Name: ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology
Uploaded: 2020-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل شعبة البحوث داخل الأمعاء، والمعهد الوطني للقلب والرئة والدم، والمعاهد الوطنية للصحة. وقد تم دعم S.H. من قبل اليابان الشراكة بين القطاعين العام والخاص طالب دراسة في الخارج، وH.N. وK.Y. كانت من قبل منحة التدريب ما وراء البحار والمخدرات V.

1. SDS-PAGE ونقلها إلى غشاء PVDF
<ol><li>قم بإجراء SDS-PAGE لفصل البروتينات بناءً على الحجم النسبي. ملاحظة: أي نظام هلام التجاري أو منزلي الصنع على ما يرام. الرجاء اتباع بروتوكول الشركة المصنعة.</li>
	<li>نقل البروتينات المنفصلة من هلام على غشاء PVDF. ملاحظة: طرق النقل الشائعة (شبه الجافة أو نقل الرطب) هي مناسبة. الرجاء اتباع بروتوكول الشركة المصنعة.</li>
</ol>2. حجب أغشية PVDF
<ol><li>احتضان الأغشية في مخازن منع مناسبة لمدة 1 ساعة مع التحريض في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: استناداً إلى الأجسام المضادة الأولية ونظام الكشف، يجب تحديد مخزن حظر مناسب. على سبيل المثال، فإن حاصرات الأكثر نموذجية هي BSA، والحليب الجاف غير الدهني، والكاسين، والبوليمرات الاصطناعية التجارية. برنامج تلفزيوني و / أو TBS مع 0.1٪ Tween20 هي المخازن الأكثر استخداما. قد يتم هذا الحظر خطوة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.</li>
</ol>3. حضانة مع الأجسام المضادة الأولية
<ol><li>إعداد 10٪ من العلاج المناعي تعزيز وكيل-1 حل (IRE-1) مع الماء المقطر. دوامة جيدا.</li>
	<li>إعداد الأجسام المضادة الأولية المخففة مع 10٪ IRE-1. امزجه بلطف ودقة.</li>
	<li>إذا كان استخدام غشاء أكبر (4 سم × 8 سم – 8 سم × 8 سم)، أضف 8 مل من محلول الأجسام المضادة إلى أنابيب أجهزة طرد مركزي مخروطية 50 مل. إذا كان استخدام غشاء أصغر (2 سم × 8 سم – 4 سم × 8 سم)، أضف 3 مل من محلول الأجسام المضادة إلى أنبوب البولي بروبلين دائري القاع 14 مل(جدول المواد).</li>
	<li>التقط غشاء PVDF مع ملاقط واستنزاف محلول الحجب لفترة وجيزة. أدخل غشاء PVDF في هذا الأنبوب بأصابع قفازة وتأكد من أن الغشاء بأكمله يتمسك بجدار الأنبوب. عندما يتم إدخال غشاء PVDF في أنبوب، وجه "الجانب البروتين" من الغشاء الذي كان في الأصل في اتصال مع هلام الداخل. أغلق الغطاء بإحكام.</li>
	<li>أدخل أنبوب 50 مل في زجاجة فرن التهجين. ملاحظة: عندما يتم استخدام 14 مل أنابيب لهذه الحضانة، أدخل أنبوب 14 مل في أنبوب 50 مل، وذلك باستخدام زوج من أصحاب حلقة بلاستيكية للحفاظ على أنبوب الداخلية في وسط أنبوب 50 مل.</li>
	<li>بدوره على فرن التهجين.</li>
	<li>احتضان الغشاء مع دوران 6 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق على الأقل. ملاحظة: تأكد من أن الغشاء يتمسك بالجدران في جميع الأوقات وأن الأنبوب (الداخلي) أفقي لتغطية الغشاء بمحلول الأجسام المضادة بالتساوي. معايرة تخفيف الأجسام المضادة ووقت الحضانة قبل التجربة الفعلية.</li>
</ol>4. غسل الأغشية
<ol><li>أوقفوا الدوران</li>
	<li>إزالة بعناية غشاء PVDF من الأنبوب مع ملاقط، ووضع الغشاء في وعاء مع 50 مل من برنامج تلفزيوني-T.</li>
	<li>شطف الغشاء لفترة وجيزة مع برنامج تلفزيوني-T.</li>
	<li>شطف الغشاء في الحاوية بالماء المقطر حتى لا تظهر فقاعات. هذا هو لإزالة غالبية الأجسام المضادة.</li>
	<li>نقل غشاء PVDF من الحاوية إلى سلطة الدوار التي تحتوي على 250 مل من برنامج تلفزيوني-T.</li>
	<li>ضع سلة المصفاة في الدوار. تأكد من أن الغطاء قد تم وضعه بشكل آمن.</li>
	<li>تفعيل الدوار وتشغيله لحوالي 20-30 s.</li>
	<li>تجاهل الحل وشطف لفترة وجيزة داخل الدوار مع الماء المقطر.</li>
	<li>إضافة 250 مل من برنامج تلفزيوني-T في الدوار مرة أخرى.</li>
	<li>كرر الخطوات 4.6 و 4.7.</li>
</ol>5. حضانة مع الأجسام المضادة الثانوية
<ol><li>إعداد 10٪ من العلاج المناعي تعزيز وكيل-2 حل (IRE-2) مع الماء المقطر. دوامة جيدا.</li>
	<li>إعداد الأجسام المضادة الثانوية المخففة مع 10٪ IRE-2. امزجه بلطف ودقة.</li>
	<li>حدد حجم محلول الأجسام المضادة وأنبوب كما هو مذكور في الخطوة 3.3.</li>
	<li>التقط غشاء PVDF مع ملاقط واستنزاف المحلول لفترة وجيزة. أدخل غشاء PVDF في الأنبوب كما هو مذكور في الخطوة 3.4.</li>
	<li>أدخل أنبوب 50 مل في زجاجة فرن التهجين.</li>
	<li>بدوره على فرن التهجين.</li>
	<li>احتضان الغشاء مع دوران 6 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق على الأقل. تأكد من أن الغشاء يتمسك الجدار في جميع الأوقات وأن الأنبوب (الداخلي) أفقي لتغطية الغشاء بالتساوي مع حل الأجسام المضادة. ملاحظة: معايرة وقت الحضانة قبل التجربة الفعلية. عندما يكون الجسم المضاد الثانوي مترافقاً بالفلورسنت، قم بإجراء الحضانة في الظلام.</li>
</ol>6. غسل الأغشية
