Die biologische Kleinwinkel-Röntgenstreuung ermöglicht strukturelle Messungen von Makromolekül- und Makromolekularkomplexen. Idealerweise sollte die zu messende Probe monodispergiert sein. Obwohl in einigen Fällen die Größenausschlusschromatographie SAXS nicht ausreicht, um Monodispersität zu erzeugen, kann eine softwarebasierte Dekonvolution der SAXS-Daten durchgeführt werden, um eine idealisierte SAXS-Kurve zu erzeugen.
Im Anschluss an dieses Protokoll können ein Dekonvolution-Programm und das benutzerfreundliche Scatter-Programm verwendet werden, um das Vaccinia-Virus DNA-Polymerase-Exominus-Mutationen zu analysieren. Um eine Hintergrundsubtraktion der Größenausschlusschromatographiedaten durchzuführen, öffnen Sie das Java-basierte Scatter 4-Programm, und öffnen Sie die Registerkarte SEC. Ziehen und ablegen Sie die reduzierten Datendateien in die Drop-Daten unter dem Fenster, klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausgabeverzeichnis" und öffnen Sie, um das Ausgabeverzeichnis festzulegen, in dem die Daten gespeichert werden.
Geben Sie den Beispielnamen in das Feld Speichern als ein, und klicken Sie auf Ablaufverfolgung. Klicken Sie auf die Schaltfläche Details bearbeiten, um die experimentellen Details zu bearbeiten und die entsprechenden Felder auszufüllen. Um die Pufferrahmen manuell auszuwählen, klicken Sie auf Puffer festlegen.
Klicken Sie mit der linken Maustaste und ziehen Sie, um den Puffer als flache Stagnungskurve vor dem leeren Volumen der Spalte "Größenausschlusschromatographie" von etwa 100 Frames erneut auszuwählen, und klicken Sie auf Puffer festlegen, und aktualisieren Sie, um die SEC-Datei neu zu berechnen. Klicken sie mit der linken Maustaste und ziehen Sie, um einen Bereich auszuwählen, der für das Signaldiagramm von Interesse ist, und ziehen Sie die Fadenkreuze im Heatmap-Plot, um den Zoom und die Teilmenge der Frames auszuwählen, die zum Zusammenführen verwendet werden. Markieren Sie mit einem weiteren Linksklick die Rahmen in der Heatmap, die dem Bereich der rechten unteren Seite der Fadenkreuze entsprechen.
Idealerweise sollte der Rahmen einen Bereich mit einer überwiegend zyanischen Farbe und einem stabilen Kreiselradius hervorheben. Wenn Sie mit den ausgewählten Frames zufrieden sind, klicken Sie auf Zusammenführen, um die subtrahierten Frames zusammenzuführen, und klicken Sie auf die Registerkarte Analyse, um die Daten anzuzeigen. Laden Sie den Datensatz in das Dekonvolution-Programm, um die Daten zu dekonvolutionieren.
Verwenden Sie im Bedienfeld unter Dateien das Ordnersymbol, um die Daten zu suchen und alle DAT-Dateien hervorzuheben. Im Seriendiagramm wird ein Diagramm mit integrierter Intensität im Vergleich zur Rahmenzahl gezeichnet. Klicken Sie auf der Registerkarte Serie, um die Kurve hervorzuheben und das Popupfenster für die LC-Analyse zu öffnen.
Um einen geeigneten Pufferbereich auszuwählen, klicken Sie auf Bereich hinzufügen, um einen Bereich vor der Spitze des Chromatogramms und einen nach der Lösungsmittelfront auszuwählen, und klicken Sie auf Den puffer festlegen. Popupfenster zeigen an, dass Rahmen nicht für den Hintergrund ausgewählt wurden. Um die EFA zu starten, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die markierte Datei und wählen Sie EFA aus dem Menü aus.
Im Popupfenster sollte die Einzelwertzerlegung des Datasets beobachtet werden. Aktivieren Sie im Feld Steuerelemente die Werte für die Verwendung von Rahmen, um zu bestätigen, dass der gesamte zu dekonvolute maximale Bereich im Intensitätsdiagramm abgedeckt ist. Das Singularwertediagramm zeigt die Intensität der Singularwerte über der Basislinie an.
