kennzeichen und seine Konzentration auf die neuronalen Art, die erwartete Amplitude der Katzen und der experimentellen Frage.
Wir die Methode der zwei-Photonen-Ca2 + Bildgebung für die Untersuchung von Ca2 + Schwankungen in Dendriten der GABAergen Interneuronen9,10,11,20,21 angepasst , 22. während der Großteil der frühen Ca2 + bildgebenden Studien erfolgten in den wichtigsten Neuronen, hemmende Interneurone präsentieren eine Vielzahl von funktionalen Ca2 + Mechanismen unterscheiden sich von denen in Pyramidenzellen20 , 23 , 24. diese Interneuron-spezifische Mechanismen (z.B. Ca2 + durchlässig AMPA-Rezeptoren) können bestimmte Rollen bei der Regulierung der Aktivität der Zellen spielen. Während dendritischen Ca2 + signalisieren in den Interneuronen ein verlockendes Ziel für weitere Untersuchungen ist, präsentiert zwei-Photon Ca2 + Bildgebung in Dendriten dieser Zellen zusätzliche Herausforderungen, aus einem dünneren Durchmesser von Dendriten und Mangel an Stacheln eine besonders hohe endogene Ca2 + -Bindungskapazität. Wie unsere Fokus auf die Untersuchung der hippocampalen Interneuronen Forschungsinteressen, wurde das folgende Protokoll, während auf verschiedenen neuronalen Populationen anwendbar zur Bewältigung dieser Herausforderungen angepasst.
Dieses Protokoll wurde mit einem kommerziellen konfokale zwei-Photonen-Mikroskop ausgeführt mit zwei externen, nicht descanned Detektoren (NDDs), Elektro-optischer Modulator (EOM) und ein Dodt Scannen gradient Kontrast (SGC) ausgestattet, und auf einer optischen Tisch installiert. Das Mikroskop wurde gepaart mit einem Exklusivrepräsentation multiphoton Laser modengekoppelten bei 800 nm (> 3 W, 140 fs Impulsen, 80 Hz Wiederholrate). Die imaging-System wurde mit einem standard Elektrophysiologie-Rig, einschließlich einer Perfusion Kammer mit einer Übersetzung Plattform mit zwei Mikromanipulatoren, eine computergesteuerte Mikroelektrode Verstärker, ein Digitizer, Temperaturregelung, eine Stimulation ausgestattet. Einheit und Datenerfassungs-Software.

<table><tbody><tr><td>Animal Strain: Mouse CD1</td><td>Charles River</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>AbbVie Corporation</td><td>0B506-099</td><td></td></tr><tr><td>CGP 55845 hydrochloride</td><td>Abcam</td><td>ab120337</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde powder, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potassium gluconate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Sodium phosphate monobasic&lt;br/&gt; monohydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Hydrazide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>SR95531 (Gabazine)&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120042</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Adenosine triphosphate (ATP)-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Guanosine (GTP)-Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Oregon Green BAPTA-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6812</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Phosphocreatine di(tris) salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Streptavidin-conjugated Alexa-546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11225</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Patch Borosilicate Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Theta Borosilicate Glass Capillaries</td><td>Sutter Instrument</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser&amp;nbsp;</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Imaging Acquisition Software</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Temperature Controller TC-324B</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; MultiClamp 700B Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Digidata 1440A Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Confocal Translator</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Micromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; pClamp Data Acquisition Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; A365 Constant Current Stimulus Isolator</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Vibraplane Optical Table</td><td>Kinetic Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices

Kalzium (Ca2 +) Bildgebung ist ein mächtiges Werkzeug um die räumlich-zeitliche Dynamik der intrazellulären Ca2 + Signale in neuronalen Dendriten zu untersuchen. Ca2 + Schwankungen können durch eine Vielzahl von Membran und intrazellulären Mechanismen auftreten und spielen eine entscheidende Rolle bei der Induktion der synaptischen Plastizität und Regulierung von dendritischen Erregbarkeit. Daher ist die Möglichkeit, verschiedene Arten von Ca2 + Signale in dendritischen Filialen aufnehmen wertvoll für Gruppen studieren wie Dendriten Informationen zu integrieren. Das Aufkommen der zwei-Photonen-Mikroskopie hat solche Studien erheblich erleichtert durch die Bildgebung in lebender Gewebe, wie Lichtstreuung und lichtbedingten inhärenten Probleme zu lösen. Darüber hinaus durch Kombination von konventionellen elektrophysiologische Techniken mit zwei-Photon Ca2 + imaging, ist es möglich zu untersuchen, lokale Ca2 + Schwankungen in neuronalen Dendriten parallel mit Aufnahmen der synaptischen Aktivität in Soma. Hier beschreiben wir wie Sie diese Methode verwenden, um die Dynamik der lokalen Ca2 + Transienten (Katzen) studieren in Dendriten der GABAergen inhibitorischen Interneuronen. Die Methode kann auch angewendet werden, zum Studium dendritischen Ca2 + -Signalisierung in verschiedenen neuronalen in akuten Hirnschnitten.