<ol><li>اتبع الخطوات 4.1 إلى 4.10.</li>
</ol>7. الحصول على صورة
<ol><li>الكشف Chemiluminescent<ol>
<li>ضع قطعة من فيلم مرن شبه زراعة (10 سم × 15 سم) على سطح مستو.</li>
		<li>مزيج 2 مكونات الركيزة chemiluminescent في أنبوب 5 مل.</li>
		<li>نقل على الفور 1.5 مل من الركيزة المختلطة إلى فيلم مرن شبه زرع ووضع غشاء PVDF على ذلك. ثم، نقل بقية محلول الركيزة إلى الغشاء.</li>
		<li>احتضان غشاء PVDF مع الركيزة المختلطة على فيلم مرنة شبه شفافة لمدة 1 دقيقة.</li>
		<li>التقط غشاء PVDF مع ملاقط واستنزاف محلول الركيزة لفترة وجيزة.</li>
		<li>شطيرة الغشاء بين زوج من أفلام الشفافية.</li>
		<li>الحصول على الصورة تحت وضع chemiluminescent.</li>
	</ol>
</li>
	<li>الكشف عن الفلورسنت<ol>
<li>التقط غشاء PVDF مع ملاقط واستنزاف المحلول لفترة وجيزة.</li>
		<li>شطيرة الغشاء بين زوج من أفلام الشفافية.</li>
		<li>الحصول على الصورة تحت وضع الفلورسنت. ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوتين 7.1 و 7.2 على مقربة من آلة التصوير لضمان أقصى حساسية.</li>
		<li>عندما تكون إشارة الخلفية عالية، قم بإجراء خطوة غسيل في حاوية مع 80-100 مل من PBS-T: 10 دقيقة شطف 3 مرات للجسم المضاد الأساسي و 5 دقائق شطف 6 مرات للجسم المضاد الثانوي. ملاحظة: يمكن استخدام كل من الأجسام المضادة الأولية والثانوية المخففة مع حلول IRE 10٪ ما يصل إلى 8-10 مرات دون فقدان الحساسية6. يجب أن يبقى الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>MacPhee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+for+improving+Western+blot+analysis.">Methodological considerations for improving Western blot analysis.</a> Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).</li><li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+critical+factors+for+quantitative+immunoblotting.">An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting.</a> Science Signaling. 8 (371), (2015).</li><li>Schuck, P., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mass+transport+limitation+and+surface+heterogeneity+in+the+biophysical+characterization+of+macromolecular+binding+processes+by+SPR+biosensing.">The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing.</a> Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).</li><li>Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eliminating+Size-Associated+Diffusion+Constraints+for+Rapid+On-Surface+Bioassays+with+Nanoparticle+Probes.">Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes.</a> Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).</li><li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+but+not+Obsolete:+An+Enhanced+High+Speed+Immunoblot.">Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot.</a> Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+Procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Western+blotting":+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).</li><li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+and+analysis:+next+generation+Western+blotting+techniques.">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li><li>Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+EGF+receptor+signaling+dynamics+with+microwestern+arrays.">Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays.</a> Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).</li><li>Treindl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-based+western+for+high-throughput+cellular+signal+transduction+analyses.">A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses.</a> Nature Communications. 7, 12852 (2016).</li><li>Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+western+blot+assay+by+rotational+cyclic+draining+and+replenishing+procedure.">Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure.</a> Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+other+notable+protein+detection+methods+on+blots.">A brief review of other notable protein detection methods on blots.</a> Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).</li><li>Nagase, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+and+Sensitive+Detection+of+Glycosaminoglycan+Chains+with+Immunoblots.">Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots.</a> Glycobiology. , (2020).</li></ol>

وقد أعلن أصحاب البلاغ أنه لا توجد مصالح متنافسة ذات صلة مباشرة بمحتويات هذه المادة.