Wenn die linken und rechten Einzelvektoren nicht übereinstimmen, ändern Sie die signifikante Singularvektorzahl in zwei, und verschieben Sie die Frames, bis die linken und rechten Singularvektoren ähnlich sind. Der EFA wird berechnet, erzeugt Diagramme in Vorwärts- und Rückwärtsrichtung für jeden Vektor und gibt an, wann die Komponenten das Lösungsprofil für die ausgewählten Größenausschlusschromatographie-SAXS-Daten starten und verlassen. RAW versucht, die Bereiche zu identifizieren.
Verwenden Sie bei Bedarf die Pfeile, um die Bereiche so zu ändern, dass jeder Kreis der Beginn eines Wendepunkts ist, der von oder vom Basisgrund aufsteigt oder fällt, und klicken Sie auf weiter. Um Spitzen zu reduzieren oder zu eliminieren, identifizieren Sie ungefähr, welcher Rahmen der Spitze entspricht, indem Sie die Bereichssteuerungspfeile verwenden, um die Komponentenbereichssteuerelemente anzupassen. Wenn ein Mindest-Chi-Quadrat erreicht wurde, klicken Sie zurück, um eine Validierungsprüfung durchzuführen.
Wenn die ursprünglichen EFA-Plots noch gültig aussehen, klicken Sie auf Weiter, und speichern Sie EFA-Daten, um die Diagramme zu speichern. Klicken Sie dann auf Fertig, um das EFA-Fenster zu schließen. Öffnen Sie dann im RAW-Fenster Profile im Plotfenster, um die Kurven anzuzeigen.
Klicken Sie auf der Registerkarte Profile des Bedienfelds mit der rechten Maustaste, um die Kurven als DAT-Dateien zu speichern. Öffnen Sie zur SAXS-Ermittlung die Registerkarte Streuungsanalyse, und wählen Sie G aus, um das manuelle Guinier-Analysewerkzeug auszuwählen. Fügen Sie im Diagramm Punkte hinzu oder entfernen Sie sie, sodass die Residuen kein Lächeln oder Stirnrunzeln haben.
Die ausgewählten Daten in der Guinier-Anpassung sollten die maximale Warteschlange multipliziert mit dem Kreiselradius von 1,3 nicht überschreiten. Klicken Sie auf normalisierte kratky. Die resultierende Darstellung liefert eine Bewertung des strukturellen Zustands des Makromoleküls, kugelförmig, zylindrisch, ungeordnet, normalisiert für Masse und Konzentration.
Klicken Sie auf das Volumen der Korrelation. Die gesamte streute Intensität und ein integrierter Bereich der gesamten Streuintensität als Funktion von Q-Plots erscheinen als Schnelle Referenz für die Validierung der Qualität der Streukurve. Um die Flexibilitätsanalyse zu starten, klicken Sie auf Flexibilität.
Jedes Panel im Popup-Fenster zeigt ein Diagramm, das eine Machtrechtsbeziehung ausnutzt, die zwischen den kompakten und den langgestreckten flexiblen Biopolymeren besteht. Verwenden Sie den Schieberegler am unteren Rand des Feldes, um die Ansicht der Daten zu ändern, bis ein Plateau in einem der Diagramme erreicht ist. Klicken Sie unmittelbar nach der Durchführung einer Flexibilitätsanalyse auf Volume.
Es wird ein Popup mit drei Diagrammen generiert. Die Porod-Debye-Plot-Diagrammspuren, wo der Schieberegler aus dem Flexibilitätsdiagramm links und zeigt die Plateau-Bereich Daten. Um das Volumen des Partikels zu berechnen, verschieben Sie den Anfangs- und Endpunkt, bis die blaue Linie auf dem Diagramm in den Plateaubereich passt.
Für ein unvoreingenommenes Ergebnis sollten die Residuen im Porod-Debye Exponenten-Machtgesetz kein Muster aufweisen. Unter der Registerkarte P von R können die reale Raumverteilung und die Streukurve für die Probe beobachtet werden. Idealerweise sollte die Verteilungskurve ohne Wellen glatt sein und nur sanft die x-Achse berühren.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Beispielnamen und klicken Sie auf DMAX suchen, um ein neues Fenster zu öffnen. Die Grenzwerte für die maximale Dimension sind mit dem vorgeschlagenen maximalen Q-Bereich, den für die Berechnung zu verwendenden maximalen Datenpunkten, den unteren und oberen maximalen Dimensionsgrenzen sowie einem unteren und oberen Alpha-Score voreingestellt. Klicken Sie auf Start.
