Wir danken die Teilnehmern in der Kinder-Onkologie-Gruppe AAML1531-Studie und der Nurses' Health Studie für ihre Beiträge in Form von Patientenproben. Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (UM1 CA186107, RO1 CA49449 und RO1 CA149445), der Kinderuni Discovery Institute of Washington St. Louis Children Hospital (MC-II-2015-461) und Eli Seth Matthews Leukämie Stiftung finanziert.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier zeigen wir eine Reihe von Fehler korrigiert Sequenzierung Protokolle, die leicht umsetzbar sind, um Mutationen mit niedrigen VAFs bei verschiedenen Krankheiten zu studieren. Der wichtigste Faktor ist die Einarbeitung von UMIs mit jedem Molekül vor der Sequenzierung, da sie Fehlerkorrektur des rohen lautet ermöglichen. Die hier beschriebenen Methoden erlauben Forschern, maßgeschneiderte UMIs zu handelsüblichen gen Panels und selbst entworfenen Gen-spezifischen Oligos zu integrieren.
Standardprotokoll NGS schließt den Nachweis von Mutationen mit VAF unter 2 % aufgrund der Sequenzierung Fehlerquote, und dies schränkt die Anwendung der NGS in Studien, in denen der Nachweis von seltenen Varianten entscheidend ist. Unter Umgehung den Normalsatz der NGS-Fehler, ermöglicht ECS empfindliche Detektion dieser rohen Varianten. Nachweis von pathogenen Mutationen, wenn diese Mutationen erst entstehen (also mit niedrigen VAF) unbedingt zum Beispiel Frühförderung der Krankheit14,15zu informieren. In der Leukämie-Forschung, die Erkennung von minimal Residual Krankheit (residual leukämischen Zellen nach der Behandlung) informiert risikostratifizierung und Behandlungsmöglichkeiten in einer Art und Weise zu informieren, die binäre Fluss durchflusszytometrischen Bewertungen können nicht genutzt werden. Darüber hinaus gilt ECS zirkulierenden Tumor Nukleinsäure erkennen und bewerten metastasiertem Potenzial bei soliden Tumorpatienten durch die Bewertung für die Anwesenheit/Abwesenheit sowie die Variante Belastung durch bestimmte Mutationen, die Merkmale des primären Tumor-16.
Wie in Tabelle 1gezeigt hat, hängt die Macht der Verwendung Binomialverteilung-basierte Position-spezifischen Fehlermodell Varianten nennen die Anzahl der sequenzierten Bibliotheken sowie die Tiefe der Sequenzierung verwendet, um das Fehlermodell zu bauen. Die Robustheit des Modells Fehler steigt mit höheren Anzahl von Proben und Sequenzierung eingehender. Es wird empfohlen, mindestens 10 sequenzierte Proben mit einem Durchschnitt von Fehler-Korrektur lesen Sie Abdeckung von 3000 X pro Probe verwenden, um für jede Probe ein Fehler-Profil zu erstellen. Die Position-spezifischen Ansatz ist ähnlich wie MAGERI, sondern anstelle einer aggregierten Fehlerquote für alle sechs unterschiedliche Substitution (A > C/T > G, A > G/T > C, A > T/T > A, C > A/G > T, C > G/G > C C > T/G > A)13, modellieren wir jede Ersetzung unabhängig