لطخة الغربية هي تقنية تحليلية تستخدم على نطاق واسع للكشف عن بروتينات محددة التي تم تطويرها ~ قبل 40 عاما7،8. ومنذ ذلك الحين، استمرت هذه التقنية في التطور، مع الابتكارات اللاحقة تحسين حساسية وسرعة، وكمية من تقنية2،9،10،11،12،13. تعزيز فائقة السرعة الغربية بروتوكول النشاف المعروض هنا يجعل العديد من التحسينات الكبيرة على التقنية القائمة. نحن تقليل وقت الحضانة دون التضحية الحساسية عن طريق خفض عتبة الكشف مع IRE. لا توجد حاجة إلى معدات خاصة أو باهظة الثمن: تدوير أنبوب في فرن التهجين يكفي للتغلب على MTL. الابتكار الرئيسي هو أن CDR يلغي بشكل فعال طبقة الاستنفاد في الفحص. على الرغم من أن جهاز الاستزراع الأسطواني يستخدم عادة لتقليل حجم الحل، إلا أن إمكانية هذه الطريقة للتغلب على MTL وتقليل أوقات الحضانة لم توضح. بسبب الانخفاض الجذري في الوقت الإجمالي لإجراء كامل(الشكل 4)، كميات أعلى بكثير من البيانات بقعة الغربية يوميا يمكن الحصول عليها عندما الأغشية المحظورة هي في يد واحد، وهو يكاد يكون من المستحيل القيام بذلك مع بروتوكول النشاف الغربية التقليدية. تجدر الإشارة إلى أن حضانة الغشاء على منصة هزاز شاكر هو ما يعادل الحضانة الساكنة4,6. الشطف أغشية PVDF في السلطة التجارية المنزلية الدوار مع حجم كبير من محلول الغسيل يقلل أيضا من مدة الإجراء (الشكل 4).
يعتمد الاستخدام الناجح لهذا البروتوكول على تحسين تخفيف الأجسام المضادة مع حل IRE ووقت الحضانة. ويوصى مجموعة واسعة من المعايرة الأجسام المضادة في بداية المقايسات منذ CDR بالتزامن مع IRE يزيد من حساسية كبيرة (الشكل 2). وقت الحضانة هو عامل آخر يجب النظر فيه. عندما يكون لدى المرء نتائج جيدة لطخة غربية مع حضانة 1 ح مع الأجسام المضادة الأولية في ظل ظروف ثابتة، يمكن تخفيض وقت الحضانة إلى 5-10 دقيقة تحت ظروف CDR بشكل عام. عندما تكون هناك حاجة الحضانة بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة الأولية على سبيل المثال، ينبغي تقييم وقت حضانة CDR أطول قليلا (30 دقيقة - 6 ح). التخفيف وحضانة الوقت مع الأجسام المضادة الثانوية هي أيضا حاسمة. الاحتضان أكبر من 30 دقيقة في ظل ظروف CDR عادة ما تعطي خلفية أعلى. وبالتالي، مطلوب المعايرة الدقيقة من الأجسام المضادة الثانوية مع ما يصل إلى 30 دقيقة من حضانة CDR. عندما تكون إشارة الخلفية عالية بعد المعايرة الدقيقة للأجسام المضادة ، يجب تنفيذ خطوات غسيل واسعة النطاق (10 دقائق شطف 3 مرات للجسم المضاد الأساسي و 5 دقائق شطف 6 مرات للجسم المضاد الثانوي في وعاء مع 80-100 مل من محلول الغسيل).
نوعية البيانات بقعة الغربية غالبا ما يعتمد على الأجسام المضادة المستخدمة. عندما كان لدينا جسم مضاد صعب يستخدم لللطخة الغربية ، أظهرت علامات البروتين في بعض الأحيان إشارات كبيرة حتى بعد معايرة الأجسام المضادة الدقيقة والغسيل المكثف. منذ أن لاحظنا أن طريقة CDR مع IRE يميل إلى زيادة الربط غير محددة، إضافة الكواشف منع (مثل الحليب الخالي من الدسم وغيرها) في ظائب الأجسام المضادة قد يحسن نسبة إشارة إلى الضوضاء14. إنها خطوة فحص تستغرق وقتا طويلا، ولكنها تستحق المحاولة.
وقد أصبحت البقعة الغربية مهمة للتطبيقات الكمية2. ويمكن إجراء نصف كمية مع الكشف chemiluminescent. الإجراء المعروض هنا ينطبق على تجريد وإعادة التحقيق لهذه الغاية6. بسبب نطاق ديناميكي أوسع، الكشف الفلورسنت هو الخيار الأفضل. مع هذا البروتوكول، يوفر الكشف الفلورسنت نطاق ديناميكي خطي للتحليل الكمي6. ومن الجدير بالذكر أن وقت حضانة CDR مع الكشف الفلورسنت يبدو أطول من ذلك مع الكشف chemiluminescent.
البقعة الغربية لديها مجموعة واسعة من التطبيقات وتبقى طريقة عالمية لدراسة وفرة البروتين، والتفاعلات البروتين البروتين، والتعديلات ما بعد الترجمة. على سبيل المثال، يمكن بسهولة المضادة المضادة الكربوهيدرات المضادة لاستخدامها في لطخة الغربية مع هذا البروتوكول14. منذ مجموعة متنوعة من ال moieties الكربوهيدرات التي أعرب عنها على السطح الخارجي لل الفيروسية, البكتيريا, وfugus هي الممرض محددة, فهي أهداف لا تقدر بثمن للتعرف على مسببات الأمراض وتشخيص الأمراض المعدية. وهكذا ، فإن تطبيق هذا البروتوكول البسيط يمكن أن يؤثر على العديد من مجالات التحقيق ، حلق ساعات من وقت الانتظار ليس فقط للتجارب ولكن أيضا التشخيص المناعي السريري التي تعتمد على تكنولوجيا النشاف الغربية.

