Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfragen in der Tumorimmunologie zu beantworten, einschließlich der Frage, ob es einen Nachschub an tumorspezifischen Immunzellen aus peripheren Geweben gibt, die Übergänge zwischen neu infiltrierten und bereits vorhandenen Immunzellen innerhalb der Tumormikroumgebung und ihre Reaktionen auf die Immuntherapie. Dies ist eine bequeme und leicht zu befolgende Technik, um die von der Peripherie abgeleiteten Zellen von tumorinfiltrierten Immunzellen zu unterscheiden und die dynamischen, phänotypischen und funktionellen Veränderungen dieser Zellen in Längsschnittassays zu verfolgen. Beginnen Sie damit, 100 Mikroliter der vorbereiteten B16F10-OVA-Zellsuspension in eine 1-ml-Tuberkulinspritze zu entnehmen.
Klopfen Sie auf den Lauf, um Blasen nach oben zu bewegen, und drücken Sie den Kolben vorsichtig, um Luftblasen zu entfernen. Halten Sie die Maus zurück, um ihren Bauch freizulegen. Drücken Sie das linke Hinterbein mit dem kleinen Finger, um die Haut der linken Leistengegend zu straffen.
Entfernen Sie die Haare der Maus mit einem elektrischen Rasierer vom linken Unterbauch. Verwenden Sie Baumwolle, die mit 75% Ethanol getränkt ist, um den hinteren Quadranten des linken Bauches zu reinigen. Halten Sie die Spritze in einem flachen Winkel zwischen 0 und 15 Grad und führen Sie sie mit der abgeschrägten Nadel nach oben an der Seite des linken Oberschenkels ein.
Führen Sie die Nadel 0,5 bis 1 Zentimeter durch das Unterhautgewebe in die Leistengegend. Ziehen Sie den Kolben vor der Injektion zurück. Wenn es einen Unterdruck gibt, drücken Sie den Kolben vollständig und beobachten Sie die Bildung einer kleinen Flüssigkeitstasche oder eines Bolus in der Unterhaut.
Entfernen Sie die Nadel, nachdem die Injektion durchgeführt wurde. Lassen Sie die Maus los und setzen Sie sie wieder in den Käfig. Messen Sie am sechsten bis achten Tag nach der B16F10-OVA-Implantation die Tumorgröße mit einer Vernierskala.
Wählen Sie die Mäuse mit einem Durchmesser von etwa drei Millimetern oder einen tumor in Mungobohnengröße aus und teilen Sie sie gleichmäßig und zufällig in zwei Gruppen ein. Ziehen Sie 200 Mikroliter OT-1-Zellsuspension in eine 29-Gauge-Insulinspritze mit 100 Einheiten und entfernen Sie Blasen. Legen Sie die Maus separat in einen Käfig, mit einer Infrarotlampe über dem Käfig für 5 bis 10 Minuten, um die Schwanzvene zu erweitern.
Immobilisieren Sie die Maus mit einer Haltevorrichtung der entsprechenden Größe. Halten Sie den Schwanz, um ihn zu begradigen, und sprühen Sie 75% Ethanol, um die Vene sichtbar zu machen. Halten Sie die Spritze parallel zur Vene und führen Sie sie in einem Winkel von 0 bis 15 Grad in die Vene ein.
Ziehen Sie den Kolben leicht zurück, und wenn Blut in das Fass gelangt, injizieren Sie die Suspension langsam und stetig mit einer Rate von nicht mehr als einem Milliliter pro Minute. Entfernen Sie nach Abschluss der Injektion die Spritze und drücken Sie den Injektionsbereich drei bis fünf Sekunden lang vorsichtig, um die Blutung zu stoppen. Bringen Sie die Maus zurück in den Käfig und beobachten Sie sie einige Minuten lang genau auf Nebenwirkungen.
Wenn es normale Beweglichkeit und Nasenausfluss hat, legen Sie es wieder in die Gesellschaft der anderen Mäuse. Wählen Sie 8 bis 10 Tage nach dem Adoptionstransfer Spendermäuse mit vergleichbarer Tumormasse von etwa fünf Millimetern Durchmesser für eine Transplantationsoperation aus. Legen Sie eine 100 Millimeter mal 20 Milliliter große Schale in eine Biosicherheitskabine und fügen Sie 10 Milliliter steriles, eiskaltes PBS hinzu.
Nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben, tauchen Sie sie drei bis fünf Minuten lang in 75% Ethanol. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine mit sauberem, saugfähigem Papier bedeckte Dissektionsplatte in der Biosicherheitskabine. Halten Sie die Mäusegliedmassen mit Dissektionsnadeln zurück.
Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie von oberhalb der Harnröhrenöffnung bis zum Xiphoid mit einer Schere. Dehnen Sie die Haut mit einer Pinzette auf die linke Seite des Mauskörpers und halten Sie die Haut mit Dissektionsnadeln zurück. Entfernen Sie den Tumor und halten Sie seine Kapsel so intakt wie möglich.
Entfernen Sie vorsichtig und vorsichtig das Bindegewebe in der Nähe des Tumors mit einer chirurgischen Schere, dann legen Sie das Tumorgewebe in die Schale mit sterilem, eiskaltem PBS für die anschließende Transplantation. Verwenden Sie tierärztliche Salbe auf den Augen, um zu verhindern, dass sie austrocknen. Rasieren Sie die linke Flanke der Maus mit einem Elektrorasierer und tragen Sie dann eine Enthaarungscreme auf, um die restlichen Haare zu entfernen.
Platzieren Sie die Maus in der Biosicherheitskabine in Bauchlage auf einer mit sauberem, saugfähigem Papier bedeckten Dissektionsplatte, wobei die vertikale Achse der Maus parallel dazu und ihr Kopf zur rechten Seite des Experimentators verläuft. Reiben Sie die Haut des rasierten Bereichs mit Baumwolle, die in Povidon-Jod getränkt ist. Heben Sie die Haut in der Mitte zwischen den Hüftgelenken der Maus mit einer chirurgischen Pinzette an.
Verwenden Sie die Schere, um eine fünf Millimeter lange vertikale Exzision vorzunehmen und den Schnitt rostral entlang der dorsalen Mittellinie auf etwa 10 bis 15 Millimeter zu verlängern. Führen Sie eine scharfe Dissektion durch, indem Sie die geschlossenen Spitzen der Schere in den Schnitt einführen und dann öffnen, um das Peritoneum der linken Flanke von der Haut und dem Weichgewebe zu trennen. Führen Sie mehrmals eine scharfe Dissektion durch, um eine Hauttasche an der linken Flanke zu erzeugen.
Legen Sie die eingekapselte, intakte, von Spendern abgeleitete Tumormasse in die Tasche. Schließen Sie den Schnitt durch eine unterbrochene Naht und verwenden Sie zwei oder drei Stiche für jeden Einschnitt. Desinfizieren Sie die Haut um den Schnitt mit Baumwolle, die in Povidon-Jod getränkt ist.
Stellen Sie die Maus in die seitliche Position in einen sauberen und warmen Käfig. Überwachen Sie es kontinuierlich, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die sternale Liegefähigkeit aufrechtzuerhalten. Verabreichen Sie Buprenorphin subkutan in einer Dosis von 0,1 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht alle acht Stunden, für insgesamt drei Dosen.
Geben Sie den Transplantatempfänger erst dann an die Gesellschaft anderer Tiere zurück, wenn er sich vollständig erholt hat. Mittels Durchflusszytometrie konnten zwei Populationen von CD44-negativen und CD8-positiven Tumorantigen-spezifischen T-Zellen in der Tumormikroumgebung leicht identifiziert werden, einschließlich CD45.1-positiver Spender-abgeleiteter und CD45.1-negativer und CD45.2-positiver Empfänger-abgeleiteter tumorinfiltrierender CD8-positiver T-Zellen. Am zweiten Tag nach der Transplantation befanden sich etwa 83% der von Spendern abgeleiteten antigenspezifischen CD8-positiven T-Zellen im transplantierten Tumor, häufiger als ihre vom Empfänger abgeleiteten Gegenstücke.
Der Anteil der vom Empfänger abgeleiteten OT-1-Zellen war im späten Stadium der Tumorgenese erhöht und übertraf die tumorinhärenten OT-1-Zellen, die vom Spender stammten. Das Wichtigste, woran Sie sich erinnern sollten, ist, dass Sie während der subkutanen Tumortransplantation eine sanfte Dissektion durchführen, um Verletzungen des umgebenden Gewebes, insbesondere im körnigen Lymphknoten, zu vermeiden.
