Diese Studie wurde teilweise durch die BrightFocus Foundation (für DS) finanziert.

Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Themen wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an Universität von Pittsburgh genehmigt
1. bereiten Sie Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie Wachstumsmedium von ergänzenden Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM), hoher Blutzucker mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin, 2,5 mM L-Glutamin und 1 X MEM nichtessentiellen Aminosäuren. Vorwärmen der Medien in 37 ° C Inkubator vor Gebrauch.</li>
	<li>Bereiten Sie 2 % (wt/Vol) Dispase II funktionierende Lösung:<ol>
<li>Bereiten Sie eine Stammlösung von 100 mg/mL Dispase II durch Auflösen von 30 mg von Dispase II in 300 µL HEPES gepufferten Kochsalzlösung (50 mM HEPES/KOH pH 7.4, 150 mM NaCl). Dieser Band ist für 3 bis 4 Mäuse, skaliert oder unten basierend auf der Anzahl von Mäusen für das Experiment werden kann). Dieser Bestand kann für mindestens 1 Woche bei 4 ° c gelagert werden</li>
		<li>Bereiten Sie die Arbeitslösung des 2 % Dispase durch Zugabe von 300 µL von 100 mg/mL Dispase II bestand bis 1,2 mL sterile DMEM, hoher Blutzucker und die Lösung durch einen 0,22 µm-Filter filtern. Dieser Schritt sollte in die laminare Strömung Kabinett unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Vorwärmen der vorbereiteten Dispase II in 37 ° C Inkubator vor Gebrauch.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. erhalten die Maus-Augen
<ol><li>Einschläfern Sie die Maus mit einer anerkannten Methode und legen Sie es auf einer saugfähigen Unterlage.</li>
	<li>Tragen von Handschuhen, legen Sie Daumen und Zeigefinger um das Auge herum und schieben Sie die Haut, Proptose des Augapfels.</li>
	<li>Legen Sie die Spitze des abgewinkelten Schere zwischen der Haut und den Augapfel und schneiden Sie vorsichtig aus dem Auge. Um Kontaminationen zu vermeiden, kurz Tauchen Sie das Auge in 70 % igem Ethanol.</li>
	<li>Sofort setzen Sie das Auge in der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einer Petrischale.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2-2.4, das zweite Auge zu entfernen.</li>
</ol>3. Auge Dissektion
<ol><li>Entfernen Sie vorsichtig Bindegewebe aus dem Auge unter dem sezierenden Mikroskop. Dies kann entweder mit PBS-Puffer oder auf dem trockenen Petrischale erfolgen.<ol>
<li>Verwenden Sie näht Zange zu heben das Bindegewebe aus dem Augapfel und schneiden sie Sie mit einer Schere Vannas. Geschnitten Sie die Lederhaut nicht, weil es praktisch unmöglich, die intakten hinteren Augenmuscheln zu erhalten, wenn der Sklera geschnitten wird.</li>
		<li>Nach der Reinigung des Bindegewebes, halten die resultierende Augäpfel mit PBS-Puffer für den nächsten Schritt waschen. Hinweis: Die folgenden Schritte sollten in die laminare Strömung Kabinett unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie die Augen zweimal in vorgewärmten 37 ° C DMEM (hoher Blutzucker). Die Augäpfel in die vorgewärmte 37 ° C DMEM (hohe Glukose) mit Pinzette sorgfältig zu übertragen. Aspirieren Sie das Medium und Transfer Augäpfel, frisches Medium in ein neues Gericht.</li>
	<li>Aspirieren Sie DMEM (hohe Glukose) Medium und inkubieren Sie die Augen in die vorgewärmte 2 % (wt/Vol) Dispase II funktionierende Lösung für 45 min im Inkubator 37 ° C. Hinweis: In den folgenden Schritten legen und Augen oder Augenmuscheln in das Wachstumsmedium, die schützt des Gewebes und bieten ein gutes Medium für die Dissektion zu manipulieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Dispase II Lösung und waschen Sie die Augen zweimal in Wachstumsmedium, indem das alte Medium Absaugen und das neue vorgewärmte 37 ° C Wachstumsmedium (Abbildung 1a). Hinweis: Nach der Dissoziation von Dispase II, die Augäpfel weich werden.</li>
	<li>Halten Sie das Auge mit Zange und einen Einschnitt in die Ora Serrata jedes Auges mit Vannas Schere unter dem sezierenden Mikroskop in die laminare Strömung Schrank gelegt.<ol>
<li>Halten den Augapfel in der Lösung, vorsichtig entfernen der vorderen Hornhaut durch den Schnitt um die Ora Serrata Umfang erweitert und die vordere Hornhaut wegziehen, nachdem der Schnitt abgeschlossen wurde.</li>
		<li>Entfernen Sie die Linsenkapsel und damit verbundenen Iris pigmentiert Epithel durch leichtes Ziehen sie aus der Augenmuschel mit umgezahnten Zangen (Abbildung 1 b, 1 c).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die daraus resultierenden posterioren Augenmuscheln in das Wachstumsmedium für 20 min bei 37 ° C, Trennung der neuronale Netzhaut von RPE zu erleichtern.</li>