البقعة الغربية (المعروفة أيضا باسم مناعي) هي تقنية قوية وأساسية عبر مجموعة واسعة من التخصصات العلمية والسريرية. وتستخدم هذه التقنية لدراسة وجود, وفرة النسبية, كتلة جزيئية نسبية, والتعديلات بعد تحويل البروتينات1. جنبا إلى جنب مع تحليل الصور الرقمية، يمكن لهذه الطريقة تحليل موثوق وفرة من البروتينات والتعديلات البروتين2. على الرغم من أن يتم تنفيذ لطخة الغربية بشكل روتيني، بل هو وسيلة تستغرق وقتا طويلا والعمل المكثف. يتطلب حضانة طويلة من الأجسام المضادة مع الأغشية. هنا، نحن وصف تعديل طريقة الحضانة التي تتغلب على هذا القيد دون التضحية الحساسية.
أثناء حضانة الغشاء ، تطفو الأجسام المضادة في محلول بينما يتم تثبيت المستضدات على الغشاء. بسبب تقاربها عالية، ومعدل للجسم المضاد ملزمة المستضد هو أسرع من انتشار الأجسام المضادة من المحلل السائبة إلى الغشاء. وهذا يخلق تركيز منخفض "طبقة استنزاف"(الشكل 1). قد يستغرق ساعات للأجسام المضادة أكثر بعدا للوصول إلى الغشاء عن طريق الانتشار السلبي، الذي هو العامل الرئيسي المسؤول عن أوقات الحضانة الطويلة في هذه التقنية. هذا التأثير يسمى قيود النقل الجماعي (MTL)3. وقد اقترح أن استنزاف المتكررة وتجديد حل الأجسام المضادة التي تحتوي على قد تعطل طبقة الاستنفاد والتغلب على MTL4. هنا ، قمنا بتصميم تقنية فريدة من نوعها تنفذ هذا المفهوم استنزاف وتجديد دوري (CDR) لتقليل تأثير MTL في بروتوكول النشاف الغربي التقليدي وتقصير فترة الحضانة المطلوبة بشكل ملاحظ.
من أجل الحفاظ على حساسية الكشف مع فترة حضانة قصيرة ، قمنا باستخدام تقنية تعزيز رد المناعة التي تسرع تفاعل مستضد الأجسام ، وبالتالي تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء5. العديد من العوامل المتاحة تجاريا تعزيز رد الفعل المناعي (IRE) تتكون من 2 مكونات (الحل 1 و 2، انظر جدول المواد). لم يتم الكشف عن تكوين الملكية أو آلية عمل IRE ، ولكننا وجدنا سابقا أن IRE انخفض ثابت الانفصام بين المستضد والأجسام المضادة في مرحلة صلبة ملزمة المستويات ، مما يدل على زيادة تقارب ، على الأقل جزئيا ، مسؤولة عن تعزيز تأثير IRE6. مزيج من CDR مع IRE ينتج بروتوكول النشاف الغربية فائقة السرعة التي تقلل من الوقت الإجراء بأكمله دون التضحية الحساسية.

