Dieses Protokoll ermöglicht es, den Mechanismus der Inseltransplantation in weißes Fettgewebe zu beurteilen. Der Hauptvorteil dieser fettbedeckten Inseltransplantationsmethode besteht darin, dass sie technisch einfach zu replizieren ist. Die Methode kann auf andere Krankheitsmodelle angewendet werden.
Zum Beispiel kann es verwendet werden, um ein Mausmodell von Krebs zu erstellen. Naoaki Sakata, außerordentlicher Professor an der Universität Fukuoka, demonstriert das Verfahren. Verwenden Sie unter einem Seziermikroskop eine P 200-Mikropipette, um zusätzliche Inselbestandteile aus den Verdauungen der Bauchspeicheldrüse, einschließlich Azinus und fibrösem Gewebe, zu entfernen.
Verwenden Sie dann ein Zellsieb, um einzelne Azinuszellen herauszufiltern. Die gefilterten Inseln werden in eine neue Kulturschale überführt, die das entsprechende Kulturmedium oder die mit Rinderserum oder Albumin ergänzte Pufferlösung enthält, und schwenken Sie die Schale, um die Inseln in der Mitte zu positionieren. Nehmen Sie die einzelnen Inseln mit einer P 200 Mikropipette in ein geeignetes Auffangrohr.
Setzen Sie ein neues 40-Mikrometer-Zellsieb auf ein 50-Milliliter-Kunststoffrohr. Verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um die Inseln zum Sieb hinzuzufügen, um die Inseln und die einzelnen Azinuszellen zu trennen. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Sieb auf eine neue 60 oder 100 Milliliter große, unbehandelte Kulturschale umzudrehen, die Kulturmedium oder eine geeignete Pufferlösung enthält, ergänzt mit Rinderserum oder Albumin.
Verwenden Sie frisches Medium oder Puffer, um die Inseln in eine neue Kulturschale zu spülen, und fügen Sie dann genügend Medium oder Puffer zur Kulturschale hinzu, um ein Gesamtvolumen von etwa 20 Milliliter zu erreichen. Zählen Sie die Inseln unter dem Mikroskop und teilen Sie die Anzahl der Inseln gleichmäßig auf einzelne 1,5-Milliliter-Kunststoffzentrifugenröhrchen entsprechend der Anzahl der Spendertiere auf. Zentrifugieren Sie die Inseln bei 2, 100 G für eine Minute bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand.
Etwa 20 bis 30 Mikroliter Restlösung verbleiben typischerweise im Röhrchen. Nachdem Sie die Haare aus dem Bauch entfernt haben, um eine Infektion zu verhindern, legen Sie die Maus in Rückenlage. Nach der Desinfektion des Bauches und der Leistenregion schneiden Sie die Haut im unteren Mittelbereich ein, wodurch ein Hautschnitt entsteht, der etwa zwei Zentimeter lang ist.
Klemmen Sie die linke Bauchdecke mit einer Pinzette oder Retraktoren und ziehen Sie das Gewebe auf die linke Seite der Maus, um das Operationsfeld zu sichern. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um den Dünn- und Dickdarm auf der rechten Seite der Maus zu mobilisieren. Das linke epidermale weiße Fettgewebe in der Bauchhöhle befindet sich im linken Leistenbereich.
Mobilisieren Sie das epidermale weiße Fettgewebe und den linken Hoden nach außen und dehnen Sie das Gewebe aus. Verwenden Sie eine P 200-Mikropipette, um das gesamte Volumen der Inseln aus einem 1,5-Milliliter-Röhrchen zu sammeln, und achten Sie darauf, dass bei der Entnahme keine Inseln in der Röhre verbleiben. Lassen Sie die gesammelten Inseln durch die Schwerkraft in der Spitze der Pipette absetzen.
Legen Sie die Mikropipettenspitze leicht auf das aufgeblähte Fettgewebe und achten Sie darauf, eine übermäßige Spülung des Mediums oder einen Puffer in der Spitze zu vermeiden. Samen Sie die Inseln vorsichtig auf das Gewebe. Bestätigen Sie nach der Aussaat die korrekte Platzierung der Inseln unter einem Seziermikroskop.
Bedecken Sie die Inseln mit dem epidermalen weißen Fettgewebe, legen Sie dann den linken Hoden unter das episomale weiße Fettgewebe und führen Sie das Gewebe in die intraperitoneale Höhle zurück. Verschließen Sie die Haut in zwei Schichten mit einer 4-o-Naht. Wenn Sie fertig sind, legen Sie die Maus unter eine Wärmelampe und überwachen Sie sie bis zur vollständigen Genesung.
Um die Transplantationswirksamkeit der fettbedeckten Inseltransplantation mit der nach intraperitonealer Inseltransplantation zu vergleichen, wurde die gleiche Anzahl von Inseln auf das Peritoneum im linken parakolischen Raum von diabetischen Kontrolltieren implantiert. Es wurde beobachtet, dass der Blutzuckerspiegel von Mäusen mit fettbedeckter Inseltransplantation im Vergleich zu intraperitonealen Inseltransplantatmäusen allmählich und signifikant abnahm. Die intraperitoneale Glukosetoleranz wurde einen Monat nach der Transplantation durchgeführt.
Der Blutzucker bei Mäusen mit fettbedeckter Inseltransplantation wurde auf niedrigeren Werten gehalten als bei intraperitonealen Inseltransplantatmäusen. Die histologische Untersuchung wurde verwendet, um die Inseltransplantation in das epidermale weiße Fettgewebe zu beurteilen. Bei fettbedeckten Inseltransplantat-Empfängertieren zeigte die Hämatoxylin-Eozän-Färbung das Vorhandensein von Inseln im epidermalen weißen Fettgewebe.
Darüber hinaus erleichterte die fluoreszenzkonjugierte Antikörperfärbung von insulinpositiven Inseln den Nachweis von von-Willebrand-Faktor-positiven Mikrogefäßen im epidermalen weißen Fettgewebe aller Empfängermäuse. Um mit diesem Verfahren erfolgreich zu sein, stellen Sie sicher, dass sich die Inseln vollständig an der Spitze der Pipette absetzen und sie auf das Fettgewebe säen, ohne zu verschütten.
