Name: an optimized protocol for electrophoretic mobility shift assay using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides
Uploaded: 2016-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
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This work was supported by an Alfred P. Sloan Research Fellowship (to C.-F.C.) and an NIH R01 grant (5R01GM098026-05 to C.-F.C.). We thank David Crowe for access to the advanced infrared imaging system.

HINWEIS: EMSAs fluoreszenzmarkierten DNA - Sonden oder andere Formen von markierten DNA die gleichen Protokolle für Protein oder Zellextraktzubereitung, Protein-DNA - Bindungsreaktion und PAGE Gelzubereitung und Ausführen (1A) verwendet wird . Die wichtigsten Unterschiede sind DNA-Markierungsverfahren, post-run Gel Verarbeitungsschritte und Nachweismethoden. 1. Gel Zubereitung <ol><li> Bereiten 5% nativen Polyacrylamidgel, enthaltend 0,5 × TBE (45 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA) und 2,5% Glycerin, ein Mini-Protein-Gel-System (8,3 cm Breite x 7,3 cm Länge x 0,75 mm Dicke). <ol><li> Zur Herstellung von 30 ml Gel-Lösung für 4 Gele, mischen 5 ml 30% Acrylamid / Bis (37,5: 1), 3 ml 5-fach TBE (0,45 M Tris-Borat, 10 mM EDTA), 1,5 ml 50% Glycerol, 300 &amp; mgr; l von 10% Ammoniumpersulfat, 15 &amp; mgr; l TEMED und 20,2 ml ddH 2 O gründlich. HINWEIS: Acrylamid schädlich und giftig ist, Griff mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung. </li&gt; </ol></li><li> Cast der Gel-Lösung sofort. Nach der Polymerisation wickeln die Gele in klaren Plastikfolie mit 0,5x TBE vorbenetzt und lagern Sie sie bei 4 ° C. </li></ol> 2. Herstellung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Sonden HINWEIS: Halten Sie die Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Oligonukleotiden weg von Licht so viel wie möglich während der Herstellung, Lagerung und Experimente. <ol><li> Gestalten und bestellen Oligonukleotide. <ol><li> Entwerfen Sie lange Oligonukleotid für ~ 51-mere. HINWEIS: Die lange Oligonukleotid - Sequenz des LIM-4 / SOX-2 - Sonde ist TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. Lange Oligonukleotide erfordern keine PAGE oder HPLC-Reinigung. </li><li> Entwerfen komplementäre kurze Oligonukleotide für ~ 14-mers mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-Modifikation am 5&#39;-Terminus (5&#39;Dye) und eine Schmelztemperatur über 37 ° C. HINWEIS: Die kurze Oligonukleotid-Sequenz des LIM-4 / SOX2 Sonde ist 5&#39;Dye-GGGAGAAGATTTTG. Die Mindestsynthesemaßstab von 5&#39;Dye-markierte kurze Oligonukleotide ist 100 nM. Daher erfordern die Oligonucleotide HPLC-Reinigung. </li></ol></li><li> Resuspendieren Oligonukleotiden in 1x Tris-EDTA-Puffer (TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) auf eine Endkonzentration von 100 uM. </li><li> Anneal Short (5&#39;Dye) und lange Oligonukleotide. <ol><li> Mischungs 0,6 ul 5&#39;Dye-Short Oligo (100 uM), 1,2 ul Oligo Lange (100 uM), und 28,2 &amp; mgr; l Natriumchlorid-Tris-EDTA-Puffer (STE: 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) in einem 1,5 ml-Röhrchen. </li><li> Das Röhrchen wird Wasser für 5 min in kochendem. Schalten Sie die Wärmequelle aus und lassen Sie das Wasser mit dem geglüht Oligos O / N kühlen im Dunkeln. </li></ol></li><li> Füllen Sie das 5&#39;-Überhang von vergütetem 5&#39;Dye-kurz / lang Oligos mit Klenow-DNA-Polymerase doppelsträngigen DNA-Sonden zu machen. <ol><li> Bereiten Sie die Reaktion durch Vermischen30 ul geglüht kurz / lang Oligos mit 5&#39;Dye Tag, 8,5 ul 10x Klenow-Puffer, 1,7 ul 10 mM dNTPs, 1,7 ul Klenow (3 &#39;-&gt; 5&#39; exo) (5 u / ul) und von 43,1 &amp; mgr; l ddH 2 O in einem 0,2 ml PCR - Röhrchen. </li><li> Inkubieren 60 min bei 37 ° C in einer PCR-Maschine. </li><li> Hinzufügen, 3,4 &amp; mgr; l 0,5 M EDTA die Reaktion und Wärme inactivate für 20 min in einer PCR-Maschine bei 75 ° C zu beenden. </li></ol></li><li> Verdünnte eingefüllte in Sonden (0,7 uM) in STE für Endkonzentration von 0,1 uM. </li><li> Shop Oligos bei -20 ° C im Dunkeln bis zur Verwendung. Oligos kann für bis zu einem Jahr in diesem Zustand gelagert werden. HINWEIS: Um die DNA-Sonden mit mutierten Bindungsstellen, mutierten Versionen von langen Oligonukleotiden geglüht mit 5&#39;Dye-markierte kurze Oligonukleotide, gefolgt von Fill-in von 5&#39;-Überhänge mit Klenow erzeugen. Es hat sich gezeigt, daß die Sonde mit einem Strang mit einem Infrarot fluoreszierenden