<table><tbody><tr><td>14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Apollo Transparency Film for Laser Printers</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.</td></tr><tr><td>Azure Imaging System 600</td><td>Azure Biosystems</td><td>Azure 600</td><td>Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.</td></tr><tr><td>Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution</td><td>TOYOBO</td><td>NKB-101</td><td></td></tr><tr><td>CARNATION Instant Nonfat Dry Milk</td><td>Carnation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab&amp;rsquo;)2 fragment from sheep</td><td>GE Healthcare</td><td>NA9310V</td><td></td></tr><tr><td>ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab&amp;rsquo;)2 fragment from donkey</td><td>GE Healthcare</td><td>NA9340V</td><td></td></tr><tr><td>HYBAID Micro-4</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.</td></tr><tr><td>Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 &amp;micro;m pore size</td><td>Millipore Sigma</td><td>IPVH304F0</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td><td>LICOR</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td><td>LICOR</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate</td><td>seracare</td><td>5430-0049</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-&amp;szlig; actin antibody</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking Buffer (PBS)</td><td>LICOR</td><td>927-40100</td><td>Blocking Buffer for fluorescent detection</td></tr><tr><td>OXO Salad Spinner</td><td>OXO</td><td>32480V2B</td><td>Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.</td></tr><tr><td>Parafilm Sealing Film</td><td>Bemis</td><td>Parafilm M PM996</td><td>semi-transparent flexible film</td></tr><tr><td>Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Prepared in a machine shop</td></tr><tr><td>Rabbit anti-6X His tag antibody</td><td>Abcam</td><td>ab9108</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr></tbody></table>

ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology

البقعة الغربية (المعروفة أيضا باسم مناعي) هي طريقة متعارف عليها لأبحاث الطب الحيوي. ويستخدم عادة لتحديد الحجم النسبي ووفرة بروتينات محددة، فضلا عن تعديلات البروتين بعد الترجمة. هذه التقنية لها تاريخ غني وتبقى في الاستخدام على نطاق واسع بسبب بساطتها. ومع ذلك ، فإن إجراء النشاف الغربي يستغرق ساعات ، حتى أيام ، لإكمال ، مع اختناق حرج هو أوقات الحضانة الطويلة التي تحد من الإنتاجية. هذه الخطوات الحضانة مطلوبة بسبب الانتشار البطيء للأجسام المضادة من المحلل السائبة إلى المستضدات المُشلّة على الغشاء: تركيز الأجسام المضادة بالقرب من الغشاء أقل بكثير من التركيز الأكبر. هنا، نقدم ابتكاراً يقلل بشكل كبير من فترات الحضانة هذه من خلال تحسين الربط المستضدي عن طريق استنزاف دوري وتجديد (CDR) من محلول الأجسام المضادة. كما استخدمنا تقنية تعزيز رد الفعل المناعي للحفاظ على حساسية الفحص. عزز مزيج من طريقة CDR مع عامل تحسين المناعة التجارية إشارة الإخراج وخفض بشكل كبير وقت حضانة الأجسام المضادة. يمكن إنجاز البقعة الغربية فائقة السرعة الناتجة في 20 دقيقة دون أي خسارة في الحساسية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على البقع الغربية باستخدام كل من chemiluminescent والكشف الفلورسنت. يسمح هذا البروتوكول البسيط للباحثين باستكشاف تحليل تعبير البروتين بشكل أفضل في العديد من العينات.