voneinander in jeder Position. Zum Beispiel eine Fehlerrate von C > T an einer bestimmten genomische Position unterscheidet sich von einer anderen Position. Unser Ansatz berücksichtigt auch eine Sequencing Batch Wirkung, wie die Basis Substitution Rate beobachtet in einem Sequenzierung Lauf laufen unterschiedlich sein könnte. Daher ist es wichtig, jede Position für alle Arten der Substitution zu modellieren, vor allem, wenn Proben aus verschiedenen Sequenzierung läuft für die Modellerstellung zusammengefasst sind.
Ein wichtiger Aspekt bei der Gestaltung ein ECS-Experiment ist der gewünschte Nachweisgrenze. Die Schönheit der NGS Studien ist, dass sie in Bezug auf die Gene/Ziele von Interesse, Nachweisgrenze (diktiert von der Tiefe der Sequenzierung) und Anzahl der Personen abgefragt leicht skaliert werden können. Zum Beispiel, wenn die Forscher interessiert, seltene Mutationen in zwei Amplifikate mit einer Nachweisgrenze von 0,0001 zu finden sind, können sie maximal 75 Proben in einem einzigen Sequenzierung mit MiSeq V2-Chemie, die bis zu 15 Millionen mal gelesen Ausgänge ausgeführt bündeln (2 Amplifikate * 10.000 Moleküle * 10 liest für Fehlerkorrektur * 75 Proben = 15 Millionen Sequenzierung liest). Forscher können die Anzahl der Moleküle ins Sequenzierung oder die Anzahl der gepoolten Proben in einer einzigen Sequenzierung ausgeführt, um die Nachweisgrenze anpassen variieren. In unseren Studien sollen wir Mutationen mit einer Nachweisgrenze von 0,0001 VAF (01:10, 000) mit dem Illumina-gen-Panel. Wir verwenden routinemäßig 250 ng DNA, um sicherzustellen, dass genügend Moleküle erfasst werden, zur Erreichung die oben genannten Nachweisgrenze zu starten. Forscher können um mit geringeren Menge an DNA zu beginnen (50 ng empfohlen) Wenn die gewünschte Nachweisgrenze liegt > 0,001 VAF.
Da die UMIs auf die i5-Indizes angehängt sind, verfügen über Sequenzierung Einstellungen entsprechend geändert werden. Zum Beispiel wir 16 N UMIs verwendet, und die Sequenzierung Einstellungen waren 2 x 144 gekoppelten Ende liest, 8 Zyklen der Index 1 und 16 Zyklen von Index 2 im Gegensatz zu den üblichen 8 Zyklen der Index 2. Der Index 2 Takt ist durch einen Rückgang der Gesamtzahl der Zyklen zugeteilt, der liest ausgeglichen. Wenn Forscher 12N UMIs10,17verwenden entscheiden, sollten die Einstellungen 12 Zyklen der Index 2 geändert werden.
Diese UMI-basierte Sequenzierung Methode ist optimiert, um für Sequenzierung Fehler zu korrigieren. Es bleibt suboptimale im Umgang mit PCR-Jackpotting, das ist ein Thema für alle Verstärkung basierende Methode. Wir Runden von Post-Sequenzierung und Post-Bioinformatik-Validierung mit DdPCR durchgeführt, und wir kaum erkennen Fehlalarme durch PCR Jackpotting. Dennoch empfiehlt es sich, dass Forscher die Experimente mit High Fidelity Polymerase um zu niedrige Verstärkung Fehler zu gewährleisten.