markierten gezeigtFarbstoff nur 30% Intensität der Sonde mit den beiden mit dem Farbstoff markierten Stränge. Wenn die Signalintensität verstärkt werden muss, sind lange Oligos beider Stränge mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoffen an 5&#39;-Enden markiert und geglüht Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Sonden machen. </li></ol> 3. Herstellung von unbeschriftet / kalt Probes (Wettbewerber) Hinweis: Lange Oligonukleotide komplementäre Sequenzen (Long und LongR) mit unmarkierten Sonden zur Wettbewerbsanalyse zu machen geglüht wurden Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Sonden. <ol><li> Mix 20 ul 100 uM lang, 20 ul 100 uM LongR Oligonukleotiden und 60 &amp; mgr; l STE in einem 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Das Röhrchen wird Wasser für 5 min in kochendem, schalten Sie die Wärmequelle aus und lassen Sie das Wasser mit dem geglüht Oligos über Nacht abkühlen. </li></ol> 4. Bindungsreaktion und Elektrophorese <ol><li> Vorbereitung 1 ml 5x Bindungspuffer um 50 &amp; mgr; l Misch60; 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 10 ul 5 M NaCl; 200 ul 1 M KCl, 5 ul 1 M MgCl 2, 10 ul 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 ul 1 M DTT; 25 ul 10 mg / ml BSA und 695 &amp; mgr; l ddH 2 O. HINWEIS: Der 5x Bindungspuffer kann bei -20 ° C aliquotiert und gelagert werden. Ein weiterer Punkt zu beachten ist, dass verschiedene Transkriptionsfaktoren verschiedene Modifikationen an den Bindungspuffer haben. </li><li> Kurz vor dem Bindungsreaktionen einrichten, Vorlauf 5% nativen Polyacrylamidgel in 0,5x TBE + 2,5% Glycerin alle Spuren von Ammoniumpersulfat bei 80 V für 30 zu entfernen - 60 min, oder bis der Strom nicht ändert länger mit der Zeit. </li><li> Legen Sie die Bindungsreaktion in Endvolumen von 20 &amp; mgr; l auf. <ol><li> Mischungs 4 ul 5x Bindungspuffer, 80 bis 200 ng gereinigtem Protein A (in 50% Glycerin, dh SOX-2), 1 ul 0,1 uM Farbstoff-konjugierten Sonde (Endkonzentrationentration: 5 nM) und ddH 2 O. </li><li> Optional: Wenn kalte Sonde Konkurrenten erforderlich sind, fügen verschiedene Konzentrationen (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) von kalten Sonden. </li><li> Optional: Wenn die Wechselwirkung zwischen den Proteinen A und B (dh SOX-2 und LIM-4) geprüft wird, hinzufügen von 80 bis 200 ng gereinigtem Protein B (in 50% Glycerin, dh LIM-4). </li><li> Optional: Wenn Kernextraktzubereitung verwendet wird , und spezifische Bindung von Protein A ist , validiert werden, Antikörper , der spezifisch an Protein A addieren (dh anti-6xHis, anti-FLAG, etc.). </li><li> Inkubieren bei R / T in Dunkelheit für 15 min. </li></ol></li><li> Legen Sie alle der Bindungsreaktion auf das Gel, und führen Sie das Gel bei 10 V / cm auf den gewünschten Abstand. </li></ol> 5. Imaging HINWEIS: Das Gel wurde direkt in den Glasplatten mit einer erweiterten Infrarot-Abbildungssystem abgetastet. Daher kann das Gel weiter aufgelöst werden und wiederholt (1C gescannt und <strong&gt; 2). Eine Nahinfrarot-Fluoreszenzabbildungssystem in erster Linie für Western-Blots wurde auch getestet, das Gel zu scannen, sondern nur die erweiterten Infrarot-Abbildungssystem konnte das Gel mit guter Auflösung zu scannen. Die beschriebene Methodik ist spezifisch für ein bestimmtes Infrarot-Abbildungssoftware, obwohl andere Software-Pakete verwendet werden können. <ol><li> Reinigen Sie das Bett des Scanners mit ddH 2 O und gut trocknen vor dem Scannen. Wischen Sie die Glasplatten des Gels trocknen und legen Sie die Platten, die das Gel auf dem Scannerbett. </li><li> Öffnen Sie die Infrarot-Imaging-Software und gehen Sie auf die &quot;Acquire&quot; Tab. Wenn die dünnere Platte (1 mm) auf dem Scanner-Bett gelegt wird, verwenden Sie die Einstellungen von Kanal: 700, Intensität: Auto, Auflösung: 169 &amp; mgr; m, Qualität: mittel, und Focus-Offset: 1,5 mm. Wenn die dickere Platte (3 mm) auf dem Scanner-Bett gelegt wird, verwenden Sie die Einstellungen von Kanal: 700, Intensität: Auto, Auflösung: 84 &amp; mgr; m, Qualität: mittel, und Focus-Offset: 3,5 mm. Fokus-Offset ist abhängig von derDicke der Glasplatte. </li><li> Wählen Sie den Bereich, der das Gel auf dem Scanner einnimmt. Klicken Sie auf &#39;Start&#39;, um den Scanvorgang zu starten. </li><li> Wiederholen Sie die Elektrophorese und scannen zusätzlich nach Bedarf. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

