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Tumor Proben und Blutproben wurden nach einem Protokoll genehmigt durch das Ethik Komitee der Peking Universität Menschen erhalten &#39; s Krankenhaus. Schriftliche Einwilligungserklärung wurden die Patienten mit ihren Proben entnommen. Die Teilnehmer wurden nach folgenden Kriterien überprüft: Weiblich, erweiterte Non-Small Cell Lung Cancer, EGFR p.L858R Mutation durch vorherige Sanger-Sequenzierung, Fortschreiten der Erkrankung nach zwei Sitzung des EGFR zielgerichtete Therapie mit Erlotinib, und ER-Seq, die angewendet wurde, um CtDNA die Ursache des Widerstands zu analysieren und finden neue Ziel Medikamente.
 1. DNA-Extraktion aus dem peripheren Blut für Blut und genomischer DNA (gDNA) <ol><li>sammeln 10 mL des peripheren Blutes in einem Sammelrohr, invertieren sanft auf und ab 6 - 8 Mal zu mischen. Vermeiden Sie Zelle zu scheren. Blutproben können bis zu 72 Stunden in dem Sammelrohr bei 6-37 ° C gelagert werden.</li>
	<li>Zentrifugieren dem Sammelrohr bei Raumtemperatur für 10 min bei 1600 (±150) x g.</li>
	<li>Übertragung den überstand (Plasma) aus dem Sammelrohr bis vier saubere 2 mL entsprechend gekennzeichnet Zentrifuge Röhrchen mit einem Einweg-Pipettieren ohne zu stören die Pellet-Schicht (weiße Blutkörperchen).</li>
	<li>Transfer1 mL der Zellen mit einer sauberen Einweg Pipettieren bis 2 mL entsprechend gekennzeichnet Zentrifugenröhrchen. Die Zellen können gespeicherte bei-20 ° C oder kälter vor Schritt 1,8 werden.</li>
	<li>Zentrifugieren des Plasmas (aus Schritt 1.3) für 10 min bei 4 ° C und 16000 (±150) x g.</li>
	<li>Übertragen das Plasma zur Reinigung der Zentrifuge Rohre richtig gekennzeichnet als &#34; Plasma &#34;, ~0.1 mL Restvolumen an der Unterseite zur Vermeidung von Kontaminationen zu verlassen. Speichern Sie das Plasma bei-80 ° C bis Schritt 1.7.</li>
	<li>3 mL Plasma aus Schritt 1.6 verwenden, um Blut zu isolieren (enthält CtDNA) mit einem kommerziell erhältlichen Kit, Anschluss an die Hersteller &#39; s Anweisungen.</li>
	<li>Einsatz 200 µL der weißen Blutkörperchen aus Schritt 1.3 gDNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit, Anschluss an die Hersteller zu isolieren &#39; Anweisungen s. 
	Hinweis: Beide Blut und gDNA können bei-20 ° C vor dem Gebrauch gespeichert werden.</li>
	<li>Gelten verschiedene Qualitätskontrollen für Blut und gDNA (Tabelle 2). Führen Sie Qualitätskontrolle durch ein standardisiertes Verfahren zur Bioanalyzer Probe Abbau und/oder gDNA Kontamination zu bestimmen. Peak-Analyse der Qualität der Blut-Extraktion sollte angezeigt werden, ähnlich wie Abbildung 1. 
	Hinweis: Die Maximalgröße von Blut ist etwa 170 BP. beachten Sie, dass die Erhöhung der Menge an DNA in einer höheren Qualität-Bibliothek für die effektive Erkennung von seltenen Mutationen im Blut führt. Wir empfehlen die Verwendung von mindestens 30 ng Blut (30.000 Exemplare).</li>
</ol> 2. Vorbereitung der Bibliothek Hinweis: betreffend Basisbibliothek Konstruktion auf fragmentierte DNA, Blut existiert in Fragmente mit einer Spitze Größe ~ 170 bp und müssen somit nicht fragmentiert werden.
<ol><li>Fragment des Steuerelements Probe (gDNA) durch Ultraschallbehandlung, 200-250 bp Fragmente zu erhalten.
	<ol><li>Bereiten 1 µg gDNA Samples in 100 µL Tris-EDTA Puffer in einem Rohr sauber Sonorisierung.</li>
		<li>Stellen die Beschallung-Programm als 30 s ein und 30 s aus 12 Zyklen für eine Gesamtmenge von 12 min.</li>
		<li>Nach Beschallung, bestätigen das Produkt (5 µL) enthält 200-250 bp Fragmente durch eine Laufanalyse mit 2 % Agarosegel.</li>
		<li>Alle Fragmentierung Produkte auf eine neue 1,5 mL Tube übertragen und inkubieren Sie mit 150 µL des magnetischen Beads für 5 min die richtige Fragmente auswählen.</li>
		<li>Den Überstand zu entfernen, indem Sie das Rohr auf einem magnetischen Rack für 30 s.</li>
		<li>Waschen die Perlen mit 200 µL von 80 % Ethanol (frisch zubereitet) mit dem Rohr auf das magnetische Gitter bleiben. Inkubieren Sie für 30 s vor dem Entfernen des Überstands. Einmal zu wiederholen.</li>
		<li>Luft trocknen die Perlen mit dem Rohr Deckel geöffnet während Ihres Aufenthalts auf der magnetischen Zahnstange. Vermeiden Sie pulverisieren Perlen um sicherzustellen, dass die DNA Ziel gut erholt. DNA-Fragmente aus den Perlen indem 32 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8) zu den Perlen, die DNA-Fragmente gefolgt durch Quantifizierung von UV/Vis Spektroskopie zu lösen eluieren. 