	<li>Schneiden Sie die hinteren Augenmuscheln in 4 Blütenblätter unter dem sezierenden Mikroskop platziert in die laminare Strömung Kabinett. Die Kürzungen sollten lang genug zu glätten die Augenmuschel, aber kurz genug, um die Blütenblätter verbunden (Abbildung 1-d) zu halten sein.<ol>
<li>Die Augenmuschel glätten und entfernen die neuronale Netzhaut sehr vorsichtig mit der Pinzette herausziehen halten die restlichen RPE-Aderhaut-Lederhaut-Komplex mit einem anderen Zangen (Abbildung 1e). Starten Sie ziehen an den Kanten und nicht von der Mitte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie die geviertelten Gewebe in eine neue sterile Kulturschale mit vorgewärmten 37 ° C Wachstumsmedium gefüllt.</li>
</ol>4. Isolierung der primären RPE-Zellen
<ol><li>Holding ein Blütenblatt der geviertelten RPE-Aderhaut-Sklera Anlage mit super feine Pinzette, vorsichtig abziehen die intakte Blätter des RPE aus der zugrunde liegenden Basalmembran (Bruch Membran) mit einem mikrochirurgischen sichelförmigen Messer unter dem sezierenden Mikroskop in der Laminar-Flow Kabinett (Abb. 1f) gelegt.<ol>
<li>Übertragen Sie die RPE-Blätter in der neuen sterilen Kulturschale mit Wachstumsmedium mithilfe einer Mikropipette P200. Bei der Übertragung von RPE Blätter nass Pipettenspitzen mit Wachstumsmedium durch Pipettieren mehrmals zu verhindern, dass Gewebe innerhalb der Spitze festhalten. RPE werden deutlich unterscheidbar von der Aderhaut: RPE sieht mehr bräunlich, während Aderhaut dunkler ist und klebrig und flauschig sieht.</li>
		<li>Alternativ verwenden Sie, enzymatischen Verdauung und sanfte Dissoziation ohne Zange um die RPE aus der Aderhaut14lösen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die RPE Blätter 2-3 Mal mit vorgewärmten 37 ° C zu waschen Wachstumsmedium in der sterilen Kulturschale. Nach jedem Waschen sammeln Sie sorgfältig die RPE-Blätter unter Vermeidung andere Gewebe wie Schutt der Netzhaut oder Aderhaut. Am Ende der letzten Wäsche sammeln Sie die RPE-Blätter mit einer Mikropipette P200 und legen Sie sie in einen neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Hinweis: Es gibt keine Notwendigkeit, die RPE Blätter Zentrifuge: sie werden Sediment durch die Schwerkraft innerhalb von 1 min.</li>
	<li>Entfernen Sie das zusätzliche Wachstum-Medium mit einer Mikropipette P200. Zellen im frischen vorgewärmten Wachstumsmedium Aufschwemmen und sanft genannte mit einer Mikropipette P200. Vermeidung von Blasenbildung. Eine einzelne Zelle Suspension ist ideal, aber auch vermeiden, zuviel Verreibung, ansonsten RPE-Zellen sind nicht in der Lage zu überleben. Wir empfehlen sehr sanft Verreibung für 40 - 50 Mal.</li>
</ol>5. Kultivierung RPE-Zellen
<ol><li>Die Zellen in einer Kultur-Platte-Platte.<ol>
<li>Downstream-Anwendungen der RPE Zellen benötigen Beibehaltung ihrer Polarität, Zellen Platte RPE von 2 Mäuse in einem 12 mm Polyester Membran einfügen vorinstalliert in Kultur 12-Well-Platten. Die Zellen in hoher Dichte Beschichtung ist erwünscht, denn in diesem Fall RPE-Zellen in der Lage, die ursprünglichen Eigenschaften, wie z. B. sechseckige Form und Pigmentierung zu halten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nicht verschieben Sie die Platte zu oder ändern Sie das Wachstumsmedium für die ersten 72 h der Kultivierung. Ersetzen Sie nach 3 Tagen das alte Medium durch das frisch vorgewärmte Wachstumsmedium. Danach ändern Sie das Kulturmedium jeden zweiten Tag. Sobald RPE-Zellen confluency erhalten, reduzieren Sie die FBS im Wachstumsmedium um 2 %. Hinweis: Die Zellen können mit 0,25 % Trypsin gespalten werden. Jedoch nach der Trennung können die Zellen verlieren ihre sechseckige Form und Pigmentierung in den folgenden Passagen. Wir empfehlen nicht, die Zellen teilen, aber wenn es, durch die downstream-Anwendungen der Kultur erforderlich ist, beachte bitte, dass auf unbestimmte Zeit die primäre Zellen passagiert werden kann nicht: sie sind dafür bekannt, de-nach ca. 5-7 Passagen zu unterscheiden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mart&#237;nez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development:+a+view+from+the+retina+pigmented+epithelium.">Eye development: a view from the retina pigmented epithelium.</a> Bioessays. 26, 766-777 (2004).</li><li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells:+past,+present+and+future.">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).