Unser System ermöglicht es Forschern, nicht lokalisierte Schwingungen mit gut kontrollierten Eigenschaften bei nicht skalierter Verschiebung hervorzurufen und den Kalziumstrom während der Reaktionen der Reizstoffe auf die Schwingungen zu quantifizieren. Als Hauptvorteil dieser Technik können wir die neuronalen Mechanismen, die zugrunde liegenden Verhaltensmechanismen, nichtinvasiv untersuchen. Bereiten Sie ein neues Nematodenwachstumsmedium oder eine NGM-Platte vor, auf der Escherichia coli OP50 in einem quadratischen Muster mit einem Zellstreuer gestreift ist, so dass der Wurm während der Kalziumbildgebung die meiste Zeit in den Bakterien verbringt.
Übertragen Sie vier Tage vor einem Kalzium-Bildgebungsexperiment zwei erwachsene ST12-Würmer auf die Platte und legen Sie die Platte für vier Tage in einen 20-Grad-Celsius-Inkubator. Führen Sie Kalziumbildgebung mit einem Mikroskop durch, das mit einem akustischen Wandlergerät zur Stimulation, einem 2-fachen Objektiv, einer Hochgeschwindigkeits-CMOS-Kamera und einer Bildaufteilungsoptik ausgestattet ist. Schalten Sie den Präzisionscomputer im motorisierten Stage Controller X Y ein.
Schalten Sie dann den Verstärker ein und stellen Sie den Lautstärkeregler auf 10 in der Basis und die Höheneinsteller auf acht. Um GCaMP anzuregen und RFP zu markieren, schalten Sie die 488- und 560-Nanometer-Leuchten der LED-Lichtquelle ein. Stellen Sie die 470- und 550-Nanometer-Messgeräte der Steuerkapsel in der Lichtquelle auf 5% ein, damit die Intensität des LED-Lichts für die Bildgebung geeignet ist.
Laden Sie die folgenden Softwarepakete und Fenster herunter und installieren Sie sie. Mausmakro-Software, Software für die Schwingungsdämpfung, Software für das laufende Tracking und Software für die Datenanalyse. Doppelklicken Sie auf die Tracking-Softwaredatei, stellen Sie dann die Belichtungszeit auf 0,033 Sekunden ein und binning auf zwei mal zwei, um eine reibungslose Bildaufnahme zu gewährleisten.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen und warten Sie fünf Minuten, um die Software zu stabilisieren. Geben Sie die Informationen für die Bildaufnahme ein. Wenn Sie beispielsweise 500 Bilder ohne Intervall aufzeichnen möchten, geben Sie 500 in das Feld Bilder insgesamt, 500 in das Feld Bilder und Null in das Feld Intervalle ein.
Nachdem Sie die Aufnahmetaste eingeschaltet haben, teilen Sie das Fluoreszenzbild mithilfe der Bildaufteilungsoptik auf und projizieren Sie den GCaMP-Kanal und den Tag-RFP-Kanal auf zwei Hälften der CMOS-Kamera. Kalibrieren Sie die Koordinaten des GCaMP und markieren Sie RFP-Kanäle und speichern Sie die Einstellungen. Legen Sie dann das Verzeichnis so fest, dass die Datendatei ausgegeben wird, und deaktivieren Sie die Erfassung.
Lesen Sie den Assay. Textdatei mit dem Mausmakrosystem, so dass der Mauszeiger basierend auf den Koordinaten und dem Zeitplan in dieser Datei gesteuert wird und doppelklicken Sie auf die Softwaredatei zur Schwingungskontrolle. Stellen Sie die Koordinaten des Mauszeigers in der Wartezeit bis zur Stimulation nach dem Start der Aufnahme ein und stellen Sie dann die Frequenz- und Amplitudenwerte in der Software zur Schwingungskontrolle ein.
Übertragen Sie einen einzelnen Wurm, der sowohl GCaMP als auch Tag-RFP ausdrückt, von der inkubierten Platte auf eine frische NGM-Platte, auf der E coli OP50 gestreift wurde. Befestigen Sie die NGM-Platte mit transparentem Klebeband am akustischen Wandler. Schalten Sie für die Kalziumbildgebung die Erfassungstaste ein und finden Sie den Wurm bei 2,5-facher Vergrößerung.
Stellen Sie das Sichtfeld auf 1,1 x 1,1 Millimeter mit einer Auflösung von 2,6 Mikrometern pro Pixel ein. Schalten Sie das helle Licht aus und klicken Sie auf die Homing-Taste, um den fluoreszierenden Punkt eines Wurms zu verfolgen, der die Bewegung der X-Y-Stufe einleitet, um den maximalen Intensitätsbereich des Wurms in der Mitte des Sichtfelds im Tag-RFP-Bild zu halten. Stellen Sie sicher, dass die Intensitätswerte ungefähr 1000 betragen.
Wenn nicht, stimmen Sie die 470- und 550-Nanometer-Messgeräte der Kontrollkapsel in der Lichtquelle ab. Drücken Sie die Schaltfläche Ausführen im Mausmakrosystem, um die Mauszeigersteuerung zuzulassen, und überprüfen Sie, ob die BMP-Ausgabedatei ordnungsgemäß erstellt wurde. Erstellen Sie für die Datenanalyse einen Ordner auf dem Desktop und nennen Sie ihn Calcium Imaging", erstellen Sie dann einen Ordner innerhalb des Calcium Imaging-Ordners und nennen Sie ihn CI-Ergebnis für die Ausgabeergebnisdateien.
Doppelklicken Sie auf das Dual-View-Imaging. MB-Datei, die in der Datenanalysesoftware geschrieben wurde, und fügen Sie die Dateipfade zum CI-Ergebnisordner in den Ordner mit der BMP-Datei ein. Drücken Sie gleichzeitig die Umschalt- und die Returntaste, um eine automatische Analyse zu starten, die den Wert eines Bereichs mit maximaler Intensität im Tag-RFP-Bild verwendet.
Prüfen Sie abschließend, ob die Ausgabedateien im CI-Ergebnisordner entsprechend angelegt sind. In der repräsentativen Analyse wurden GCaMP- und Tag-RFP-Kanaldaten als eine Reihe von Bildern erhalten. Die Verschiebung der Petrischale, die durch ein nicht lokalisiertes Schwingungssystem induziert wurde, wurde ebenfalls quantifiziert.
Die Verschiebung kann durch Einstellen des Amplitudenwertes in der Software zur Schwingungsdämpfung sowie des Lautstärkereglers und des Verstärkers gesteuert werden. Während die Frequenz durch Einstellen des Frequenzwertes in der Software reguliert werden kann. Eine transiente Kalziumreaktion von AVA-Neuronen wurde bei Stimulation mit Vibrationen mit einer Frequenz von 630 Hertz und einer Verschiebung von etwa 4,5 Mikrometern pro Sekunde beobachtet, was darauf hindeutet, dass das Ava-Neuron während der Rückwärtsreaktion eines Wurms auf die nicht lokalisierte Stimulation aktiviert wurde.
In unserem Verfahren können wir nur ein einzelnes Neuron quantifizieren. Dieses System kann jedoch auch mit einem biometrischen Bildgebungsverfahren kombiniert werden, um mehrere Neuronen oder sogar das gesamte Gehirn nichtinvasiv zu quantifizieren.
