Das Protokoll ist von Bedeutung, da es die Isolierung und Transfektion von Pigmentepithelzellen von fünf Säugetieren als optimales System zur Untersuchung der okulären Gentherapie in verschiedenen Setups zeigt. Der Hauptvorteil dieser Methode ist ihre Flexibilität, Übertragbarkeit, hohe Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Transfektionsrate aufgrund der fünf Spezies und des verwendeten nicht-viralen SB100X-Transposonsystems. Diese Techniken wurden entwickelt, um gentherapeutische Ansätze zu untersuchen, die auf netzhaut- und Irispigmentepithelzellen abzielen, die im vorliegenden Protokoll isoliert und transfiziert werden, aber für jede Augenforschung verwendbar sind.
Das Verfahren wird Gregg Sealy, ein Techniker aus dem Labor, demonstrieren. Nachdem Sie das Tier eingeschläfert haben, verwenden Sie eine gekrümmte Schere und eine Colibri-Pinzette, um die Augen zu enukleieren, und reinigen Sie dann das verbleibende Muskelgewebe und die Haut von den Augen. Sammeln Sie die Augen in einem 50-Milliliter-Röhrchen, das mit unsterilem PBS gefüllt ist, und übertragen Sie das Röhrchen auf die Laminar-Flow-Haube.
Desinfizieren Sie sie, indem Sie zwei Minuten lang in Jodlösung eintauchen, und übertragen Sie dann die Augen auf ein 50-Milliliter-Röhrchen, das mit sterilem PBS gefüllt ist. Legen Sie ein Auge auf eine sterile Mullkompresse und halten Sie das Auge fest an den Sehnerv. Dann schneiden Sie in der Nähe der Grenze der Iris mit einem Skalpell Nummer 11.
Schneiden Sie mit einer Schere um die Iris herum und entfernen Sie das vordere Segment und legen Sie es in eine Petrischale, wobei Sie die Zwiebel mit dem Glaskörper belassen, bis das retinale Pigmentepithel oder DIE RPE-Zellen isoliert sind. Um Irispigmentepithel- oder IPE-Zellen zu isolieren, entfernen Sie die Linse mit einer feinen Pinzette und ziehen Sie die Iris, die die IPE-Zellen enthält, vorsichtig heraus. Legen Sie die Iris in eine Petrischale und waschen Sie sie mit sterilem PBS.
Fügen Sie 500 Mikroliter 0,25% Trypsin hinzu und inkubieren Sie für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie das Trypsin, fügen Sie 500 Mikroliter komplettes Medium hinzu und kratzen Sie das IPE vorsichtig mit einer flachen, feuerpolierten Pasteurpipette. Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.
Zählen Sie die Zellen mit der Neubauer-Kammer und säen Sie 0,2 Millionen Zellen pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte mit einem Milliliter vollständigem Medium. Legen Sie die Platte in einen Inkubator und kultivieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Um RPE-Zellen zu isolieren, entfernen Sie den Glaskörper und die Netzhaut mit einer dünnen Pinzette aus dem hinteren Segment.
Legen Sie die Zwiebeln in die 24-Well-Platte und fügen Sie 500 Mikroliter von 0,25% Trypsin pro Auge hinzu und inkubieren Sie für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie Trypsin, fügen Sie 500 Mikroliter komplettes Medium pro Globus hinzu und kratzen Sie die RPE-Zellen vorsichtig mit einer gekrümmten, feuerpolierten Pasteurpipette. Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.
Zählen Sie die Zellen mit der Neubauer-Kammer und säen Sie die Zellen wie zuvor beschrieben aus. Legen Sie die Platte in den Inkubator. Reinigen Sie das verbleibende Muskelgewebe und die Haut von den Augen und desinfizieren Sie die Augen in jodbasierter Lösung und spülen Sie sie mit PBS aus.
Um IPE-Zellen zu isolieren, entfernen Sie die Linse und ziehen Sie die Iris wie zuvor beschrieben heraus. Nachdem Sie zwei Iris vorbereitet haben, fügen Sie einen Milliliter komplettes Medium hinzu und isolieren Sie die Zellen, indem Sie mit einer flachen, feuerpolierten Pasteur-Pipette kratzen, dann zählen und säen Sie die Zellen. Legen Sie die Platte in den Inkubator.
Um RPE-Zellen zu isolieren, entfernen Sie den Glaskörper und die Netzhaut aus dem hinteren Segment und legen Sie die Zwiebel in eine Petrischale. Füllen Sie die Glühbirne mit einem Milliliter kompletten Medium. Entfernen Sie die RPE-Zellen mit einer gekrümmten, feuerpolierten Pasteurpipette.
Sammeln Sie die Zellsuspension in der Glühbirne mit einer 1.000 Mikroliter Pipette und geben Sie sie zur Rückgewinnung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Dann zählen und säen Sie die Zellen und inkubieren Sie die Platte wie zuvor gezeigt. Öffnen Sie nach der Reinigung das Auge und schneiden Sie um die Iris herum, um das vordere Segment zu entfernen, und legen Sie es dann in eine Petrischale.
