Retinales Pigmentepithel oder RPE ist entscheidend für die Gesundheit der Netzhaut. Und die Untersuchung des isolierten RPE ist entscheidend für die Netzhauterkrankung. Diese Methode der RPE-Isolierung aus dem Meerschweinchen, ein beliebtes Myopiemodell, hilft bei der Lösung des herausfordernden Problems.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie relativ einfach ist und qualitativ hochwertige RPE-Proben liefert, die für die biologischen molekularen Studien einschließlich der RPE-Analyse geeignet sind. Wenn man die demonstrierte Technik perfekt befolgt und beobachtet, wie man die Sezierwerkzeuge manipuliert, kann man dieses Verfahren mit etwas Übung schnell beherrschen. Nachdem Sie das Meerschweinchen human eingeschläfert und die Augen des Tieres enukleiert haben, waschen Sie die Augen sofort, indem Sie sie in eine 10-Zentimeter-Petrischale geben, die sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS enthält.
Übertragen Sie die Augen nach dem Waschen in eine frische PBS-Lösung. Verwenden Sie nun unter einem Präpariermikroskop eine 18-Gauge-Nadel, um eine erste kleine Öffnung in der Sklera eines Auges zu machen, etwa einen Millimeter hinter der Limbusgrenze zwischen Hornhaut und Sklera. Entfernen Sie mit einer Schere das vordere Segment, einschließlich der Hornhaut, der Iris, des Ziliarkörpers und der Augenlinse.
Arbeiten Sie dann mit einem verbleibenden hinteren Augensegment, greifen Sie mit einer Pinzette nach der Zonule von Zinn und ziehen Sie sanft daran, gefolgt von der Ablösung der Netzhaut vom RPE / Aderhaut / Sklera-Komplex und dem Abschälen der Netzhaut ohne Fragmentierung. Nachdem die Netzhaut vollständig entfernt wurde, tauchen Sie die verbleibende hintere Augenmuschel, die das RPE, die Aderhaut und die Sklera enthält, in eine der Vertiefungen einer 12-Well-Platte, die zwei Milliliter Gewebespeicherreagenz enthält, und lassen Sie sie fünf Minuten lang eintauchen. Um das Speicherreagenz wegzuspülen, geben Sie die Augenmuschel 10 Sekunden lang in eine andere Vertiefung, die mit vier Millilitern PBS gefüllt ist, bevor Sie sie in eine dritte Vertiefung geben, die mit zwei Millilitern PBS gefüllt ist.
Bevor Sie mit dem letzten RPE-Isolationsschritt fortfahren, bereiten Sie eine mit PBS gefüllte Ein-Milliliter-Spritze vor und bringen Sie eine 30-Gauge-Nadel an. Drücken Sie vorsichtig auf den Spritzenkolben, um einen Jetstream von PBS zu erzeugen. Wenn Sie unter einem Mikroskop arbeiten, richten Sie diesen PBS-Strom zunächst auf das RPE, um einen kleinen Riss oder ein Loch darin zu hinterlassen.
Richten Sie dann den PBS-Strom in die erzeugte Öffnung, um das RPE als Blatt von der Aderhaut zu lösen. Nachdem Sie das RPE von der Aderhaut gelöst haben, sammeln Sie die RPE-Zellen in einer nadellosen Ein-Milliliter-Spritze und überführen Sie die gesammelte Probe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit dem gesammelten RPE bei 8.000 x g eine Minute lang, um ein RPE-Pellet zu erhalten.
Für Proben, die in RNA-Analysen verwendet werden sollen, wird der Überstand, d. h. die PBS-Lösung, verworfen und durch 350 Milliliter Lysepuffer ersetzt, wie er in RNA-Isolationskits enthalten ist. Pipettieren Sie den Inhalt 20 Mal nach oben und unten, um sich gut zu mischen und die Qualität der Probe zu erhalten. Zur Langzeitlagerung und -konservierung die Proben in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius überführen.
Verwenden Sie ein RNA-Isolationskit und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um die RNA aus den RPE-Proben zu isolieren und zu sammeln, bevor Sie die Qualität der Probe durch Elektrophorese bewerten. In unserer Studie zeigten die gesammelten RPE-Proben gut erhaltene RNA mit einer RNA-Integritätszahl oder RIN von mehr als acht. Die Gesamt-RNA-Zahl beträgt etwa 240 Nanogramm pro Auge.
Das Expressionsniveau des RPE-spezifischen Gens Rpe65 war in den RPE-Proben signifikant höher als in Aderhaut und Sklera. Im Gegensatz dazu zeigten die RPE-Proben eine minimale Expression des ausgewählten Aderhaut-Sklera-spezifischen Gens, Kollagen Typ alpha-on, was auf das Fehlen von Aderhaut- und Sklerakontaminanten in den isolierten RPE-Proben hinweist. Der wichtigste Schritt des Eingriffs ist die sanfte Entfernung der Netzhaut, ohne ein Netzhautfragment zu hinterlassen.
Dieses RPE-Isolationsverfahren rechtfertigt eine Erklärung in vitro Zellkulturstudien mit einigen wichtigen Unterschieden, einschließlich der Wahl des Mediums zum Eintauchen der RPE-Zellen nach der Isolierung.