Es wird eine zusammengesetzte Verteilung zusammen mit einer vorgeschlagenen maximalen Dimension und Alphaebene erstellt. Wenn diese Daten akzeptabel sind, schließen Sie das Fenster, um zur Registerkarte P von R zurückzukehren, wo das gegenseitige Leerzeichen nun zugeschnitten wird, um dem vorgeschlagenen maximalen Q-Bereich zu entsprechen. Wählen Sie das Modell "Weitere Modelle" aus, und klicken Sie auf Hintergrund, um die Alphaebene und die maximale Dimension auf die vorgeschlagenen Werte aus dem Popup-Feld festzulegen.
Klicken Sie auf Verfeinern. Es wird ein Kreuzvalidierungsdiagramm geöffnet, das anzeigt, ob Punkte wie rot angegeben zurückgewiesen werden mussten. Wenn es nur wenige abgelehnte Punkte gibt und die Verteilung gut aussieht, dann ist das Modell gut.
Sie drucken einen Bericht auf der Registerkarte Analyse. Klicken Sie mit der linken Maustaste, um das Beispiel hervorzuheben, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Beispielnamen. Wählen Sie Bericht aus dem einzelnen Dataset erstellen aus.
Es wird ein Textfeld geöffnet, in dem Kommentare möglich sind, und es wird ein PDF-Dokument mit allen generierten Zahlen und Werten erstellt. In dieser repräsentativen Analyse wurde E9 DNA-Polymeraseexonuklease minus Mutant an die DNA gebunden und lief mit Größenausschlusschromatographie Kleinwinkel-Röntgenstreuung. Es wurden zwei Gipfel beobachtet.
Der erste große Peak stellt den E9-DNA-Polymeraseexonuklease minus mutierten DNA-Komplex dar. Und die zweite zeigt den ungebundenen Zustand an. Während der klassische Ansatz der Auswahl von Rahmen einen stabilen Kreiselradius des Komplexes in der ersten Spitze bietet, wird der zweite Gipfel klar zusammengeführt und der Kreiselradius über das Diagramm zeigt, dass der zweite Gipfel von Interesse keinen stabilen Kreiselradius aufgrund von Kreuzspitzenkontamination hat.
In dieser Analyse konnten nur fünf Rahmen verwendet werden, die einen halbstabilen Kreiselradius zeigten. Wenn sie subtrahiert wurden, gaben sie einen Kreiselradius von 36,3 Angstroms an. Wenn die Spitzen mit EFA dekonvolutiert wurden, wurde die entsprechende Kurve für den zweiten Peak mit dem Original überlagert, was eine deutliche Abnahme des Signals auf das Rauschen und einen niedrigeren Kreiselradius von 34,1 Angstroms zeigte.
Ein Kratky-Diagramm der Daten zeigt, dass der Komplex mit dem verworrenen Peak kugeliger ist, wie die PR-Kurve bestätigt, die eine maximale Dimension von 108,5 Angstroms für die dekonvolutierte Kurve ergibt. Die nicht dekonvolutierten Daten für diese Analyse sind mit einer maximalen Dimension von 120 Angstroms gestreckt, wahrscheinlich aufgrund der Heterogenität, die sich aus der ungebundenen E9-Polymerase minus Exonukleasemutant ergibt. Die wichtigsten Schritte sind die Auswahl der Singularwerte und des verwendeten Datenbereichs, da diese die Genauigkeit der Dekonvolution stark beeinflussen.
Die Ergebnisse sollten nicht allein genommen, sondern mit zusätzlichen Techniken wie analytischezentrifugation oder Multi-Winkel-Laserlichtstreuung weiter bewertet werden, um ihre biologische Interpretation zu ermöglichen. Inline-Säulengekoppelte SAXS in Kombination mit Dekonvolution und einer benutzerfreundlichen Schnittstelle wie das Programm Scatter bietet ein leistungsstarkes Paket, um aussagekräftige Strukturdaten auch aus an sich schwierigen Systemen bereitzustellen.