Wie wir Alter, Belastung durch Mutagene und stochastische Fehler während der Zellteilung führen zu die Ansammlung von somatischen Aberrationen in das Genom, und dies zugrunde liegt die grundlegende Pathogenese der malignen Transformation, Neuro-developmental Krankheiten, pädiatrische Störungen und normalem Altern1,2. Somatische Mutationen mit Krankheit fahren Potenzial sind wichtige diagnostische und prognostische Biomarker zur Früherkennung und Risiko Management3,4,5. Um physiologische Clonogenesis besser zu verstehen, ist die klinische informieren und Entscheidungen, die genaue Quantifizierung Charakterisierung dieser Mutationen und von vorrangiger Bedeutung. Next Generation Sequencing (NGS) wird derzeit zur klonale Mutationen in heterogenen DNA-Proben zu studieren; NGS ist jedoch begrenzt zur Identifizierung von Mutationen bei > 0,02 Variante Allel Bruchteil (VAF) – aufgrund der inhärenten Fehler-Rate von 0,5-2,0 % der Sequenzierung Plattformen6,7,8. Infolgedessen tracking diagnostisch und prognostisch bedeutende somatische Varianten am unteren VAF gelingt nicht mit standard NGS.
Vor kurzem wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die Fehlerquote von NGS8,9,10,11zu umgehen. Diese Methoden nutzen Molekulare Kennzeichnung, wodurch Fehlerkorrektur nach Sequenzierung. Jedes Molekül oder genomische Fragment in der Sequenzierung Bibliothek ist mit einer zufälligen einzigartige molekulare Bezeichner (UMI) markiert, die spezifisch für dieses Molekül ist. Die UMIs sind von Permutationen einer Reihe von randomisierten Nukleotiden (8 – 16 N) gebaut. Ein zweite Probe-spezifischen Barcode ist auch in den Workflow integriert, die es ermöglicht, Multiplexen mehrerer Proben in der gleichen NGS-Sequenzierung ausgeführt. PCR-Amplifikation erfolgt auf der Molekular tagged Bibliothek, und anschließend wird die Bibliothek für die Sequenzierung gesendet. Während der Vorbereitung der Bibliothek wird erwartet, dass Fehler nach dem Zufallsprinzip auf die genomische Fragment während der PCR-Amplifikation und Sequenzierung8eingeführt werden. Um zufällige Abfolge Fehler zu entfernen, sind rohe Sequenzierung liest nach UMI gruppiert. Artefakte aus Sequenzierung sollen nicht in alle Lesevorgänge mit der gleichen UMI an derselben genomische Position durch die stochastische Natur der Einführung, vorhanden sein, während eine wahre Variante wird originalgetreu verstärkt und sequenziert in alle Lesevorgänge, die die gleichen UMI teilen. Die Artefakte sind Bioinformatically entfernt. Hier beschreiben wir drei Methoden der Fehler korrigiert Sequenzierung (ECS) optimiert, im Labor für DNA, Einzel-Nukleotid-Varianten (SNVs) und kleinen einfügen-Löschungen (Indels) zu identifizieren, und RNA zur Quantifizierung der Genexpression unten erleichtern die NGS Fehlerschwellenwert.
Die erste Methode beschreibt eine Möglichkeit, somatische selten mit Gen spezifische Primer entwickelt von Forschern zu suchen. Vor der Bibliothek Vorbereitung sollten Forscher Primer an die Fragmente von Interesse gezielt gestalten. Wir haben die Web-app-Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Amplifikate von 200 – 250 bp sind ideal für Polymerase-Kettenreaktion (PCR), da diese werden sobald UMIs eingeflossen sind, erzeugen, überlappende gepaart Ende liest mit 150 bp gepaart Ende liest. Die optimale Grundierung Gestaltung Bedingungen verwendet werden: Grundierung Mindestgröße = 19; Optimale Grundierung Größe = 25; Maximale Grundierung Größe = 30; Minimale Tm = 64 ° C; Optimale Tm = 70 ° C; Maximale Tm = 74 ° C; Maximale Differenz Tm = 5 ° C; Minimale GC-Gehalt = 45; Maximale GC-Gehalt = 80; Anzahl zurück = 20; Maximal 3' Ende Stabilität = 100.
In Methode 2 beschreiben wir eine Methode kombiniert die ECS-DNA-Protokoll mit Illumina Chemie für klonale SNVs und so selten wie 0,0001 VAF mit handelsüblichen gen-Paneele, die Hunderte von Amplifikate enthalten kleine Indels vermessen. Wir haben die TruSight myeloische Sequenzierung Panel (Illumina) für unser Experiment verwendet und entwickelt eine erweiterte Gruppe um zusätzliche Gene von Interesse für pädiatrische myeloische Erkrankungen gehören. Diese Platten haben nicht eindeutige molekularen Kennungen (UMIs) angeboten, die Fehlerkorrektur, erleichtern würde, so dass wir unsere eigene Adapter Strategie diese Platten hinzugefügt haben. ECS sollte funktionieren ebenso gut mit allen anderen Panels entwickelt, um nach Genen verbunden mit verschiedenen Krankheiten zu bereichern. Nach DNA-Isolierung und anschließende Quantifizierung von Gewebe oder Probe von Interesse, es wird empfohlen, mindestens 500 ng des Bestandes DNA pro Probe. Wir machen regelmäßig eine einzelne Sequenzierung Bibliothek mit 250 ng DNA um flussabwärts als viel einzigartige genomische Fragment wie möglich erfassen liest Deduplizierung und VAF-Berechnung. Eine optionale replizieren Sequenzierung Bibliothek vorgenommen werden, mit dem restlichen 250 ng DNA. Wir machen immer zwei replizieren Bibliotheken pro Probe, und wir betrachten nur die Ereignisse, die unabhängig voneinander in beide Replikate als richtig positive Ergebnisse festgestellt. Wir implementierten auch eine genomische Position-spezifischen binomische Fehlermodell zur Erhöhung der Genauigkeit der Variante4,13aufrufen.
Schließlich beschreiben wir eine Methode, die Kopplung von ECS an RNA Sequenzierung für Transkript Quantifizierung mit handelsüblichen QIAseq gezielt RNA-Paneele (Qiagen). Die UMIs erforderlich für Deduplizierung können und Fehlerkorrektur in den Kits aufgenommen wurden, und Forscher Bibliotheken nach Empfehlungen des Herstellers. Bioinformatically, können Forscher folgen die Pipeline für ECS-DNA, die im Detail im Abschnitt Protokoll erklärt werden skizziert.