يوضح هذا المثال فعالية طريقة CDR مع تقنية المناعة على البقع الغربية. تم إجراء حضانة ثابتة على فيلم مرن شبه شفاف حيث تم احتضان أغشية PVDF مع محلول الأجسام المضادة ، في حين أن حضانة CDR كانت في فرن التهجين عن طريق تدوير الأنابيب التي تحتوي على الأغشية وحل الأجسام المضادة (Movie). ويبين الشكل 2 كميات من المستضد والأجسام المضادة، على التوالي، اللازمة للكشف عن الاجسام الكيميائية على البقع الغربية. في كل من حضانات ثابتة وCR، زاد استخدام حل IRE من الحساسية: خفض IRE أقل كمية من الخلايا (المستضد) اللازمة للكشف عن ß-actin من 2.2 ميكروغرام إلى 1.1 ميكروغرام في ظل ظروف ثابتة وتقليلها من 1.1 ميكروغرام إلى 0.275 ميكروغرام باستخدام CDR(الشكل 2A). وبالمثل، تم تخفيض الحد الأدنى للتركيز من المضادة 6x له الوسم الأجسام المضادة من 100 نانوغرام / مل إلى 50 نانوغرام / مل في ظل ظروف ثابتة ومن 100 نانوغرام / مل إلى 12.5 نانوغرام / مل تحت شرط CDR (الشكل 2B). CDR الحضانة إما 5 دقيقة أو 10 دقيقة خفضت بشكل كبير حد الكشف مقارنة مع الحضانة الساكنة (60 دقيقة مع الابتدائي و 30 دقيقة مع الأجسام المضادة الثانوية). وأخيرا، فإن الجمع بين CDR مع IRE كشفت حساسية متفوقة على لطخة الغربية (0.275 ميكروغرام من lysates الخلية للكشف عن ß-actin و 12.5 نانوغرام / مل من المضادة 6x له tag الأجسام) حتى في هذه الفترة حضانة قصيرة للغاية.
يوضح المثال الثاني التطبيق الناجح لهذه الطريقة على بقعة غربية مع الكشف عن الفلورسنت(الشكل 3). الكشف الفلورسنت، على النقيض من الكشف chemiluminescent، لديه قدرة فريدة للكشف عن أهداف متعددة على نفس البقعة في نفس الوقت دون تجريد / إعادة التحقيق الأجسام المضادة. (له) 6 تم الكشف عن 6 مبسومة AP و ß-actin في الخلية lysates في وقت واحد باستخدام فلوريوفور ذو لونين. حضانة CDR مع IRE ليس فقط تسارع الكشف ولكن أيضا زيادة حساسية, مما أدى إلى كشف تدهور (له)6 الموسومة AP (الشكل 3A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61657/61657fig01.jpg"> الشكل 1: رسم توضيحي لطريقة إعادة تغذية استنزف الدوري. (A) طبقة استنزاف بالقرب من الغشاء تتشكل بسرعة في ظل ظروف ثابتة عندما يكون للمسبار تقارب عالٍ للمستضد ولكن قدرة محدودة على الانتشار من خلال الحل. وهكذا، والسفر من المسبار إلى الغشاء يصبح معدل الحد من الخطوة وأوقات الحضانة طويلة تعويض عن الحد من نقل الشامل. (B) طريقة CDR عن طريق تدوير الأنبوب في حين أن الغشاء يتمسك الجدار يلغي طبقة الاستنفاد ويغذي نفس الحل التحقيق للحفاظ على تركيز المسبار بالقرب من ثابت الغشاء. وقد تم تعديل هذا الرقم من هيغاشي وآخرون6. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61657/61657fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61657/61657fig02.jpg"> الشكل 2: (أ)تم فصل كميات مختلفة من 293 خلية (1:2 تخفيفات تسلسلي من 8.8 ميكروغرام /حارة) من قبل SDS-PAGE، تليها نقل إلى غشاء PVDF والحجب مع الحليب الخالي من الدسم 5٪ في PBS-T. تم فحص البقعة مع الأجسام المضادة لمكافحة ß-actin الماوس (1:3,000 تخفيف). (ب) بعد فصل الوسائط المشروطة المستمدة من الخلايا 293 المصابة بالعدوى مع pAPTAG5 (GenHunter) التي تحتوي على يفرز (له)6 الموسومة فوسفاتاتيز القلوية (AP, 8 x 10-14 مول / حارة), تم نقل البروتينات إلى أغشية PVDF. وقد تعرض كل غشاء للطخة الغربية مع تركيزات مختلفة من المضادة 6x له الوسم الأجسام المضادة (1:2 تخفيف المسلسل من 400 نانوغرام / مل). تم تصوير الأغشية كصورة واحدة وخطوط منقط تشير إلى حدود الأغشية الفردية. وقد تم تعديل هذا الرقم من هيغاشي وآخرون6. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61657/61657fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61657/61657fig03.jpg"> الشكل 3: الكشف المتزامن عن أهداف متعددة على بقعة غربية باستخدام الكشف الفلوري وCDR بالتزامن مع IRE. تم فصل كميات مختلفة من الليزات (1:2 تخفيفات تسلسلي من 10 ميكروغرام /حارة) من 293 خلية مصابة بـ pAPTAG5 ونقلت إلى غشاء PVDF. بعد حجب مع العازلة حظر للكشف الفلورسنت (BFD) لمدة 1 ساعة، تم التحقيق في وصمة عار مع المضادة 6X له العلامة المضادة والأجسام المضادة ß-actin، تليها IRDye 800CW الماعز المضادة للأرانب IgG وIRDye 680RD الماعز المضادة للماوس IgG. A: الأجسام المضادة المخففة مع 10٪ حل IRE تحت شرط CDR، B: الأجسام المضادة المخففة مع BFD تحتوي على 0.1٪ Tween20 تحت شرط ثابت. بسبب حساسية أعلى مع CDR و IRE الجمع، وشوهدت تدهور (له)6 مُوسّمة AP. وقد تم تعديل هذا الرقم من هيغاشي وآخرون6. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61657/61657fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61657/61657fig04.jpg"> الشكل 4: رسم توضيحي تخطيطي لطخة (CDR) الغربية المحسنة وعالية السرعة مقارنةً بطريقة ثابتة تقليدية. وقد تم تعديل هذا الرقم من هيغاشي وآخرون6. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61657/61657fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology at JoVE.com

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

يتم تطوير تقنية النشاف الغربية فائقة السرعة من خلال تحسين حركية الأجسام المضادة المضادة المضادة الملزمة من خلال تقنية تجفيف الدوريات وتجديدها (CDR) بالاقتران مع عامل تعزيز رد المناعة.

فائق السرعة الغربية لطخة باستخدام تقنية تحسين رد المناعة

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

ultra-high-speed-western-blot-using-immunoreaction-enhancing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

5.8K Views.  National Institutes of Health. يتم تطوير تقنية النشاف الغربية فائقة السرعة من خلال تحسين حركية الأجسام المضادة المضادة المضادة الملزمة من خلال تقنية تجفيف الدوريات وتجديدها (CDR) بالاقتران مع عامل تعزيز رد المناعة.