Mit den hier vorgestellten Protokoll, erhielten wir Katzen hervorgerufen durch somatische Stromeinspeisung und die elektrische Stimulation in Dendriten von Oriens/Alveus Interneuronen im Bereich CA1 des Hippocampus. Nach Patchen eines Neurons, identifiziert auf ihre Form und Position basierend, Wir erwarben Linescans über einem proximalen Dendriten an mehreren Punkten bei Entfernungen von Soma (Abbildung 1A) gegeben. Wir beobachteten eine Abnahme der Amplitude der Katzen induziert durch Backpropagating APs als der Abstand von der Soma erhöht (indikativ reduzierten AP Amplitude oder eine Distanz-abhängige Rückgang der Kalzium-Channel-Vertrieb, Abbildung 1 b). Nach Immunohistochemistry (mit Streptavidin-konjugiert Alexa Fluor 546) konnten wir zum Abrufen der Biocytin Kennzeichnung der Zelle und identifizieren die aufgezeichneten Neuron als Bistratified Zelle mit einem Axon Stratum Oriens und Stratum Radiatum (Abbildung zu besetzen 1 C). im zweiten Experiment wurde eine Stimulation Pipette zu einer distalen dendritischen Website gebracht. Scannen entlang der Dendriten, konnten wir dann die Amplitude der postsynaptischen Ca2 + Signale in einer gegebenen dendritische Verzweigung (Abbildung 2A–C) als Reaktion auf elektrische Stimulation von Axonen der Passage zu beurteilen. Die postsynaptischen Katzen unterschieden zwischen benachbarten dendritischen Microdomains (Segment 1 bis 6; Abb. 2D), die eine Verbreitung von Ca2 + Signal aus der Zone der Einleitung und/oder verschiedene postsynaptischen Mechanismen zugeordnet werden könnten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56776/56776fig1.jpg"> Abbildung 1: Repräsentatives Beispiel für AP-evozierten Ca2 + Transienten. (A) maximale Projektion von einem zwei-Photonen- Z-Stapel (13 µm) eine gepatchte Interneuron gefüllt mit Alexa-594 (20 µM). Weiße Linien kennzeichnen die Position und Länge des Linescans. (B) Spuren zeigen die Katzen löste in den Orten gezeigt in A. Top Ablaufverfolgung zeigt den kurzen AP Zug durch somatische Stromeinspeisung während der Aufnahme Test generiert. Zeitskala ist dasselbe auf allen Spuren gezeigt. (C) maximale Projektion von einem konfokalen Z-Stapel zeigen die Biocytin Kennzeichnung der Zelle. Anfrage: Oriens/Alveus; PYR: Stratum Pyramidale; RAD: Stratum Radiatum. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56776/56776fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56776/56776fig2.jpg"> Abbildung 2: Postsynaptischen Ca2 + Transienten hervorgerufen durch ein Platzen der elektrischen Stimulation (3 Stimuli bei 100 Hz). (A) maximale Projektion von einem zwei-Photonen- Z-Stapel (148 µm) zeigt eine gepatchte Interneuron gefüllt mit Alexa-594. Weiße Pfeilspitzen verweisen auf den Speicherort der axonalen Terminals innerhalb der pyramidale Schicht, was darauf hindeutet, dass die Interneuron eine Korb-Zelle ist. (B) einzelne Brennebene illustrieren die dendritische Verzweigung wo die Stimulationselektrode positioniert wurde. Gestrichelte Linie zeigt die Position des der womit gezeigt (C1 und C2). (C) Bilder illustrieren das Ergebnis einer womit in den roten Zahlen (1; Alexa-594; 20 µM) und grün (2; Oregon Green Bapta-5N; 300 µM) Kanäle. Die Bilder wurden in kleinere Segmente, die Ausbreitung der Antwort zu analysieren, über 30 µm. (D) Spuren zeigen die Ca2 + Transienten (Katzen) in den Segmenten angezeigt in C2 entlockte, Makulatur. Obere Spur zeigt die Spannung Reaktion auf elektrische Stimulation auf der somatischen Ebene während der bildgebenden Studie aufgenommen. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56776/56776fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Lösung</td>
			<td>Komponente</td>
			<td>Konzentration (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">ACFS-Normal</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>124</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>1.25</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nahco33
</td>
			<td>26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glukose</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">ACFS-Recovery</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>124</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>1.25</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nahco33
</td>
			<td>26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glukose</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">ACFS Saccharose</td>
			<td>KCl</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>1.25</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nahco33
</td>
			<td>26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glukose</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Saccharose</td>
			<td>219</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="9">K+-basierte Patch Lösung</td>
			<td>K+- Gluconat</td>
			<td>130</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phosphocreatin di (Tris) Salz</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>ATP-Tris</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>GTP-Tris</td>
			<td>0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biocytin</td>
			<td>72</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa-594</td>
			<td>0.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oregon Green-BAPTA-1</td>
			<td>0,2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Lösung Rezepte. Verbindungen und Konzentrationen für Lösungen während des Protokolls verwendet.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problem</td>
			<td>Lösung</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicht in der Lage, gesunde Neuron zu patchen</td>
			<td>Suchen Sie Anzeichen dafür, dass die Scheiben ungesund sind: geschrumpft oder geschwollen, Zellen, sichtbare Zellkerne, etc.. Wenn ja, verwerfen Sie die Scheiben. Überprüfen Sie auch den Patch-Pipette-Widerstand und die Patch-Lösung Osmolalität; ersetzen Sie sie, wenn die Werte nicht in den entsprechenden Bereich.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fluoreszenzsignal aus Dendriten ist gering</td>
			<td>Warten Sie länger, für die Zelle zu füllen. Wenn ein Hindernis die Patch-Lösung halten von in die Zelle diffundieren, versuchen Sie, eine geringe Menge der Unterdruck in der Patch-Pipette.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elektrischer Stimulation ist keine Ca2 + Reaktion hervorzurufen.</td>
			<td>Prüfen Sie, ob ein Artefakt in der elektrophysiologischen Aufnahme. If nicht vorhanden ist, suchen Sie eine short-Kurzschluss/anregende Fehlfunktion. Falls vorhanden, erhöhen Sie die Reizintensität oder verschieben Sie die Stimulation Pipette näher an die Dendriten. Es ist darauf hinzuweisen, dass der Abstand zwischen der Stimulationselektrode und die Dendriten sollte nicht mehr als 8 Umm um direkten Depolarisation der Dendriten beim Studium der synaptischer Antworten zu vermeiden.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Evozierten Ca2 + Signal ist zu hoch/sättigt die Ca2 +-Indikator</td>
			<td>Verringern Sie Laserleistung. Wenn das Problem in mehreren Zellen bestehen, verwenden Sie ein anderes Ca2 + Kennzeichen, mit einer niedrigeren Ca2 + Affinität.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grundlinie Ca2 + Signal steigt allmählich während des Experiments</td>
			<td>Für einen längeren Zeitraum zwischen den einzelnen Scans warten. Wenn die Basislinie weiter zunehmen wird, stoppen Erwerb; Es zeigt, dass die Zellgesundheit wahrscheinlich rückläufig ist.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amplitude des Signals Ca2 + sinkt während der scans</td>
			<td>Verringern Sie Laserleistung oder verkleinern Sie (falls zutreffend).</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dendrit ist ("Blebbing") nach dem Scannen Fragmentierung.</td>
			<td>Reduzieren Sie die Laserleistung oder verkleinern. Wenn Blebbing auf die gezielte Dendrit beschränkt ist, wählen Sie einen anderen Dendriten und Laserleistung verringern / verkleinern. Wenn mehrere Dendriten Blebbing sind, stoppen Sie Erwerb.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fluoreszenz-Signale driften"aus der Scanlinie nach fegt"</td>
			<td>Reduzieren Sie Bewegung in der Scheibe durch Verringerung der Geschwindigkeit der ACFS Perfusion. Stellen Sie vor dem Patchen, Sie sicher, dass die Scheibe stark durch ein Netz fixiert ist.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Problembehandlung Tabelle. Lösungen für häufige Probleme, die während einer Ca2 + imaging Experiment entstehen.