<table><tbody><tr><td>Q5 High Fidelity Hot Start Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Custom Amplicon Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td></td></tr><tr><td>UMI i5 adapter sequences</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7442S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Ligation Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7595S</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864005</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Digital PCR System</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well Plates</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>TruSight Myeloid Sequencing Panel</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1010</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie 2</td><td>Johns Hopkins University</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Customized QIAseq Targeted RNA Panel</td><td>Qiagen</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Plus Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr></tbody></table>

rare event detection using error-corrected dna and rna sequencing

Techniken der konventionellen Next Generation Sequencing (NGS) haben immense genomische Charakterisierung für mehr als zehn Jahren ermöglicht. Insbesondere wurde NGS verwendet, das Spektrum der klonalen Mutationen in Bösartigkeit zu analysieren. Obwohl wesentlich effizienter als herkömmliche Sanger, NGS Kämpfe mit der Identifizierung von seltenen klonaler und subclonal Mutationen aufgrund seiner hohen Fehlerquote von ~0.5–2.0 %. So standard NGS hat ein Limit von Erkennung für Mutationen, die > 0,02 Variante Allel Bruchteil (VAF). Während die klinische Signifikanz für Mutationen dieser selten bei Patienten ohne bekannte Krankheit unklar für Leukämie behandelte Patienten haben sich deutlich verbessert Ergebnisse wenn Resterkrankung ist < 0,0001 durch Durchflusszytometrie. Um diese artifizielle Hintergrund der NGS zu mildern, wurden zahlreiche Methoden entwickelt. Hier beschreiben wir eine Methode für Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung (ECS), die Kennzeichnung einzelner Moleküle mit einem 16 bp zufällige Index für Fehlerkorrektur und 8 bp patientenspezifische Index für multiplexing beinhaltet. Unsere Methode erkennt und klonale Mutationen bei Variante Allel Brüche (VAFs) zwei Größenordnungen niedriger als die Nachweisgrenze von NGS und so selten wie 0,0001 VAF zu verfolgen.