fEMSAs sind ein leistungsfähiges Werkzeug Protein-DNA-Wechselwirkungen, und sind eine Alternative zur radioaktiven Markierung von DNA zu untersuchen. Fluoreszenzfarbstoffe, wie beispielsweise Infrarot-Farbstoffe sind im Handel erhältlich und bieten einen sicheren und umweltfreundlichen Verfahren im Vergleich zur radioaktiven DNA-Markierung. EMSA unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Oligonukleotiden erfordern keine Nachlauf Gel Verarbeitungsschritte und somit Zeit und Kosten im Vergleich zu an...

EMSAs verwendet , durch Verwendung nativer Polyacrylamid - Gelelektrophorese (PAGE) Wechselwirkungen zwischen DNA und Proteinen zu analysieren , um eine Mischung aus einem Protein von Interesse und eine markierte DNA - Sonde enthält , potentielle Zielstellen des Proteins 1 zu lösen. Eine DNA-Sonde mit Protein gebunden langsamer wandert mit einer freien DNA-Sonde verglichen wird, und daher verzögert in seine Wanderung durch eine Polyacrylamid-Matrix. Die radioaktive Markierung von DNA durch 32 P hat die vorherrschende Methode zur Detektion in EMSA gewesen. Obwohl die Anwendung von radioaktiven Markierung in der biochemischen Forschung vorteilhaft war, sind Methoden der alternativen DNA-Markierung mit vergleichbarer Empfindlichkeit wird aufgrund der Risiken Gesundheit und Sicherheit beschäftigt im Umgang mit Radioaktivität in Verbindung gebracht. Diese alternativen Verfahren umfassen die Konjugation von DNA mit Biotin 2 oder Digoxigenin (DIG) 3 (beide werden dann durch Chemilumineszenzsystemen erkannt), SYBR Grün - Färbung der PAGE - Gels 4,oder direkte Detektion von DNA-Fluoreszenzfarbstoff - Konjugate durch das Gel 5,6 scannen. Die aufgelösten Gele von EMSA unter Verwendung von radioaktiv markierten DNA - Sonden erfordern Nachlauf Verarbeitung durch Autoradiographie Filme oder ein Phosporimager System radioaktiven Signale 1,7 erfassen. Gele EMSAs Biotin- 2 oder DIG-konjugierten 3 DNA - Sonden müssen ebenfalls verarbeitet und auf eine geeignete Membran übertragen und dann durch Chemilumineszenz 6 detektiert. SYBR grüne Färbung des Gels erfordert Nachlauf Gel - Färbung und einen fluoreszierenden Scanner 4. Da Nachlauf Gel Verarbeitungsschritte zur EMSAs unter Verwendung dieser DNA-Markierungstechniken benötigt werden, kann die aufgelöste Gel nur einmal getestet werden. Im Gegensatz dazu markierten DNA-Sonden mit Fluorophoren direkt in dem Gel in den Glasplatten durch einen Scanner detektiert werden kann. Daher können die DNA-Protein-Wechselwirkungen mehrmals zu verschiedenen Zeitpunkten während des Laufs überwacht und analysiert werden, diedeutlich reduziert Zeit und Kosten. Die DNA-Fluoreszenzfarbstoff - Konjugate , die für EMSAs verwendet wurden , umfassen Cy3 6,8, 6,8 Cy5, Fluorescein 9 und Infrarot - Fluoreszenzfarbstoffe 4-6. Transkriptionelle Regulation erfordert Protein-DNA-Wechselwirkungen von Transkriptionsfaktoren und ihre Zielgene. Die Koordination dieser Interaktionen erzeugt diverse Zelltypen aus einem gemeinsamen Vorläufer bei Tierentwicklung. Eine unvoreingenommene vorwärts genetisches Screening identifizierten eine Missense - Mutation, G73E, in der hochkonservierten HMG DNA-Bindungsdomäne des SOX-2 Caenorhabditis elegans Transkriptionsfaktor. Die Mutation führt zu einer Zellidentität Transformation von AWB olfaktorischen Neuronen in AWC Riechzellen auf molekularer, morphologischen und funktionellen Ebenen 5,10. SOX-2 regelt differentiell die terminale Differenzierung von AWB und AWC Neuronen mit kontextabhängigen Partner Transkriptionsfaktoren interagieren und die jeweiligenDNA - Zielstellen 5,10. SOX-2 Partner mit LIM-4 (LHX) in Terminal AWB neuronale Differenzierung, während SOX-2 Partner mit CEH-36 (OTX / OTD) in Terminal AWC neuronale Differenzierung. Luziferase - Reporter - Assays zeigen , dass SOX-2 und mutierten SOX-2 G73E Proteine haben kooperative Wechselwirkungen mit Transkriptions Cofaktoren LIM-4 und CEH-36 einen Promotor in AWB und AWC Neuronen zu aktivieren. Allerdings SOX-2 und mutierten SOX-2 G73E angezeigt Differentialaktivierungseigenschaften des Promotors. Um die molekulare Basis der differentiellen DNA - Bindungsaktivitäten von SOX-2 und SOX-2 G73E untersuchen, fEMSAs wurden mit diesen Proteinen und deren potentielle Zielstellen durchgeführt. Zunächst wurde ein Ansatz Bioinformatics die biologisch relevante DNA-Bindungssequenzen innerhalb des 1 kb-Promotorregion in der Luciferase-Assay verwendet, zu identifizieren. Da mehrere potenzielle SOX-2 Bindungsstellen im gesamten Promotor anwesend waren, konzentrierten wir unsauf den vorhergesagten SOX-2-Bindungsstellen neben mutmaßlichen CEH-36 oder LIM-4-Bindungsstellen und evolutionär zwischen verschiedenen Nematodenarten konserviert. Diese Sequenzen wurden deletiert oder mutiert und anschließend in vivo auf ihre Aktivität getestet , um GFP reporter Transgenen in AWB oder AWC Neuronen exprimieren. Durch diesen Ansatz identifizierten wir Potential LIM-4 / SOX-2 und CEH-36 / SOX-2 benachbarte Zielstellen , die speziell die für die Expression von GFP in AWB und AWC Neuronen sind jeweils 5. Wir untersuchten die möglichen Unterschiede in der DNA - Bindung von SOX-2 und SOX-2 G73E mit FEMSA mit den identifizierten LIM-4 / SOX-2 und CEH-36 / SOX-2 benachbarte Zielstellen. Unsere EMSA - Analyse zeigte , dass SOX-2 G73E nicht die DNA - Sonde hat binden die LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen (erforderlich für die Genexpression in AWB) so effizient wie WT SOX-2 tat enthält. Allerdings SOX-2 und SOX-2 G73E hatte keinen Unterschied in der Bindung der DNA - Sonde die CEH-36 / SOX-2 a enthält ,djacent Zielstelle (erforderlich für die Genexpression in AWC) 5,10. Unsere FEMSA Analysen für die AWB-to-AWC Zellidentität Phänotyp Transformation in beeinflussen spezifische DNA - Bindungsaktivität mechanistischen Einblick in die Natur des SOX-2 G73E - Mutation bereitstellen. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll von FEMSA unter Verwendung von gereinigtem 6xHis-SOX-2 oder 6 × His-SOX-2 G73E zusammen mit Infrarot - Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA - Sonden mit den LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen als Fallstudie in Angriff zu nehmen eine wichtige biologische Frage.

