Name: ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology
Uploaded: 2020-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Intramurale Forschung, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, unterstützt. S.H. wurde vom Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program unterstützt, und H.N. und K.Y. waren von Valor und V Drug Overseas Training Scholarship.

1. SDS-PAGE und Übertragung auf eine PVDF-Membran
<ol><li>Führen Sie SDS-PAGE aus, um Proteine basierend auf der relativen Größe zu trennen. HINWEIS: Jedes kommerzielle oder hausgemachte Gelsystem ist in Ordnung. Bitte folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.</li>
	<li>Übertragen Sie getrennte Proteine von einem Gel auf eine PVDF-Membran. HINWEIS: Häufige Übertragungsmethoden (halbtrockener oder nasser Transfer) sind geeignet. Bitte folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.</li>
</ol>2. Blockierung von PVDF-Membranen
<ol><li>Inkubieren Sie die Membranen in geeigneten Blockierpuffern für 1 h mit Rührung bei Raumtemperatur. HINWEIS: Abhängig vom primären Antikörper und Detektionssystem sollte ein geeigneter Blockierpuffer ausgewählt werden. Die typischsten Blocker sind beispielsweise BSA, fettfreie Trockenmilch, Casein und kommerzielle synthetische Polymere. PBS und/oder TBS mit 0,1% Tween20 sind die am häufigsten verwendeten Puffer. Dieser Sperrschritt kann über Nacht bei 4 °C erfolgen.</li>
</ol>3. Inkubation mit primärem Antikörper
<ol><li>Bereiten Sie 10% Immunreaktions-Verbesserungsmittel-1-Lösung (IRE-1) mit destilliertem Wasser vor. Wirbel gut.</li>
	<li>Bereiten Sie den verdünnten Primärantikörper mit 10% IRE-1 vor. Mischen Sie es sanft und gründlich.</li>
	<li>Bei Verwendung einer größeren Membran (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm) 8 ml der Antikörperlösung in 50 ml konische Zentrifugenrohre geben. Bei Verwendung einer kleineren Membran (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm) 3 ml der Antikörperlösung in 14 ml rundboden-Polypropylenrohr(Materialtabelle)geben.</li>
	<li>Nehmen Sie die PVDF-Membran mit einer Pinzette auf und entleeren Sie die Blockierlösung kurz. Setzen Sie die PVDF-Membran mit gehandicapten Fingern in dieses Rohr ein und stellen Sie sicher, dass die gesamte Membran an der Rohrwand haftet. Wenn die PVDF-Membran in eine Röhre eingeführt wird, stellen Sie sich der "Proteinseite" der Membran, die ursprünglich mit dem Gel nach innen in Berührung kam. Schließen Sie die Kappe fest.</li>
	<li>Legen Sie das 50 ml-Rohr für den Hybridisierungsofen in eine Glasflasche ein. HINWEIS: Wenn 14 ml Rohre für diese Inkubation verwendet werden, legen Sie ein 14 ml Rohr in das 50 ml Rohr ein, mit einem Paar Kunststoffringhalter, um das Innenrohr in der Mitte des 50 ml Rohres zu halten.</li>
	<li>Schalten Sie den Hybridisierungsofen ein.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit 6 Rpm-Drehung für mindestens 5 min. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Membran jederzeit an der Wand haftet und dass das (innere) Rohr horizontal ist, um die Membran gleichmäßig mit der Antikörperlösung zu bedecken. Kalibrieren Sie die Verdünnung des Antikörpers und die Inkubationszeit vor dem eigentlichen Experiment.</li>
</ol>4. Membranwäsche
<ol><li>Beenden Sie die Drehung.</li>
	<li>Entfernen Sie die PVDF-Membran vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Rohr und legen Sie die Membran in einen Behälter mit 50 ml PBS-T.</li>
	<li>Spülen Sie die Membran kurz mit PBS-T.</li>
	<li>Spülen Sie die Membran im Behälter mit destilliertem Wasser, bis keine Blasen auftreten. Dadurch wird der Großteil des Antikörpers entfernt.</li>
	<li>Übertragen Sie die PVDF-Membran aus dem Behälter auf den Salatspinner, der 250 ml PBS-T enthält.</li>
	<li>Legen Sie den Siebkorb in den Spinner. Stellen Sie sicher, dass der Deckel sicher aufgesetzt wurde.</li>
	<li>Aktivieren Sie den Spinner und führen Sie ihn für ca. 20-30 s aus.</li>
	<li>Entsorgen Sie die Lösung und spülen Sie das Innere des Spinners kurz mit destilliertem Wasser ab.</li>
	<li>Fügen Sie 250 ml PBS-T wieder in den Spinner ein.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.6 und 4.7.</li>
</ol>5. Inkubation mit dem sekundären Antikörper
<ol><li>Bereiten Sie 10% Immunreaktionsverbesserungsmittel-2-Lösung (IRE-2) mit destilliertem Wasser vor. Wirbel gut.</li>
	<li>Bereiten Sie den verdünnten Sekundärantikörper mit 10% IRE-2 vor. Mischen Sie es sanft und gründlich.</li>
	<li>Wählen Sie das Volumen der Antikörperlösung und des Rohres gemäß Schritt 3.3 aus.</li>
	<li>Nehmen Sie die PVDF-Membran mit einer Pinzette auf und lassen Sie die Lösung kurz abtropfen. Setzen Sie die PVDF-Membran gemäß Schritt 3.4 in das Rohr ein.</li>
	<li>Legen Sie das 50 ml-Rohr für den Hybridisierungsofen in eine Glasflasche ein.</li>