Mit Targeted Error-Corrected für die DNA-Sequenzierung haben wir einen Nachweis der Prinzip Experiment verdünnen mutierten Patienten DNA in kommerziellen genomischer DNA durchgeführt. Der Patient hatte eine Mutation im GATA1 (ChrX:48650264, C > G) mit original VAF von 0,19. In Abbildung 1 zeigen wir, dass ECS quantitative auf ein Niveau von 1: 10.000 für Einzel-Nukleotid-Variante ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> Abbildung 1: Verdünnungsreihen GATA1 SNV nachzuweisen, dass ECS quantitative auf das Niveau von 1: 10.000 ist. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Wir zeigen auch, dass die ECS-DNA zuverlässig seltene klonale Mutationen in Genen wiederkehrend in Erwachsenen akute myeloische Leukämie (AML) bei gesunden älteren Personen4 erkennt. Wir erhalten buffy Coat Proben von 20 gesunde Individuen in der Nurse Health Study überhöht etwa ~ 10 Jahre auseinander. An diesen Proben haben wir das ECS-DNA-Panel-Protokoll angewendet. Für dieses Experiment wir die Illumina TruSight myeloische Sequenzierung Panel, das besteht aus 568 Amplifikate (Weitere Informationen auf Gen-Liste auf https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html) angepasst und sequenziert 80 Bibliotheken ab 20 Personen (2 Sammlungen zu verschiedenen Zeitpunkten, 2 Wiederholungen pro Person pro Zeit Punkt) mit Illumina NextSeq Plattform, die einen Durchschnitt von 47,7 Millionen gepaart Ende liest und einen Durchschnitt von 3,4 Millionen Fehler korrigiert generiert Konsensus-Sequenzen pro Bibliothek4. Die mittlere Nukleotid-Abdeckung pro Bibliothek war etwa 6.000 x (3,4 Millionen geteilt durch 568). Für jede Probe errichteten wir ein Position-spezifische Fehler Profil sequenzierte Bibliotheken, die nicht aus derselben Probe verwenden. Wir fanden 109 klonale somatische Mutationen, die in beiden Wiederholungen mindestens eine Sammelstelle Zeit vorhanden waren. Diese Mutationen haben VAF von 0,0003 – 0.1451. Wir wählten 21 Mutationen mit bekannten kosmischen Darstellungen und überprüft alle 21 Mutationen in ein oder zwei Sammlung Zeit Punkt(e) mit DdPCR (n = 34, Abbildung 2, adaptiert von jungen Et Al. 20164).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> Abbildung 2: Mutationen von ECS identifiziert wurden über DdPCR mit höchst konkordante VAFs verifiziert. (n = 34, modifiziert von jung Et Al. 20164). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
In Bezug auf Fehler korrigiert Ausdruck mit ECS-RNA-Protokoll wir ein Gen Panel mit QIAseq-Chemie, die besteht aus 416 Gene bekannt, verbunden mit verschiedenen Krebsarten (adaptiert von QIAseq menschlichen Krebs Transkriptom-Panel), und wir werden angepasst die am häufigsten geäußerten Exon eines bestimmten Gens (Gen Liste in ergänzenden Material 1) verstärkt. Wir sequenziert die Bibliotheken mit Illumina MiSeq Plattform in gepaart-End-Format, die durchschnittlich 8,3 Millionen Lesevorgänge pro Bibliothek gegeben hat, und uns gelungen, einen Durchschnitt von 0,417 Millionen Fehler korrigiert Konsensus-Sequenzen einzufangen. Wir zeigten, dass die Expression von niedrigen Fülle Transkript (< 1.000 Transkript Graf in 50 ng von Gesamt-RNS) ist sehr reproduzierbar auf Wiederholungen (Datenpunkt n = 300, Abbildung 3). Validierung von DdPCR (sechs ausgewählter Gene von unterschiedlichem Ausmaß des Ausdrucks) gezeigt, dass die Expression von Genen durch das ECS-Protokoll ohne die Notwendigkeit einer Normalisierung korrekt eingenommen worden war.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> Abbildung 3: Top, Korrelation der Mitschrift zählt von ECS-RNA auf Wiederholungen der gleichen Probe (n = 300). Unten, Abschrift, die Grafen von ECS identifiziert wurden durch DdPCR überprüft (n = 6). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Next Generation Sequencing (NGS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die genomische Charakterisierung, die durch die hohe Fehlerquote der Plattform (~0.5–2.0%) begrenzt ist. Wir beschreiben unsere Methoden zur Sequenzierung Fehler korrigiert, mit denen wir umgehen die NGS Fehlerquote und erkennen Mutationen bei Variante Allel Brüche so selten wie 0,0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

rare-event-detection-using-error-corrected-dna-and-rna-sequencing

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

11.9K Aufrufe.  Washington University School of Medicine. Next Generation Sequencing (NGS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die genomische Charakterisierung, die durch die hohe Fehlerquote der Plattform (~0.5–2.0%) begrenzt ist. Wir beschreiben unsere Methoden zur Sequenzierung Fehler korrigiert, mit denen wir umgehen die NGS Fehlerquote und erkennen Mutationen bei Variante Allel Brüche so selten wie 0,0001.

Serie: Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging resistance mutations during therapy, or when patients have few circulating tumor cells. Wild-type blocking PCR followed by sequencing analysis offers high sensitivity, flexibility, and simplicity as a methodology for detecting these low frequency mutations. By adding a custom designed locked nucleic acid oligonucleotide to a new or previously established conventional PCR based sequencing assay, sensitivities of approximately 1 mutant allele in a background of 1,000 WT alleles can be achieved (1:1,000). Sequencing artifacts associated with deamination events commonly found in formalin fixed paraffin embedded tissues can be partially remedied by the use of uracil DNA glycosylase during extraction steps. The optimized protocol here is specific for detecting MYD88 mutation, but can serve as a template to design any WTB-PCR assay. Advantages of the WTB-PCR assay over other commonly utilized assays for the detection of low frequency mutations including allele specific PCR and real-time quantitative PCR include fewer occurrences of false positives, greater flexibility and ease of implementation, and the ability to detect both known and unknown mutations.