<table><tbody><tr><td>30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>Acrylamide is harmful and toxic.</td></tr><tr><td>6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)</td><td>ThermoFisher</td><td>MA1-21315</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag M2 antibody&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>5&#039;IRDye700-labeled DNA Oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom DNA oligo</td><td>These are referred to as &quot;5&#039;Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos&quot; in the manuscript. The company will custom synthesize 5&#039; IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100&amp;nbsp;&amp;mu;M scale synthesis and HPLC purification.</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3&#039;--&gt;5&#039; exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LightShif Poly (dI-dC)</td><td>ThermoFisher</td><td>20148E</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&amp;nbsp;Vertical Electrophoresis Cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC&amp;nbsp;</td><td>This is referred to as a &#039;mini protein gel system&#039; in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size.</td></tr><tr><td>Odyssey CLx Infrared Imaging System</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Odyssey CLx Infrared Imagng System</td><td>This is referred to as an &#039;advanced infrared imaging system&#039; in the manuscript.</td></tr><tr><td>Odyssey Fc Imaging System&amp;nbsp;</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System</td><td>This is referred as a &#039;near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots&#039; in the manuscript.</td></tr><tr><td>Image Studio software (version 4.0)</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Image Studio software&amp;nbsp;</td><td>This is referred to as a &#039;particular imaging software&#039; in the manuscript.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3756-25G</td><td></td></tr><tr><td>6x Orange loading dye</td><td></td><td></td><td>0.25% Orange G; 30% Glycerol</td></tr><tr><td>0.5x TBE</td><td></td><td></td><td>45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x TE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x STE</td><td></td><td></td><td>100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>5x Binding Buffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 &amp;#956;g/mL BSA</td></tr></tbody></table>

an optimized protocol for electrophoretic mobility shift assay using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides

Elektrophoretische Mobilität Shift-Assays (EMSA) sind eine instrumentale Werkzeug, um die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und deren Ziel-DNA-Sequenzen zu charakterisieren. Die Radioaktivität ist die vorherrschende Methode der DNA-Markierung in EMSA gewesen. Allerdings haben jüngste Fortschritte in der Fluoreszenzfarbstoffe und Scanverfahren die Verwendung von Fluoreszenzmarkierung von DNA als Alternative zu den Radioaktivität für den Vorteilen der leichten Handhabung Aufforderung, Zeitersparnis und reduziert die Kosten und die Verbesserung der Sicherheit. Wir haben vor kurzem fluoreszierende EMSA (FEMSA) erfolgreich adressieren eine wichtige biologische Frage verwendet. Unsere Analyse liefert FEMSA mechanistischen Einblick in die Wirkung einer Missense-Mutation, G73E, in der hochkonservierten HMG Transkriptionsfaktor SOX-2 auf olfaktorische Neuronen Typ Streuung. Wir fanden , dass mutierte SOX-2 G73E Protein spezifische DNA - Bindungsaktivität verändert, wodurch olfaktorischen Neuronen Identität Transformation verursacht. Hier stellen wir ein optimiertes und kostengünstiges Schritt-für-Schritt-Protokollfür FEMSA mit Infrarot - Fluoreszenz - Farbstoff-markierten Oligonukleotiden , die LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen und gereinigt SOX-2 - Proteine (WT und Mutanten - SOX-2 G73E Proteine) als biologisches Beispiel enthält.