	<li>Schalten Sie den Hybridisierungsofen ein.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit 6 Rpm-Drehung für mindestens 5 min. Stellen Sie sicher, dass die Membran jederzeit an der Wand haftet und dass das (innere) Rohr horizontal ist, um die Membran gleichmäßig mit der Antikörperlösung zu bedecken. HINWEIS: Kalibrieren Sie die Inkubationszeit vor dem eigentlichen Experiment. Wenn der sekundäre Antikörper fluoreszierend konjugiert ist, führen Sie die Inkubation im Dunkeln durch.</li>
</ol>6. Membranwäsche
<ol><li>Folgen Sie den Schritten 4.1 bis 4.10.</li>
</ol>7. Bildaufnahme
<ol><li>Chemilumineszenz-Erkennung<ol>
<li>Legen Sie ein Stück halbtransplantierender flexibler Folie (10 cm x 15 cm) auf eine flache Oberfläche.</li>
		<li>Mischen Sie 2 Komponenten des chemilumineszierenden Substrats in einem 5 ml Rohr.</li>
		<li>1,5 ml des Mischsubstrats sofort auf die halbtransplantierbare flexible Folie übertragen und die PVDF-Membran darauf legen. Dann übertragen Sie den Rest der Substratlösung auf die Membran.</li>
		<li>Inkubieren Sie die PVDF-Membran mit dem gemischten Substrat auf einer halbtransparenten flexiblen Folie für 1 min.</li>
		<li>Nehmen Sie die PVDF-Membran mit einer Pinzette auf und entleeren Sie die Substratlösung kurz.</li>
		<li>Sandwich die Membran zwischen einem Paar Von-Transparenz-Filme.</li>
		<li>Erfassen Sie das Bild im chemilumineszierenden Modus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fluoreszierende Detektion<ol>
<li>Nehmen Sie die PVDF-Membran mit einer Pinzette auf und lassen Sie die Lösung kurz abtropfen.</li>
		<li>Sandwich die Membran zwischen einem Paar Von-Transparenz-Filme.</li>
		<li>Erfassen Sie das Bild im Fluoreszenzmodus. HINWEIS: Die Schritte 7.1 und 7.2 sollten in unmittelbarer Nähe zur Bildverarbeitungsmaschine durchgeführt werden, um eine maximale Empfindlichkeit zu gewährleisten.</li>
		<li>Wenn das Hintergrundsignal hoch ist, führen Sie einen Waschschritt in einem Behälter mit 80-100 ml PBS-T durch: 10 min Spülen 3 mal für den primären Antikörper und 5 min Spülung 6 mal für den sekundären Antikörper. HINWEIS: Sowohl primäre als auch sekundäre Antikörper, die mit 10% IRE-Lösungen verdünnt werden, können bis zu 8-10-mal ohne Verlust derEmpfindlichkeit6 verwendet werden. Die Lösung sollte bis zu einem Monat bei 4 °C aufbewahrt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>MacPhee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+for+improving+Western+blot+analysis.">Methodological considerations for improving Western blot analysis.</a> Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).</li><li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+critical+factors+for+quantitative+immunoblotting.">An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting.</a> Science Signaling. 8 (371), (2015).</li><li>Schuck, P., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mass+transport+limitation+and+surface+heterogeneity+in+the+biophysical+characterization+of+macromolecular+binding+processes+by+SPR+biosensing.">The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing.</a> Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).</li><li>Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eliminating+Size-Associated+Diffusion+Constraints+for+Rapid+On-Surface+Bioassays+with+Nanoparticle+Probes.">Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes.</a> Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).</li><li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+but+not+Obsolete:+An+Enhanced+High+Speed+Immunoblot.">Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot.</a> Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+Procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Western+blotting":+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).</li><li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+and+analysis:+next+generation+Western+blotting+techniques.">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li><li>Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+EGF+receptor+signaling+dynamics+with+microwestern+arrays.">Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays.</a> Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).</li><li>Treindl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-based+western+for+high-throughput+cellular+signal+transduction+analyses.">A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses.</a> Nature Communications. 7, 12852 (2016).</li><li>Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+western+blot+assay+by+rotational+cyclic+draining+and+replenishing+procedure.">Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure.</a> Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+other+notable+protein+detection+methods+on+blots.">A brief review of other notable protein detection methods on blots.</a> Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).</li><li>Nagase, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+and+Sensitive+Detection+of+Glycosaminoglycan+Chains+with+Immunoblots.">Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots.</a> Glycobiology. , (2020).</li></ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen für den Inhalt dieses Artikels für unmittelbar relevant erklärt.

