A dispersão biológica de raios-X de pequeno ângulo fornece medições estruturais de complexos macromoléculas e macromoleculares. Idealmente, a amostra a ser medida deve ser monodispersada. Embora, em alguns casos, a cromatografia de exclusão de tamanho SAXS não seja suficiente para produzir monodispersidade, uma desconvolução baseada em software dos dados saxs pode ser realizada para produzir uma curva SAXS idealizada.
Seguindo este protocolo, um programa de desconvolução e o programa scatter fácil de usar podem ser usados para analisar os mutantes de poliomisão de DNA do vírus Vaccinia. Para realizar uma subtração de fundo dos dados de cromatografia de exclusão de tamanho, abra o programa Scatter 4 baseado em Java e abra a guia SEC. Arraste e solte os arquivos de dados reduzidos na janela de dados de queda e clique no botão diretório de saída e abra para definir o diretório de saída no qual os dados serão salvos.
Digite o nome da amostra na caixa salvar como caixa e clique em rastrear. Clique no botão de detalhes de edição para editar os detalhes experimentais e preencher os campos apropriados. Para selecionar os quadros de buffer manualmente, clique em definir buffers.
Clique esquerdo e arraste para reseleger o buffer como um plano na curva de rastreamento antes do volume vazio da coluna de cromatografia de exclusão de tamanho de aproximadamente 100 quadros e clique em definir buffer e atualizar para recalcular o arquivo SEC. Clique e arraste para selecionar uma região de interesse no gráfico de sinal e clique esquerdo e arraste os cabelos cruzados no gráfico do mapa de calor para selecionar o zoom e subconjunto de quadros que serão usados para fusão. Com outro clique à esquerda, destaque os quadros no mapa de calor correspondentes à área do canto inferior direito dos cabelos cruzados.
Idealmente, o quadro deve destacar uma região com uma cor predominantemente ciano e um raio estável de giro. Quando estiver satisfeito com os quadros selecionados, clique em mesclar para mesclar os quadros subtraídos e clique na guia de análise para visualizar os dados. Para desconvolução dos dados, carregue o conjunto de dados no programa de desconvolução.
No painel de controle sob arquivos, use o símbolo da pasta para localizar os dados e destacar todos os arquivos DAT. Um enredo de intensidade integrada versus número de quadro será desenhado na trama da série. Na guia série, clique para destacar a curva e para abrir a janela popup de análise LC.
Para selecionar uma região tampão adequada, clique em adicionar região para selecionar uma área antes do pico do cromatograma e uma após a frente do solvente e clique em definir o buffer. As janelas pop-up indicarão que os quadros não foram selecionados para o plano de fundo. Para iniciar o EFA, clique com o botão direito do mouse no arquivo destacado e selecione EFA no menu.
Na janela pop-up, deve-se observar a decomposição de valor único do conjunto de dados. Na caixa de controles, verifique os valores da caixa de quadros de uso para confirmar que toda a área de pico para desconvoluir está coberta pelo gráfico de intensidade. O enredo de valores singulares mostrará a intensidade dos valores singulares acima da linha de base.
Se os vetores únicos esquerdo e direito não corresponderem, altere o número de vetor singular significativo para dois e mova os quadros até que os vetores singulares esquerdo e direito sejam semelhantes. O EFA será calculado, gerando parcelas nas direções para frente e para trás para cada vetor e indicando quando os componentes iniciam e saem do perfil da solução para os dados saxsográficos de exclusão de tamanho selecionado. Raw tentará identificar as faixas.
Se necessário, use as setas para alterar os intervalos de modo que cada círculo seja o início de um ponto de inflexão, subindo ou caindo para a linha de base e clique em seguida. Para reduzir ou eliminar os picos, identifique aproximadamente qual quadro corresponde ao pico usando as setas de controle de alcance para ajustar os controles de alcance dos componentes. Quando um quadrado chi mínimo tiver sido alcançado, clique de volta para realizar uma verificação de validação.
Se os gráficos originais do EFA ainda forem válidos, clique em seguir e salve os dados da EFA para salvar os plots. Em seguida, clique feito para fechar a janela EFA. Em seguida, na janela RAW, abra perfis no painel de enredo para visualizar as curvas.
Na guia perfis do painel de controle, clique com o botão direito do mouse para salvar as curvas como arquivos DAT. Para determinar o SAXS, abra a guia de análise de dispersão e selecione G para selecionar a ferramenta de análise Guinier manual. Na trama, adicione ou remova pontos de tal forma que os resíduos não tenham um recurso de sorriso ou carranca.