Video: Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. Radioactivity has been the predominant method of DNA labeling in EMSAs. However, recent advances in fluorescent dyes and scanning methods have prompted the use of fluorescent tagging of DNA as an alternative to radioactivity for the advantages of easy handling, saving time, reducing cost, and improving safety. We have recently used fluorescent EMSA (fEMSA) to successfully address an important biological question. Our fEMSA analysis provides mechanistic insight into the effect of a missense mutation, G73E, in the highly conserved HMG transcription factor SOX-2 on olfactory neuron type diversification. We found that mutant SOX-2G73E protein alters specific DNA binding activity, thereby causing olfactory neuron identity transformation. Here, we present an optimized and cost-effective step-by-step protocol for fEMSA using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides containing the LIM-4/SOX-2 adjacent target sites and purified SOX-2 proteins (WT and mutant SOX-2G73E proteins) as a biological example.

We describe here an optimized protocol of fluorescent Electrophoretic Mobility Shift Assays (fEMSA) using purified SOX-2 proteins together with infrared fluorescent dye-labeled DNA probes as a case study to tackle an important biological question.

بروتوكول الأمثل لالكهربي التنقل التحول الفحص عن طريق أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ الأشعة تحت الحمراء نيون

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

الغربية التنشيف باستخدام NuPage Invitrogen Novex مكرر تريس MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Biology

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides an alternative strategy, capillary isoelectric focusing (cIEF), with many advantages compared to conventional immunoblotting. This is an antibody-based, automated, rapid, and quantitative method in which a complete western blotting procedure takes place inside an ultrathin capillary. This technique does not require a gel to transfer to a membrane, stripping of blots, or x-ray films, which are typically required for conventional immunoblotting. Here, proteins are separated according to their charge (isoelectric point; pI), using less than a microliter (400 nL) of total protein lysate. After electrophoresis, proteins are immobilized onto the capillary walls by ultraviolet light treatment, followed by primary and secondary (horseradish peroxidase (HRP) conjugated) antibody incubation, whose binding is detected through enhanced chemiluminescence (ECL), generating a light signal that can be captured and recorded by a charge-coupled device (CCD) camera. The digital image can be analyzed and quantified (peak area) using software. This high throughput procedure can handle 96 samples at a time; is highly sensitive, with protein detection in the picogram range; and produces highly reproducible results because of automation. All of these aspects are extremely valuable when the quantity of samples (e.g., tissue samples and biopsies) is a limiting factor. The technique has wider applications as well, including screening of drugs or antibodies, biomarker discovery, and diagnostic purposes.

Capillary isoelectric focusing is an antibody-based, ultrasensitive, high throughput technique, enabling detailed characterization of proteins and their isoforms from extremely small biological samples. The following describes a protocol for detection and quantification of specific proteins and their isoforms in an automated and robotized manner.

كشف حساسة للغاية وكمية من البروتينات وعلى إيسوفورمس بطريقة تركز Isoelectric الشعرية

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Immunoblot Analysis

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. It involves the solubilization and electrophoretic separation of proteins, glycoproteins, or lipopolysaccharides by gel electrophoresis, followed by quantitative transfer and irreversible binding to nitrocellulose, PVDF, or nylon. The immunoblotting technique has been useful in identifying specific antigens recognized by polyclonal or monoclonal antibodies and is highly sensitive (1 ng of antigen can be detected). This unit provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. This video provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

تحليل طخة مناعية

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

الغربية التنشيف : إعداد نموذج لكشف

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

أسرع الغربية في المدينة: لمسة عصرية على تحليل كلاسيكي غربي وصمة عار

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

دليل لمودرن الكمية نيون الغربية التنشيف مع استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Immunoprecipitation-Based Techniques: Purification of Endogenous Proteins Using Agarose Beads