</li><li>Fronk, A. H., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+retinal+pigment+epithelial+cells:+a+review+of+current+protocols+and+future+recommendations.">Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations.</a> J Tissue Eng. 7, (2016).</li><li>Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+properties+of+cultured+retinal+pigment+epithelium.">Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium.</a> Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).</li><li>Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+melanin-related+genes+in+cultured+adult+human+retinal+pigment+epithelium+and+uveal+melanoma+cells.">Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells.</a> Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).</li><li>Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+melanin+and+lipofuscin+in+RPE+cell+culture+models.">Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models.</a> Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).</li><li>Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Stem+Cell+(RPESC).">Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC).</a> Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).</li><li>Akrami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+culture;a+potential+source+of+retinal+stem+cells.">Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells.</a> J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).</li><li>Hu, J., Bok, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+in+studies+of+the+classical+retinoid+visual+cycle+and+retinoid-based+disease+processes.">The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes.</a> Exp Eye Res. , 46-50 (2014).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis:+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture.">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).</li><li>Reichhart, N., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+and+transporters+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium.</a> Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).</li><li>Valapala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal-mediated+waste+clearance+in+retinal+pigment+epithelial+cells+is+regulated+by+CRYBA1/&#946;A3/A1-crystallin+via+V-ATPase-MTORC1+signaling.">Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/&#946;A3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling.</a> Autophagy. 10, 480-496 (2014).</li><li>Shang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acid+transporter+SLC36A4+regulates+the+amino+acid+pool+in+retinal+pigmented+epithelial+cells+and+mediates+the+mechanistic+target+of+rapamycin,+complex+1+signaling.">The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling.</a> Aging Cell. , (2017).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).</li><li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium:+Special+Issue.">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).</li><li>Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+and+artificial+substrates+for+retinal+pigment+epithelial+monolayer+transplantation.">Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation.</a> Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).</li><li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).</li><li>Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+of+retinal+pigment+epithelium+following+isolation+with+a+gelatin+matrix+technique.">Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique.</a> Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).</li><li>Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+three-step+protocol+for+live+imaging+of+intracellular+traffic+in+polarized+primary+porcine+RPE+monolayers.">A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers.</a> Exp Eye Res. , 74-85 (2014).</li><li>Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+phagocytosis+by+retinal+pigmented+epithelium+that+lacks+myosin+VIIa,+the+Usher+syndrome+1B+protein.">Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).</li><li>Pitk&#228;nen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+retinal+pigment+epithelium:+effects+of+permeant+molecular+weight+and+lipophilicity.">Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).</li><li>Mao, Y., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+by+RPE+cells+in+culture.">Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture.</a> Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).</li></ol>