Lassen Sie die Zwiebel mit dem Glaskörper, bis die RPE-Zellen isoliert sind. Um IPE-Zellen zu isolieren, wenn die Linse mit dem vorderen Segment geliefert wird, entfernen Sie die Linse und verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Iris, die die IPE-Zellen enthält, vorsichtig herauszuziehen. Legen Sie die Iris in eine Petrischale und waschen Sie sie mit sterilem PBS.
Schneiden Sie den Ziliarkörper mit einem Skalpell Nummer 10 ab. Nachdem Sie die Iris vorbereitet haben, inkubieren Sie sie mit zwei Millilitern 0,25% Trypsin bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie das Trypsin und fügen Sie zwei Milliliter komplettes Medium hinzu, dann isolieren Sie die Zellen, indem Sie mit einer flachen, feuerpolierten Pasteurpipette kratzen.
Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen für 10 Minuten bei 120 mal G.Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Zellen in zwei Millilitern vollständigem Medium. Säen Sie 0,32 Millionen Zellen pro Vertiefung in einer Sechs-Well-Platte in drei Millilitern komplettem Medium. Legen Sie die Platte in einen Inkubator und kultivieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Um RPE-Zellen zu isolieren, entfernen Sie den Glaskörper und die Netzhaut mit einer Pinzette aus dem hinteren Segment. Vermeiden Sie es, das retinale Pigmentepithel zu beschädigen. Waschen Sie die Glühbirne mit PBS.
Nachdem Sie beide Augen vorbereitet haben, füllen Sie die Zwiebel etwa zu drei Vierteln mit Trypsin und inkubieren Sie für 25 Minuten bei 37 Grad Celsius mit dem Petrischalendeckel auf dem Zwiebelauge. Entfernen Sie das Trypsin und fügen Sie einen Milliliter des vollständigen Mediums hinzu. Entfernen Sie die RPE-Zellen mit einer gekrümmten, feuerpolierten Pasteurpipette.
Sammeln Sie die Zellsuspension in der Glühbirne und geben Sie sie zur Wiederverwendung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen für 10 Minuten bei 120 mal G.Seed 0,32 Millionen Zellen pro Vertiefung in einer Sechs-Well-Platte in drei Millilitern komplettem Medium. Legen Sie die Platte in einen Inkubator und kultivieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator. Nach drei bis vier Tagen pipettieren Sie auf und ab, um nicht adhärente Zellen zu sammeln, und geben Sie die Hälfte des Volumens in eine andere Vertiefung. Füllen Sie den Brunnen auf einen Milliliter mit komplettem Medium.
Wiederholen Sie nach weiteren drei bis vier Tagen die Zellentnahme, diesmal die nicht adhäsiven Zellen aus zwei Vertiefungen in einer. Fügen Sie allen Vertiefungen Medium hinzu. Beobachten Sie die Zellen und wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche.
Wenn die Zellen den Zusammenfluss erreichen, wechseln Sie zu einem vollständigen Medium mit 1% FBS. Mit den oben genannten Protokollen wurden IPE- und RPE-Zellen erfolgreich isoliert und aus fünf verschiedenen Spezies kultiviert. Das RPE-Expressionsmuster wurde in primären bovinen IPE-Zellen durch Immunfluoreszenz für RPE65 bestätigt.
Die Zelllebensfähigkeit wurde untersucht, um eine potenzielle Toxizität des Elektroporationspuffers unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Zytotoxizitätstestkits und einer knotenelektroporierten Kontrolle auszuschließen. Es wurde kein Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen beobachtet. Vorkultivierte Pigmentepithelzellen verschiedener Spezies wurden mit dem gelb fluoreszierenden Venusprotein transfiziert.
Transfizierte RPE19-Zellen wurden als Positivkontrolle verwendet. Die Quantifizierung der Transfektionseffizienz in vorkultiviertem Schweine-RPE ist hier dargestellt. Frisch isolierte Kaninchenpigmentepithelzellen wurden mit dem gelb fluoreszierenden Protein Venus transfiziert und mikroskopisch überwacht.
Pigmentepithelzellen wurden mit einem von Pigmentepithel abgeleiteten Faktor transfiziert und die Proteinsekretion wurde durch Western Blot überwacht. Das Signal für transfizierte Zellen war im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen für alle untersuchten Spezies und Tage höher, und innerhalb dieser Zeit wurde keine Abnahme der Proteinsekretion beobachtet. Es ist wichtig, das Abkratzen der Zellen mit scharfen Werkzeugen zu vermeiden.
Hier werden feuerpolierte Pasteurpipetten verwendet, außer in kleinen Mausaugen, wo ein rundes Skalpell verwendet werden muss. Pigmentepithelzellen können verwendet werden, um gentherapeutische Ansätze zu entwickeln und pathologische Zustände, zum Beispiel oxidative Stressschäden, zu simulieren. Diese Modelle können auch verwendet werden, um therapeutische Medikamente zu testen.