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices at JoVE.com

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Wir präsentieren Ihnen eine Methode, die Kombination von ganzen Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen und zwei-Photon imaging um Ca2 + Transienten im neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten zu erfassen.

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

two-photon-calcium-imaging-in-neuronal-dendrites-in-brain-slices

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K Aufrufe.  Université Laval. Wir präsentieren Ihnen eine Methode, die Kombination von ganzen Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen und zwei-Photon imaging um Ca2 + Transienten im neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten zu erfassen.

Serie: Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Forschung

Neurowissenschaften

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2 / 3 der Mäuse

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Biologie

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Längs-Zwei-Photon-Bildgebung des Dorsal Hippocampal CA1 in lebenden Mäusen

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Verhalten

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Multi-Photonen-Intrazelluläre Sodium Imaging Kombination mit UV-vermittelten Brenn Uncaging von Glutamat in CA1 Pyramidenzellen

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Calcium Imaging in Neurons

Calcium ions play an integral role in neuron function: They act as intracellular signals that can elicit responses such as altered gene expression and neurotransmitter release from synaptic vesicles. Within the cell, calcium concentration is highly dynamic due to the presence of pumps that selectively transport these ions in response to a variety of signals. Calcium imaging takes advantage of intracellular calcium flux to directly visualize calcium signaling in living neurons.This video begins with an overview of the key reagents used for this technique, known as calcium indicator dyes. The discussion includes an introduction to the commonly used dye Fura-2 and some basic principles behind how both ratiometric and non-ratiometric calcium indicators work. Next, a typical calcium imaging experiment is presented, from preparing the cells and dye to capturing and analyzing the fluorescent images. Finally, several experimental applications of calcium imaging are provided, such as the study of neuronal network activity and sensory processing.

Calcium Imaging in Neurons Using Fura-2

Calcium Imaging in Neuronen

Calcium ions play an integral role in neuron function: They act as intracellular signals that can elicit responses such as altered gene expression and ...