DS hat Forschungsförderung von F. Hoffmann-La Roche, Bayer HealthCare, Deutschland und der Schweiz erhalten. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen. Diese Arbeit stützt sich auf Forschung, um zu verhindern, dass Blindheit (uneingeschränkte Zuschüsse an die Wilmer Eye Institute und der University of Pittsburgh).  Diese Arbeit wird auch von Startkapital für DS von Augenheilkunde, University of Pittsburgh unterstützt.

Die vorgestellte ausführliche Protokoll ermöglicht zuverlässige Einrichtung des Maus RPE Primärkulturen, die Konfluenz nach 1 Woche zu erreichen und die Hauptmerkmale der RPE wie sechseckige Form und Pigmentierung nach 2 Wochen. Die gewonnenen RPE-Zellen für eine Anzahl von downstream-Anwendungen wie z. B. Vitamin A Stoffwechsel9, Phagozytose der Photorezeptor Außensegmenten10 und Ionen-Transport11, Epithelzelle Polarität2</s...

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine einlagige polarisierten epithelialen Zellen, die sich zwischen der neuronale Netzhaut und der Aderhaut des Auges befindet. Die Funktionalität der RPE-Zellen und die Integrität des RPE Monolayer sind entscheidend für Vision, weil die RPE spielt eine wichtige Rolle in mehreren Prozessen wie Erhaltung der äußeren Blut-Retina-Schranke, Transport von Wasser und Ionen zwischen der Netzhaut und die Aderhaut, Licht-Absorption, Schutz vor oxidativem Stress, Kontrolle der Retinoid Stoffwechsel und Phagozytose der äußeren Segmente der Photorezeptoren1,2. Die Lage des RPE auf der Rückseite des Auges, sowie seine Barrierefunktion aus vorbei aus dem Blut zu den Glaskörper systemisch verabreichten Medikamente zu verhindern erschweren es, die Komplexität des RPE Funktion in Vivozu untersuchen. So gibt es ein großes Bedürfnis für die Einrichtung von RPE Zellkulturen, die RPE-Zellen in einem flexiblen, kontrollierten Umgebung3,4zu studieren.
Es gibt eine Reihe von etablierten Zelllinien RPE, bietet eine einfache und bequeme Möglichkeit der Gewinnung und Lagerung der Zellen; passagiert Zellen haben jedoch einige Nachteile im Vergleich zu Primärzellen2,3,4. Erstens sind sie oft durch Veränderungen der Zellmorphologie gekennzeichnet. Keiner der existierenden Zelllinien fanden sich beispielsweise für eine zuverlässige Studie über die RPE-Barriere-Eigenschaften durch den Verlust der Zelle Polarität Phänotyp und teilweise verschwinden der tight Junctions4geeignet. Neben dem Verlust der Polarität und korrekte Zell-Zell-Verbindungen verlieren die RPE-Zell-Linien schnell ihre Pigmentierung aufgrund des Fehlens der wichtigsten Melanogenese Enzyme in den Erwachsenen RPE-5. Die Pigmentierung kann wiederhergestellt werden, aber die umfassende Analyse des Mechanismus der Re-Pigmentierung, also auch für eine Kombination von Transmissions-Elektronenmikroskopie, gen Ausdruck Analyse und chemische Tests bestätigen das Vorhandensein von Melanin hat nie Sie waren bereits im durchgeführten6. Eine weitere Einschränkung ist, dass die RPE-Zelllinien verlängerte Zelllebensdauer (manchmal - Unsterblichkeit) und unter bestimmten Bedingungen können selbst erneuernde multipotente Stammzellen, die aus dem Substrat und schwimmende Kolonien7, Form lösen verwandeln 8. diese Einschränkung macht es unmöglich, die Zelllinien für Transplantation3Experimente zu verwenden.
In Anbetracht der Nachteile der etablierten Zelllinien RPE vielleicht RPE Zellen Primärkulturen aus frischem Gewebe gewonnen mehr biologisch relevante RPE studieren Modellcharakter. Primäre RPE-Zellen werden nicht nur RPE-spezifische Funktionen zu studieren, wie z. B. Vitamin A-Stoffwechsel-9, Phagozytose der Photorezeptor Außensegmenten10 und Ionen-transport11, sondern auch grundlegende Zelle Biologie zu studieren, wie epithelialen Zelle Polarität2 , lysosomale Homöostase und Autophagie12,13.