Orange G loading dye (6x: 0.12 g Orange G in 100 ml 30% Glycerol) können vor dem Laden in die Bindungsreaktion zugesetzt werden, um das Fortschreiten der Elektrophorese sichtbar zu machen. Weitere Lade- Farbstoffe Bromphenolblau einschließlich wird während des Scannens und daher interferieren Bildanalyse (1B) detektiert werden. In einigen Fällen von EMSAs, insbesondere wenn die Kernextraktzubereitung verwe...

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An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll von fluoreszierenden elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (FEMSA) gereinigtes SOX-2-Proteine ​​zusammen mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Sonden als Fallstudie eine wichtige biologische Frage zu bekämpfen.

Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

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Biochemistry

15.5K Aufrufe.  University of Illinois at Chicago.  Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll von fluoreszierenden elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (FEMSA) gereinigtes SOX-2-Proteine ​​zusammen mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Sonden als Fallstudie eine wichtige biologische Frage zu bekämpfen. 

Serie: An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of RNA-protein interactions. These interactions have been traditionally analyzed with polyacrylamide gels generated between two glass plates and samples electrophoresed vertically. However, polyacrylamide gels cast in trays and electrophoresed horizontally offers several advantages. For example, horizontal gels used to analyze complexes between fluorescent RNA substrates and specific proteins can be imaged multiple times as electrophoresis progresses. This provides the unique opportunity to monitor RNA-protein complexes at several points during the experiment. In addition, horizontal gel electrophoresis makes it possible to analyze many samples in parallel. This can greatly facilitate time course experiments as well as analyzing multiple reactions simultaneously to compare different components and conditions. Here we provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis for analyzing RNA-Protein interactions.

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool for analyzing RNA-protein interactions. Traditionally most experiments have used vertical gels. However, horizontal gels provide several advantages, such as the opportunity to monitor complexes during electrophoresis. We provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis.

Horizontale Gel-Elektrophorese zur verbesserten Nachweis von Protein-RNA-Komplexen

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Forschung

Biochemie

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

DNA-Elektrophorese mit Thiazole Orange statt Interkalation Bromid oder Alternative Farbstoffe

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Assays für DNA-Enzyme mit synthetischen Oligonukleotiden

Using Modified Synthetic Oligonucleotides to Assay Nucleic Acid-Metabolizing Enzymes

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to characterize diverse properties of nucleic acid metabolizing enzymes that can be run in any standard molecular biology lab. The use of fluorescent labels has made these methods accessible to researchers with standard PAGE electrophoresis equipment and a fluorescent-enabled imager, without using radioactive materials or requiring a lab designed for the storage and preparation of radioactive materials, i.e., a Hot Lab. The optional addition of standard modifications such as phosphorylation can simplify assay setup, while the specific incorporation of modified nucleotides that mimic DNA damages or intermediates can be used to probe specific aspects of enzyme behavior. Here, the design and execution of assays to interrogate several aspects of DNA processing by enzymes using commercially available synthetic oligonucleotides are demonstrated. These include the ability of ligases to join or nucleases to degrade different DNA and RNA hybrid structures, differential cofactor usage by the DNA ligase, and evaluation of the DNA-binding capacity of enzymes. Factors to consider when designing synthetic nucleotide substrates are discussed, and a basic set of oligonucleotides that can be used for a range of nucleic acid ligase, polymerase, and nuclease enzyme assays are provided.

Autor im Rampenlicht: Charakterisierung neuartiger Enzyme aus Extremophilen und häufigen Krankheitserregern zum Verständnis der DNA-Reparatur und -Replikation

Here, a protocol for assaying nucleic acid metabolizing enzymes is presented, using examples of ligase, nuclease, and polymerase enzymes. The assay utilizes fluorescently labeled and unlabeled oligonucleotides that can be combined to form duplexes mimicking RNA and/or DNA damages or pathway intermediates, allowing for the characterization of enzyme behavior.