Os dados selecionados no ajuste guinier não devem exceder a fila máxima multiplicada por raio de limite de giro de 1,3. Clique em Kratky normalizado. O enredo resultante fornece uma avaliação do estado estrutural da macromolécula, globular, cilíndrico, desordenado, normalizado para massa e concentração.
Clique no volume de correlação. A intensidade total dispersa e uma área integrada da intensidade total dispersa em função das parcelas Q aparecerão como uma referência rápida para validar a qualidade da curva de dispersão. Para iniciar a análise de flexibilidade, clique em flexibilidade.
Cada painel na janela pop-up mostrará um enredo explorando uma relação de lei de poder que existe entre o compacto e os biopolímeros flexíveis alongados. Use o controle deslizante na parte inferior da caixa para alterar a visão dos dados até que um platô em uma das parcelas seja alcançado. Imediatamente após a realização de uma análise de flexibilidade, clique no volume.
Um popup de três gráficos será gerado. A trama de Porod-Debye rastreia onde o controle deslizante da trama de flexibilidade foi deixado e mostra os dados da área platadas. Para calcular o volume da partícula, mova os pontos de partida e final até que a linha azul na trama se encaixe na região platô.
Para um resultado imparcial, os resíduos da lei de poder expoente Porod-Debye não devem mostrar nenhum padrão. Sob a guia P de R, a distribuição real do espaço e a curva de dispersão para a amostra podem ser observadas. Idealmente, a curva de distribuição deve ser suave, sem ondas e deve apenas tocar suavemente o eixo x.
Clique com o botão direito do mouse no nome da amostra e clique em encontrar DMAX para abrir uma nova janela. Os limites para a dimensão máxima são predefinidos com a faixa máxima Q sugerida, os pontos de dados máximos a serem utilizados para o cálculo, os limites de dimensão máxima inferior e superior, e um escore alfa inferior e superior. Clique em iniciar.
Uma distribuição composta será criada juntamente com uma dimensão máxima sugerida e nível alfa. Se esses dados forem aceitáveis, feche a janela para retornar à guia P de R, onde o gráfico de espaço recíproco será agora cortado para corresponder à faixa máxima de Q sugerida. Selecione o modelo mais e clique em plano de fundo para definir o nível alfa e a dimensão máxima aos valores sugeridos da caixa pop-up.
Clique em refinar. Uma parcela de validação cruzada será aberta, mostrando se algum ponto teve que ser rejeitado como indicado em vermelho. Se há apenas alguns pontos rejeitados e a distribuição parece boa, então o modelo é bom.
Você imprimirá um relatório na guia de análise. Clique à esquerda para destacar a amostra e o clique à direita no nome da amostra. Selecione criar relatório a partir do conjunto de dados único.
Uma caixa de texto será aberta para permitir comentários e um documento PDF será produzido mostrando todos os números e valores gerados. Nesta análise representativa, a exonuclease de DNA E9 menos mutante foi ligada ao DNA e executada usando a dispersão de raios-X de pequeno ângulo de exclusão de tamanho. Dois picos foram observados.
O primeiro grande pico representa a exonuclease de DNA E9 menos o complexo de DNA mutante. E o segundo indica o estado desvinculado. Enquanto a abordagem clássica de selecionar quadros fornece um raio estável de giro do complexo no primeiro pico, o segundo pico é claramente mesclado e o raio de giro em toda a trama mostra que o segundo pico de interesse não tem um raio estável de giro devido à contaminação do pico cruzado.
Nesta análise, apenas cinco quadros foram utilizados que apresentaram um raio semi-estável de giro. Quando subtraídos, deram um raio de giro de 36,3 angstroms. Quando os picos foram desconvolucidos usando EFA, a curva correspondente para o segundo pico foi sobreposta com o original, mostrando uma clara diminuição do sinal para o ruído e menor raio de giro de 34,1 angstroms.
Um gráfico kratky dos dados revela que o complexo com o pico complicado é mais globular como confirmado pela curva de RP que dá uma dimensão máxima de 108,5 angstroms para a curva desconvoluida. Os dados não desconvolucidos para esta análise são mais alongados com uma dimensão máxima de 120 angstroms, provavelmente devido à heterogeneidade decorrente da polimerase E9 não ligada menos mutante exonuclease. Os passos mais críticos estão na seleção dos valores singulares e da gama de dados utilizados, pois estes afetam muito a precisão da desconvolução.
Os resultados não devem ser tomados por conta própria, mas ainda mais avaliados usando técnicas adicionais, como centrifugação analítica ou dispersão de luz laser multi-ângulo para permitir sua interpretação biológica. Saxs acoplado a colunas em linha em combinação com a desconvolução e uma interface fácil de usar como o programa Scatter fornece é um pacote poderoso para fornecer dados estruturais significativos mesmo a partir de sistemas intrinsecamente difíceis.