Western Blot ist eine weit verbreitete analytische Technik zum Nachweis spezifischer Proteine, die vor 40 Jahren entwickelt wurde7,8. Seitdem hat sich die Technik weiterentwickelt, mit nachfolgenden Innovationen zur Verbesserung der Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Quantifizierung der Technik2,9,10,11,12...

Ein western blot (auch bekannt als Immunoblot) ist eine leistungsstarke und grundlegende Technik in einer breiten Palette von wissenschaftlichen und klinischen Disziplinen. Diese Technik wird verwendet, um das Vorhandensein, die relative Häufigkeit, die relative Molekularmasse und posttranslationale Modifikationen von Proteinen1zu untersuchen. In Kombination mit der digitalen Bildanalyse kann diese Methode zuverlässig die Fülle von Proteinen und Proteinmodifikationen analysieren2. Obwohl Western Blot routinemäßig durchgeführt wird, ist es eine zeitaufwändige und arbeitsintensive Methode. Lange Inkubationen des Antikörpers mit Membranen sind erforderlich. Hier beschreiben wir eine Modifikation der Inkubationsmethode, die diese Einschränkung überwindet, ohne die Empfindlichkeit zu opfern.
Während der Inkubation der Membran schwimmen Antikörper in Lösung, während Antigene auf der Membran immobilisiert werden. Aufgrund ihrer hohen Affinität ist die Rate der Antikörperbindung an das Antigen schneller als die Diffusion von Antikörpern aus der Massenlösung zur Membran. Dadurch entsteht eine "Erschöpfungsschicht" mit geringer Konzentration (Abbildung 1). Es kann Stunden dauern, bis weiter entfernte Antikörper die Membran über passive Diffusion erreichen, was der Hauptfaktor für lange Inkubationszeiten in dieser Technik ist. Dieser Effekt wird als Massentransportbegrenzung (MTL)3bezeichnet. Es wurde vorgeschlagen, dass das wiederholte Entleeren und Auffüllen der antikörperhaltigen Lösung die Erschöpfungsschicht stören und MTL4überwinden kann. Hier haben wir eine einzigartige Technik entwickelt, die dieses cyclic Draining and Replenishing (CDR) Konzept implementiert, um die Wirkung von MTL in einem traditionellen westlichen Blotting-Protokoll zu verringern und die erforderliche Inkubationszeit zu verkürzen.
Um die Detektionsempfindlichkeit mit einer kurzen Inkubationszeit aufrechtzuerhalten, haben wir eine Immunreaktionsverbesserungstechnologie verwendet, die die Antigen-Antikörper-Reaktion beschleunigt und dadurch das Signal-Rausch-Verhältnis5verbessert. Viele kommerziell erhältliche Immunreaktions-Verbesserungsmittel (IRE) bestehen aus 2 Komponenten (Lösung 1 und 2, siehe Materialtabelle). Die proprietäre Zusammensetzung oder der Wirkmechanismus von IRE wurde nicht offenbart, aber wir haben zuvor festgestellt, dass IRE die Dissoziationskonstante zwischen Antigen und Antikörper in festen Phasenbindungstests verringerte, was darauf hindeutet, dass eine erhöhte Affinität zumindest teilweise für die verstärkende Wirkung von IRE6verantwortlich ist. Die Kombination von CDR und IRE ergibt ein ultrahochschnelles Western-Blotting-Protokoll, das die gesamte Prozesszeit reduziert, ohne die Empfindlichkeit zu opfern.