Source: Susannah C. Shissler1, Tonya J. Webb1 
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland, Baltimore, MD 21201
Immunoprecipitation (IP, also known as a &#39;pull-down&#39; assay) is a widely used technique that has applications in a variety of fields. First conceived in 1984, it was refined in 1988 (1, 2). The fundamental goal of IP is purification and isolation of a specific protein using an antibody against that protein. The word &#34;immuno&#34; refers to the use of an antibody while the word &#34;precipitation&#34; refers to pulling down a specific substance from a solution. The target protein might be endogenous or recombinant. Most recombinant proteins have an epitope tag (i.e. myc or flag) attached to them to simplify subsequent purification. Typically, it is easier to optimize recombinant protein IP because the antibodies against recombinant epitope tags are very strong and effective. Antibodies against endogenous proteins have extremely variable efficacy - making it much more difficult to optimize these IPs. A necessary step after immunoprecipitation is verification of purification. The isolated protein is resolved using SDS-PAGE and subsequently probed for purity by western blots (Figure 1). An important control is the use of a different antibody during the Western blot to verify pull down of the correct protein. The combination of IP with subsequent techniques is a powerful analysis tool. The goal after purification may be characterization of the protein itself by NMR, mass spectrometry, and in vitro assays, or analysis of the protein&#39;s interacting partners (i.e. protein, DNA, RNA) (3, 4, 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10502/10502fig1.jpg" /> 
Figure 1: Overview of Immunoprecipitation Procedure. Immunoprecipitation is the isolation of a specific protein using an antibody. After production of lysate from cells, there are two major steps- pre-clearing and pull down. During pre-clearing step, the cell-lysates are pre-cleared of proteins that bind to antibodies non-specifically using an isotype control antibody. In pull down step, the target protein is pulled down using a protein-specific antibody. The isolated protein is then analyzed by Western blot. Isotype antibodies and protein specific antibodies have the same constant domain, but different antigen binding domains. A key component of this protocol is Protein A/G agarose beads that bind the constant domain of antibodies- allowing immunoprecipitation of the target protein. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/10502/10502fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Antibodies are the key component of an immunoprecipitation that differentiate it from other forms of protein purification (i.e. nickel affinity column purification). Antibodies are molecules made by B cells that can recognize specific protein epitopes. Antibodies have two domains: constant (Fc) and antigen binding (Fab) (Figure 1). The constant domain identifies the type of antibody and dictates function in vivo. Usually, the constant domains of antibodies used for IP are mouse, rat, or rabbit IgG. The antigen binding portion of the antibody recognizes a specific epitope of a specific protein. Antibodies can recognize epitopes on folded proteins that may not exist when the protein is denatured and vice versa. Therefore, the availability of the epitope depends on protein folding - identifying an important factor to consider when choosing antibodies and conditions for IP.
Both prokaryotic and eukaryotic systems have antibody-binding proteins. In eukaryotic systems, the purpose is immune protection from bacteria while in prokaryotic systems, the purpose is protection from the immune system. Antibody-binding proteins affect IP methodology in two ways. First, there is a necessary pre-clearing step (Figure 1) to rid the lysate of proteins that bind antibodies - thereby reducing non-specific binding in the final product. This step uses an isotype antibody that has the same constant domain as but a different antibody binding domain than your protein-specific antibody. Bacterial antibody-binding proteins are the second key component of this method. After the protein-specific antibody binds the target protein, the antibody: protein complex must be pulled down (Figure 1). Proteins A, G, and L are bacterial proteins that bind the constant domain of antibodies. While bacteria use this to subvert the immune system, researchers have co-opted this system for easy antibody purification, and it is used during both the pre-clearing and pull-down steps. These proteins have different binding affinities for different species and different constant domain subtypes - another factor to consider when choosing conditions for IP. Many companies sell Protein A/G labeled agarose beads (Figure 1), pre-made spin columns, or resins to make columns. In general, beads and spin columns are used for smaller sample sizes while resins are used for bulk purification.
In this lab exercise, we demonstrate how to purify the endogenous protein c-myc, from primary murine thymocytes, using Protein A/G Plus agarose beads based basic immunoprecipitation technique. The protocol starts from cell lysate preparation and ends with the with verification of successful protein pull down using Western blot analysis.

Immunoprecipitation Techniques: Purification of Proteins

Source: Susannah C. Shissler1, Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland, Baltimore, MD 21201
Immunoprecipitation ...

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Immunology

The Western Blot

Western Blotting is used to identify the presence of specific proteins in electrophoretically separated samples. Following separation by a technique known as sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE, western transfer is used to move proteins from a polyacrylamide gel onto a piece of membrane which traps the proteins in their respective locations. Next, the membranes are probed with antibodies in a process called immunboblotting. Immunoblotting uses antibody-protein and antibody-antibody binding through specific recognition sites, providing the high specificity required for identifying a single protein. The detection of antibodies takes place using reporter systems which includes the use of enzymes. Enzymes can be attached to the end of an antibody and react with substrates to produce changes in color or light. These signals can then be imaged and quantified using a process called densitometry.
This video-article presents an overview of the western blot technique by describing western transfer, the use of antibody detection, and image analysis. The steps involved with western transfer such as the assembly of the transfer sandwich and transfer conditions are discussed in detail as well as the theory behind antibody binding and detection of those antibodies. The broad applications of this technique are described through several examples including the detection of protein-protein interactions and identification of individual proteins within protein complexes.

Western Blotting: Western Transfer, Antibody Detection, and Image Analysis

Western Blotting is used to identify the presence of specific proteins in electrophoretically separated samples.  Following separation by a technique ...

Basic Biology

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/62842">Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video describes the chemiluminescence-based western blotting of immunoprecipitated lysates. The technique helps determine protein processing and activation. The chemiluminescent signal detected is proportional to the level of protein processing during its activation.

فحص اللطخة الغربية المضيئة الكيميائية لمعالجة البروتين

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex. J. ...