In den letzten Jahren gab es eine Reihe von Publikationen über die Einrichtung von Primärkulturen RPE, zeigt ein wachsendes Interesse an diesem Bereich der Forschung3,14,15. Zahlreiche Protokolle für RPE-Zellen menschlichen und nichtmenschlichen RPE-Zellen wie Rinder und Schweine RPE-Zellen wurden veröffentlicht16,17,18,19. Es ist jedoch schwieriger zu handhaben Maus RPE-Zellen aufgrund ihrer viel kleineren Größe. Obwohl eine ganze Reihe von Publikationen Protokolle zu isolieren, RPE-Zellen von der Maus14,20,21beschrieben haben, gibt es noch viele Forscher, die kämpfen, um zu isolieren, RPE-Zellen ohne Kontamination der Aderhaut Zellen oder Zellen aus neuronale Netzhaut Schutt. Hier stellen wir das Protokoll für die Gründung der primäre Maustaste RPE Zellkultur, einschließlich des Erhalts der Augen von der Maus, Dissektion der Augen und der Isolation der RPE Blätter um die Zellen für die Kultivierung zu erzielen. Dieses video Protokoll wäre besonders nützlich für Forscher, die anfangen zu arbeiten mit Maus Primärkulturen RPE und brauchen Führung über die Präparation Techniken.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;animals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2~3-week old wildtype mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM), high glucose</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro</td><td>61-034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Ambion</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>RPE65 antibody</td><td>A gift from Dr. Michael Redmond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Phalloidin&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>F432</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11011&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00380</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Polyclonal Antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;instruments and equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow cabinet</td><td>Baker</td><td>SterilGARD SG403A</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope)</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator with hot air sterilization</td><td>Binder</td><td>C150</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &amp;micro;m, Sterile</td><td>Corning Incorporated</td><td>COR-3460</td><td></td></tr><tr><td>Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp</td><td>STEPHENS instruments</td><td>S7-1320</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo suturing forceps 0.12mm</td><td>Stroz Ophthalmic Instruments</td><td>E1796</td><td></td></tr><tr><td>Crescent straight knife</td><td>Beaver-Visitec International</td><td>373808</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors, 8 cm, 45&amp;deg; Angle, Standard</td><td>World Precision Instruments</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>SLGL0250S</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 5 mL</td><td>BD</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Laboratory Microscope&amp;nbsp;Leica DM IL LED</td><td>&amp;nbsp;Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barrier and non-filtered pipette tips</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine stark polarisierten multifunktionale Epithel, das liegt zwischen der neuronale Netzhaut und der Aderhaut des Auges. Es ist ein einzelnes Blatt der pigmentierten Zellen, die hexagonal verpackt und durch tight Junctions verbunden sind. Die Hauptfunktionen des RPE beinhalten Absorption von Licht, Phagozytose der Schuppen Photorezeptor äußeren Segmente, räumliche Pufferung von Ionen, Transport von Nährstoffen, Ionen und Wasser sowie aktive Beteiligung in der visuellen Zyklus. Mit solchen wichtigen und vielfältigen Funktionen ist es von entscheidender Bedeutung für die Biologie des RPE-Zellen zu studieren. Eine Reihe von RPE Zelllinien gegründet wurden; Allerdings sind Zellen passagiert und verewigt, einige der morphologischen und physiologischen Eigenschaften der natürlichen RPE-Zellen verlieren schnell bekannt. Primärzellen eignen sich daher eher für das Studium der verschiedenen Aspekte der RPE-Zellen-Biologie und Funktion. Maus RPE Zellen Primärkultur ist sehr nützlich, um Forscher da Mausmodellen in biologische Studien weit verbreitet sind, jedoch sammeln RPE Zellen von Maus auch aufgrund ihrer geringen Größe sehr anspruchsvoll. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die primäre Maustaste RPE Zellkulturen Einrichtung umfasst Enukleation und Dissektion der Augen und der Isolation der RPE Blätter um die Zellen für die Kultivierung zu erzielen. Diese Methode ermöglicht effiziente Zelle. Die RPE Zellen aus zwei Mäuse erreichen Konfluenz auf einer 12 mm Polyester Membran einfügen vorinstalliert in Kultur Platte nach einer Woche der Kultur und der Anzeige einige der ursprünglichen Eigenschaften von bona-fide RPE Zellen wie sechseckige Form und Pigmentierung nach zwei Wochen der Kultur.