<table><tbody><tr><td>14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Apollo Transparency Film for Laser Printers</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.</td></tr><tr><td>Azure Imaging System 600</td><td>Azure Biosystems</td><td>Azure 600</td><td>Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.</td></tr><tr><td>Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution</td><td>TOYOBO</td><td>NKB-101</td><td></td></tr><tr><td>CARNATION Instant Nonfat Dry Milk</td><td>Carnation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab&amp;rsquo;)2 fragment from sheep</td><td>GE Healthcare</td><td>NA9310V</td><td></td></tr><tr><td>ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab&amp;rsquo;)2 fragment from donkey</td><td>GE Healthcare</td><td>NA9340V</td><td></td></tr><tr><td>HYBAID Micro-4</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.</td></tr><tr><td>Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 &amp;micro;m pore size</td><td>Millipore Sigma</td><td>IPVH304F0</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td><td>LICOR</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td><td>LICOR</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate</td><td>seracare</td><td>5430-0049</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-&amp;szlig; actin antibody</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking Buffer (PBS)</td><td>LICOR</td><td>927-40100</td><td>Blocking Buffer for fluorescent detection</td></tr><tr><td>OXO Salad Spinner</td><td>OXO</td><td>32480V2B</td><td>Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.</td></tr><tr><td>Parafilm Sealing Film</td><td>Bemis</td><td>Parafilm M PM996</td><td>semi-transparent flexible film</td></tr><tr><td>Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Prepared in a machine shop</td></tr><tr><td>Rabbit anti-6X His tag antibody</td><td>Abcam</td><td>ab9108</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr></tbody></table>

ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology

Ein Westlicher Blot (auch als Immunoblot bekannt) ist eine kanonische Methode für die biomedizinische Forschung. Es wird häufig verwendet, um die relative Größe und Fülle von spezifischen Proteinen sowie post-translationale Proteinmodifikationen zu bestimmen. Diese Technik hat eine reiche Geschichte und bleibt in weit verbreiteter Verwendung aufgrund seiner Einfachheit. Das westliche Blotting-Verfahren dauert jedoch bekanntlich Stunden, sogar Tage, mit einem kritischen Engpass, die langen Inkubationszeiten sind, die seinen Durchsatz begrenzen. Diese Inkubationsschritte sind aufgrund der langsamen Diffusion von Antikörpern aus der Bulk-Lösung zu den immobilisierten Antigenen auf der Membran erforderlich: Die Antikörperkonzentration in der Nähe der Membran ist viel niedriger als die Massenkonzentration. Hier präsentieren wir eine Innovation, die diese Inkubationsintervalle drastisch reduziert, indem die Antigenbindung durch zyklisches Ablassen und Auffüllen (CDR) der Antikörperlösung verbessert wird. Wir haben auch eine Immunreaktions-Verbesserungstechnologie verwendet, um die Empfindlichkeit des Assays zu erhalten. Eine Kombination der CDR-Methode mit einem kommerziellen Immunreaktionsmittel steigerte das Ausgangssignal und reduzierte die Inkubationszeit des Antikörpers erheblich. Der resultierende Ultra-High-Speed-Western-Blot kann in 20 Minuten ohne Verlust der Empfindlichkeit erreicht werden. Diese Methode kann auf westliche Flecken angewendet werden, indem sowohl chemilumineszierender als auch fluoreszierender Nachweis verwendet wird. Dieses einfache Protokoll ermöglicht es Forschern, die Analyse der Proteinexpression in vielen Proben besser zu untersuchen.

Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirksamkeit der CDR-Methode zusammen mit der immunverstärkenden Technologie auf Western Blot. Die statische Inkubation erfolgte auf einem halbtransparenten flexiblen Film, bei dem PVDF-Membranen mit der Antikörperlösung inkubiert wurden, während die CDR-Inkubation in einem Hybridisierungsofen durch rotierende Rohre erfolgte, die die Membranen und die Antikörperlösung enthielten (Movie). Abbildung 2 zeigte Mengen an Antigen und Antikörpern, die für ...

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Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Eine Ultra-High-Speed-Western-Blotting-Technik wird entwickelt, indem die Kinetik der Antigen-Antikörper-Bindung durch zyklische Entwässerungs- und Auffüllungstechnologie (CDR) in Verbindung mit einem Immunreaktions-Verbesserungsmittel verbessert wird.

Ultra-High-Speed Western Blot mit Immunoreaction Enhancing Technology

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

ultra-high-speed-western-blot-using-immunoreaction-enhancing

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

5.8K Aufrufe.  National Institutes of Health. Eine Ultra-High-Speed-Western-Blotting-Technik wird entwickelt, indem die Kinetik der Antigen-Antikörper-Bindung durch zyklische Entwässerungs- und Auffüllungstechnologie (CDR) in Verbindung mit einem Immunreaktions-Verbesserungsmittel verbessert wird.

Serie: Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. Radioactivity has been the predominant method of DNA labeling in EMSAs. However, recent advances in fluorescent dyes and scanning methods have prompted the use of fluorescent tagging of DNA as an alternative to radioactivity for the advantages of easy handling, saving time, reducing cost, and improving safety. We have recently used fluorescent EMSA (fEMSA) to successfully address an important biological question. Our fEMSA analysis provides mechanistic insight into the effect of a missense mutation, G73E, in the highly conserved HMG transcription factor SOX-2 on olfactory neuron type diversification. We found that mutant SOX-2G73E protein alters specific DNA binding activity, thereby causing olfactory neuron identity transformation. Here, we present an optimized and cost-effective step-by-step protocol for fEMSA using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides containing the LIM-4/SOX-2 adjacent target sites and purified SOX-2 proteins (WT and mutant SOX-2G73E proteins) as a biological example.

We describe here an optimized protocol of fluorescent Electrophoretic Mobility Shift Assays (fEMSA) using purified SOX-2 proteins together with infrared fluorescent dye-labeled DNA probes as a case study to tackle an important biological question.

Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Forschung

Biochemie

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

Western Blot mit dem Invitrogen NuPage Novex Bis Tris Minigele

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Biologie

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides an alternative strategy, capillary isoelectric focusing (cIEF), with many advantages compared to conventional immunoblotting. This is an antibody-based, automated, rapid, and quantitative method in which a complete western blotting procedure takes place inside an ultrathin capillary. This technique does not require a gel to transfer to a membrane, stripping of blots, or x-ray films, which are typically required for conventional immunoblotting. Here, proteins are separated according to their charge (isoelectric point; pI), using less than a microliter (400 nL) of total protein lysate. After electrophoresis, proteins are immobilized onto the capillary walls by ultraviolet light treatment, followed by primary and secondary (horseradish peroxidase (HRP) conjugated) antibody incubation, whose binding is detected through enhanced chemiluminescence (ECL), generating a light signal that can be captured and recorded by a charge-coupled device (CCD) camera. The digital image can be analyzed and quantified (peak area) using software. This high throughput procedure can handle 96 samples at a time; is highly sensitive, with protein detection in the picogram range; and produces highly reproducible results because of automation. All of these aspects are extremely valuable when the quantity of samples (e.g., tissue samples and biopsies) is a limiting factor. The technique has wider applications as well, including screening of drugs or antibodies, biomarker discovery, and diagnostic purposes.

Capillary isoelectric focusing is an antibody-based, ultrasensitive, high throughput technique, enabling detailed characterization of proteins and their isoforms from extremely small biological samples. The following describes a protocol for detection and quantification of specific proteins and their isoforms in an automated and robotized manner.

Hochsensible und quantitativen Nachweis von Proteinen und deren Isoformen durch Kapillare isoelektrischen Fokussierung Methode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Immunoblot Analysis

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. It involves the solubilization and electrophoretic separation of proteins, glycoproteins, or lipopolysaccharides by gel electrophoresis, followed by quantitative transfer and irreversible binding to nitrocellulose, PVDF, or nylon. The immunoblotting technique has been useful in identifying specific antigens recognized by polyclonal or monoclonal antibodies and is highly sensitive (1 ng of antigen can be detected). This unit provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. This video provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblot-Analyse

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blot: Probenvorbereitung zur Detektion

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

Der schnellste westlichen Stadt: Eine moderne Variante der Classic Western-Blot-Analyse

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

A Guide to Modern Quantitative Fluoreszenz Western Blot mit Strategien zur Fehlersuche

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Immunoprecipitation-Based Techniques: Purification of Endogenous Proteins Using Agarose Beads

Source: Susannah C. Shissler1, Tonya J. Webb1 
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland, Baltimore, MD 21201
Immunoprecipitation (IP, also known as a &#39;pull-down&#39; assay) is a widely used technique that has applications in a variety of fields. First conceived in 1984, it was refined in 1988 (1, 2). The fundamental goal of IP is purification and isolation of a specific protein using an antibody against that protein. The word &#34;immuno&#34; refers to the use of an antibody while the word &#34;precipitation&#34; refers to pulling down a specific substance from a solution. The target protein might be endogenous or recombinant. Most recombinant proteins have an epitope tag (i.e. myc or flag) attached to them to simplify subsequent purification. Typically, it is easier to optimize recombinant protein IP because the antibodies against recombinant epitope tags are very strong and effective. Antibodies against endogenous proteins have extremely variable efficacy - making it much more difficult to optimize these IPs. A necessary step after immunoprecipitation is verification of purification. The isolated protein is resolved using SDS-PAGE and subsequently probed for purity by western blots (Figure 1). An important control is the use of a different antibody during the Western blot to verify pull down of the correct protein. The combination of IP with subsequent techniques is a powerful analysis tool. The goal after purification may be characterization of the protein itself by NMR, mass spectrometry, and in vitro assays, or analysis of the protein&#39;s interacting partners (i.e. protein, DNA, RNA) (3, 4, 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10502/10502fig1.jpg" /> 
Figure 1: Overview of Immunoprecipitation Procedure. Immunoprecipitation is the isolation of a specific protein using an antibody. After production of lysate from cells, there are two major steps- pre-clearing and pull down. During pre-clearing step, the cell-lysates are pre-cleared of proteins that bind to antibodies non-specifically using an isotype control antibody. In pull down step, the target protein is pulled down using a protein-specific antibody. The isolated protein is then analyzed by Western blot. Isotype antibodies and protein specific antibodies have the same constant domain, but different antigen binding domains. A key component of this protocol is Protein A/G agarose beads that bind the constant domain of antibodies- allowing immunoprecipitation of the target protein. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/10502/10502fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Antibodies are the key component of an immunoprecipitation that differentiate it from other forms of protein purification (i.e. nickel affinity column purification). Antibodies are molecules made by B cells that can recognize specific protein epitopes. Antibodies have two domains: constant (Fc) and antigen binding (Fab) (Figure 1). The constant domain identifies the type of antibody and dictates function in vivo. Usually, the constant domains of antibodies used for IP are mouse, rat, or rabbit IgG. The antigen binding portion of the antibody recognizes a specific epitope of a specific protein. Antibodies can recognize epitopes on folded proteins that may not exist when the protein is denatured and vice versa. Therefore, the availability of the epitope depends on protein folding - identifying an important factor to consider when choosing antibodies and conditions for IP.
Both prokaryotic and eukaryotic systems have antibody-binding proteins. In eukaryotic systems, the purpose is immune protection from bacteria while in prokaryotic systems, the purpose is protection from the immune system. Antibody-binding proteins affect IP methodology in two ways. First, there is a necessary pre-clearing step (Figure 1) to rid the lysate of proteins that bind antibodies - thereby reducing non-specific binding in the final product. This step uses an isotype antibody that has the same constant domain as but a different antibody binding domain than your protein-specific antibody. Bacterial antibody-binding proteins are the second key component of this method. After the protein-specific antibody binds the target protein, the antibody: protein complex must be pulled down (Figure 1). Proteins A, G, and L are bacterial proteins that bind the constant domain of antibodies. While bacteria use this to subvert the immune system, researchers have co-opted this system for easy antibody purification, and it is used during both the pre-clearing and pull-down steps. These proteins have different binding affinities for different species and different constant domain subtypes - another factor to consider when choosing conditions for IP. Many companies sell Protein A/G labeled agarose beads (Figure 1), pre-made spin columns, or resins to make columns. In general, beads and spin columns are used for smaller sample sizes while resins are used for bulk purification.
In this lab exercise, we demonstrate how to purify the endogenous protein c-myc, from primary murine thymocytes, using Protein A/G Plus agarose beads based basic immunoprecipitation technique. The protocol starts from cell lysate preparation and ends with the with verification of successful protein pull down using Western blot analysis.