Verwendung modifizierter synthetischer Oligonukleotide zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Umfassendes Protokoll zur Zellidentifikation und Stoffwechselanalyse mit OPTIR-FISH

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we present a comprehensive protocol for simultaneous cell identification and metabolic analysis with the OPTIR-FISH platform by combining rRNA-tagged FISH probes and isotope-labeled substrates. Fluorescence imaging provides cell identification by the specific binding of rRNA-tagged FISH probes, while OPTIR imaging provides metabolic activities within single cells by isotope-induced red shift on OPTIR spectra. Using bacteria cultured with 13C-glucose as a test bed, the protocol outlines microbial culture with isotopic labeling, fluorescence in situ hybridization (FISH), sample preparation, optimization of the OPTIR-FISH imaging setup, and data acquisition. We also demonstrate how to perform image analysis and interpret spectral data at the single-cell level with high throughput. This protocol&#39;s standardized and detailed nature will greatly facilitate its adoption by researchers from diverse backgrounds and disciplines within the broad single-cell metabolism research community.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Integriertes OPTIR-FISH für die Einzelzell-Stoffwechsel- und Identitätsanalyse in komplexen Umgebungen

Here, we present a protocol using optical photothermal infrared-fluorescence in situ hybridization (OPTIR-FISH), also known as mid-infrared photothermal-FISH (MIP-FISH), to identify individual cells and understand their metabolism. This methodology can be applied broadly for diverse applications, including mapping cellular metabolism with single-cell resolution.

Optische photothermale Infrarot-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

Biotechnik

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron regulatory proteins, IRP1 and IRP2. They bind to iron responsive elements (IREs) within the untranslated regions (UTRs) of several target mRNAs, thereby controlling the mRNAs translation or stability. IRE/IRP interactions have been widely studied by EMSA. Here, we describe the EMSA protocol for analyzing the IRE-binding activity of IRP1 and IRP2, which can be generalized to assess the activity of other RNA-binding proteins as well. A crude protein lysate containing an RNA-binding protein, or a purified preparation of this protein, is incubated with an excess of32 P-labeled RNA probe, allowing for complex formation. Heparin is added to preclude non-specific protein to probe binding. Subsequently, the mixture is analyzed by non-denaturing electrophoresis on a polyacrylamide gel. The free probe migrates fast, while the RNA/protein complex exhibits retarded mobility; hence, the procedure is also called &#8220;gel retardation&#8221; or &#8220;bandshift&#8221; assay. After completion of the electrophoresis, the gel is dried and RNA/protein complexes, as well as free probe, are detected by autoradiography. The overall goal of the protocol is to detect and quantify IRE/IRP and other RNA/protein interactions. Moreover, EMSA can also be used to determine specificity, binding affinity, and stoichiometry of the RNA/protein interaction under investigation.

Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Here we present a protocol to analyze RNA/protein interactions. The electrophoretic mobility shift assay (EMSA) is based on the differential migration of RNA/protein complexes and free RNA during native gel electrophoresis. By using a radiolabeled RNA probe, RNA/protein complexes can be visualized by autoradiography.

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) für das Studium von RNA-Protein-Wechselwirkungen: Die IRE / IRP Beispiel

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide

Zusammenfassung

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Horizontale Gel-Elektrophorese zur verbesserten Nachweis von Protein-RNA-Komplexen

DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht

DNA-Elektrophorese mit Thiazole Orange statt Interkalation Bromid oder Alternative Farbstoffe

Verwendung modifizierter synthetischer Oligonukleotide zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen

Verwendung modifizierter synthetischer Oligonukleotide zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen

Verwendung modifizierter synthetischer Oligonukleotide zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen

Optische photothermale Infrarot-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (OPTIR-FISH)

Optische photothermale Infrarot-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (OPTIR-FISH)

Optische photothermale Infrarot-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (OPTIR-FISH)

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) für das Studium von RNA-Protein-Wechselwirkungen: Die IRE / IRP Beispiel