Die Maus RPE Primärkultur 12 mm Polyester Membran einfügen erreicht 90-95 % Konfluenz nach 1 Woche in der Kultur von 2 Mäusen gegründet. Nach 2 Wochen der Kultur die Zellen erreicht 100 % Konfluenz und fing an, ein Mosaik aus sechseckigen, pigmentierte und Bi-kernhaltige Zellen bilden. Nach 3 Wochen der Kultur, die Zellen weiterhin die Form und Pigmentierung, bilden aber kam nach 4 Wochen ein Teil der Zellen hyperpigmentiert (Abbildung 2).
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Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine multifunktionale Epithel des Auges. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären Zellkulturen, abgeleitet von der murinen RPE zu etablieren.

Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

primary-cell-cultures-from-the-mouse-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Biology

21.0K Aufrufe.  University of Pittsburgh School of Medicine. Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine multifunktionale Epithel des Auges. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären Zellkulturen, abgeleitet von der murinen RPE zu etablieren.

Serie: Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

Experimentelle Modelle für das Studium der retinalen Pigmentepithelzellen Physiologie und Pathophysiologie

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Biologie

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

Langfristige, serumfreie Kultivierung organotypischer Maus-Retina-Explanten mit intaktem retinalen Pigmentepithel

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Charakterisierung und morphologische Dynamik von kultiviertem primärem murinem RPE

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Autor im Rampenlicht: Effiziente Isolierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen aus adulten Mäusen für die Retinopathie-Forschung

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Primärkultur von retinalen Pigmentepithelzellen des Schweins

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential application in molecular biology studies, including gene expression analyses. In the context of eye growth regulation and myopia, the RPE likely plays a role as a cellular relay for growth modulatory signals, as it is located between the retina and the two walls of the eye, such as the choroid and sclera. While protocols for isolating the RPE have been developed for both chicks and mice, these protocols have proven not to be directly translatable to the guinea pig, which has become an important and widely used mammalian myopia model. In this study, molecular biology tools were used to examine the expression of specific genes to confirm that the samples were free of contamination from the adjacent tissues. The value of this protocol has already been demonstrated in an RNA-Seq study of RPE from young pigmented guinea pigs exposed to myopia-inducing optical defocus. Beyond eye growth regulation, this protocol has other potential applications in studies of retinal diseases, including myopic maculopathy, one of the leading causes of blindness in myopes, in which the RPE has been implicated. The main advantage of this technique is that it is relatively simple and&#160;once perfected, yields high-quality RPE samples suitable for molecular biology studies, including RNA analysis.

We describe a simple and efficient method for isolating cells of the retinal pigment epithelium (RPE) cells from the eyes of young pigmented guinea pigs. This procedure allows for follow-up molecular biology studies on the isolated RPE, including gene expression analyses.

Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

Zusammenfassung

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Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

Langfristige, serumfreie Kultivierung organotypischer Maus-Retina-Explanten mit intaktem retinalen Pigmentepithel

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Primärkultur von retinalen Pigmentepithelzellen des Schweins

Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus

Isolierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus Meerschweinchenaugen