Immunoprecipitation Techniques: Purification of Proteins

Immunprecipitation-basierte Techniken: Reinigung endogener Proteine mit Agarose-Perlen

Source: Susannah C. Shissler1, Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland, Baltimore, MD 21201
Immunoprecipitation ...

Lehre

JoVE Science Education

Fortgeschrittene Biologie

Grundlagen der Immunologie

The Western Blot

Western Blotting is used to identify the presence of specific proteins in electrophoretically separated samples. Following separation by a technique known as sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE, western transfer is used to move proteins from a polyacrylamide gel onto a piece of membrane which traps the proteins in their respective locations. Next, the membranes are probed with antibodies in a process called immunboblotting. Immunoblotting uses antibody-protein and antibody-antibody binding through specific recognition sites, providing the high specificity required for identifying a single protein. The detection of antibodies takes place using reporter systems which includes the use of enzymes. Enzymes can be attached to the end of an antibody and react with substrates to produce changes in color or light. These signals can then be imaged and quantified using a process called densitometry.
This video-article presents an overview of the western blot technique by describing western transfer, the use of antibody detection, and image analysis. The steps involved with western transfer such as the assembly of the transfer sandwich and transfer conditions are discussed in detail as well as the theory behind antibody binding and detection of those antibodies. The broad applications of this technique are described through several examples including the detection of protein-protein interactions and identification of individual proteins within protein complexes.

Western Blotting: Western Transfer, Antibody Detection, and Image Analysis

Der Western Blot

Western Blotting is used to identify the presence of specific proteins in electrophoretically separated samples.  Following separation by a technique ...

Grundlegende Biologie

Grundlegende Methoden in der Zell und Molekularbiologie

Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/62842">Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video describes the chemiluminescence-based western blotting of immunoprecipitated lysates. The technique helps determine protein processing and activation. The chemiluminescent signal detected is proportional to the level of protein processing during its activation.

Chemilumineszenz-Western-Blot-Assay für die Proteinverarbeitung

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex. J. ...