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Forschung

Genetik

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

Bewertung der Kontamination der DNA in RNA-Proben anhand der ribosomalen DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

Nachweis von seltenen Mutationen im CtDNA mit Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Krebsforschung

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Naked-Eye Detection of Rare Point Mutations in DNA

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen application of the method is the identification of rare mutations in circulating cell-free DNA from liquid biopsies, with a relevance in cancer diagnostics and stratification of oncological patients for personalized therapy. As a proof of concept, the test has been designed to detect the BRAFV600E mutation in the BRAF gene, which is important to identify the sub-group of melanoma patients that can benefit from targeted therapies with BRAF inhibitors. However, this colorimetric test can be easily generalized to other somatic mutations of clinical relevance due to the use of universal detection probes, thus providing strong potential in oncological diagnostics.
The test detects 0.5% of BRAFV600E in an excess of BRAFWT DNA, which matches the sensitivity of some commercial instrumental assays. Such sensitivity is clinically relevant for diagnostic purposes, allowing the early identification of drug-sensitive patients. In contrast to commercial assays based on real-time PCR, this test requires minimal instrumentation and processing, as it can be performed on DNA amplified with a standard PCR (or isothermal techniques) and provides a naked-eye readout with a one-tube reaction of a few steps in only one hour. At present, the test has been used only on synthetic DNA samples. However, the latter have been designed to mimic a real sample amplified from circulating cell-free DNA, to favor the translation of the test to clinical diagnostics.

This protocol permits the naked-eye identification of point mutated DNA in a 200-fold excess of wild type DNA molecules, by exploiting gold nanoparticles and paramagnetic microparticles.

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen ...

Biochemie

<meta charset="utf8"></head><body>Optimierung des niederfrequenten Mutationsnachweises mit Wildtyp-Blocking-PCR

Wild-type Blocking PCR Combined with Sanger Sequencing for Detection of Low-frequency Somatic Mutation

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting for drug resistance mutations and circulating tumor cell mutations during therapy. Traditional Sanger sequencing has 5%-20% wild-type mutation detection, so its limit of detection cannot meet the corresponding requirements. The wild-type blocking technologies that have been reported to overcome this include blocker displacement amplification (BDA), non-extendable locked nucleic acid (LNA), hot-spot-specific probes (HSSP), etc. These technologies use specific oligonucleotide sequences to block wild-type or recognize wild-type and then combine this with other methods to prevent wild-type amplification and amplify mutant amplification, leading to characteristics like high sensitivity, flexibility, and convenience. This protocol uses BDA, a wild-type blocking PCR combined with Sanger sequencing, to optimize the detection of RHOA G17V low-frequency somatic mutations, and the detection sensitivity can reach 0.5%, which can provide a basis for MRD monitoring of angioimmunoblastic T-cell lymphoma.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Förderung der Erkennung niederfrequenter Mutationen in Krebsgeweben

This article introduces the application of a low-frequency detection method based on Sanger sequencing in angioimmunoblastic lymphoma. Provide a basis for applying this method to other diseases.

Wildtyp-Blocking-PCR in Kombination mit Sanger-Sequenzierung zum Nachweis niederfrequenter somatischer Mutationen

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

Nachweis seltener Varianten von Genomic Pooled-Sequenzierung mit SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

Bewertung der Kontamination der DNA in RNA-Proben anhand der ribosomalen DNA

Nachweis von seltenen Mutationen im CtDNA mit Next Generation Sequencing

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Naked-Eye Detection of Rare Point Mutations in DNA

Wildtyp-Blocking-PCR in Kombination mit Sanger-Sequenzierung zum Nachweis niederfrequenter somatischer Mutationen

Wildtyp-Blocking-PCR in Kombination mit Sanger-Sequenzierung zum Nachweis niederfrequenter somatischer Mutationen

Wildtyp-Blocking-PCR in Kombination mit Sanger-Sequenzierung zum Nachweis niederfrequenter somatischer Mutationen

Nachweis seltener Varianten von Genomic Pooled-Sequenzierung mit SPLINTER