		Hinweis: mindestens 200 ng ist für die folgenden Experimente erforderlich.</li>
	</ol></li> <li>Ende Prep Reaktion Hinweis: Folgen Sie Hersteller &#39; s Anleitung und nach Bedarf ändern. Einsatz 30 ng von Blut; und 1 µg gDNA als Kontrolle.
	<ol><li>Hinzufügen 7 µL Reaktion Puffer, 3 µL Enzym-Mix, 30 ng von Blut in ein steriles Röhrchen Nuklease-frei, und Gesamtvolumen von 60 µL DdH 2 O hinzufügen. In einem separaten Rohr, die oben genannten Komponenten hinzuzufügen, aber mit 1 µg gDNA statt Blut.</li>
		<li>Mix und inkubieren Sie die Mischung bei 20 ° C für 30 min, gefolgt von 65 ° C für 30 min in einem Thermocycler ohne Deckel erhitzt. Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
	</ol></li> <li>Adapter Ligation <ol><li>hinzufügen 30 µL der Ligatur-master-Mix, 1 µL der Ligatur-Enhancer und 4 µL der einzigartigen Sequenzierung Adapter auf die Mischung aus Schritt 2.2.</li>
		<li>Inkubation bei 20 ° C für 15 min in einem Thermocycler ohne Deckel erhitzt.</li>
		<li>Vortex Aufschwemmen der magnetischen Beads und lassen die Perlen bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten vor dem nächsten Schritt fort.</li>
		<li>87 µL der resuspendierte magnetische Beads zu der zuvor erwähnten Mischung; mischen gut durch Pipettieren rauf und runter und dann bei Raumtemperatur 5 min inkubieren</li>
		<li>Waschen und lufttrocknen die Perlen wie unter Schritt 2.1.</li>
		<li>Das Ziel der DNA aus den Perlen durch Zugabe von 20 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8) eluieren.</li>
	</ol></li> <li>Anreicherung von DNA-Fragmenten mit Adapter ligiert <ol><li>fügen Sie 20 µL Adapter ligiert DNA-Fragmente, 5 µL der Index Primer/i7 (2,5 µL Primer-P7 (22:00) und 2,5 µL Primer-P5 (22:00), Sequenzierung Zwecken), 25µL von Bibliothek-Verstärkung-master-Mix und DdH 2 O auf ein Gesamtvolumen von 50 µL.</li>
		<li>PCR verstärken die Adapter ligiert DNA und thermischen Zyklus wie folgt: erste Denaturierung bei 98 ° C für 45 s, gefolgt von 8 Zyklen (Blut) oder 4 Zyklen (gDNA) des Glühens ° C für 15 s, 65 ° C für 30 s, 72 ° C für 30 s) , und eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 60 s, dann hält die Temperatur um 4 ° c</li>
		<li>Hinzufügen 45 µL des schwebenden magnetischen Beads an die PCR-angereicherten DNA erworbenen Fragmente erhalten.</li>
		<li>Eluieren DNA-Fragmente mit Adaptern in 30 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8).</li>
	</ol></li> <li>Bibliothek Qualitätskontrolle <ol><li>folgen den Hersteller &#39; s-Protokoll für das kommerzielle Kit Adapter messen ligiert DNA-Konzentration. Verwenden Sie die Bioanalyzer zur Bestimmung der DNA-Qualität.</li>
	</ol></li></ol> 3. Gezielte DNA-Erfassung Hinweis: Target Anreicherung erfolgte mittels eine benutzerdefinierte Sequenz Capture-Sonde, die speziell für eine 1021 kb Bereicherung Zielregion für bekannte Tumor-assoziierten Treiber Mutationen von 12 verschiedene Arten von Tumoren. Änderungen an den Hersteller &#39; s-Protokoll werden in den folgenden Schritten beschrieben.
<ol><li><ol><li>Add 1,5 µg Blockierung des Poolings Bibliotheken (maximale Anzahl von Bibliotheken zum Pool für Blut ist 6, gDNA ist 20) aus Schritt 2, 8 µL P5 Block(100P), 8 µL P7 Block(100P) und 5 µL Kinderbett-1 DNA (1 µg/µL) in ein steriles Röhrchen. Trocknen Sie den Inhalt des Rohres mit einem Vakuum Konzentrator auf 60 festgelegt ° C.</li>
	</ol></li> <li>Hybridize, die die DNA-Erfassung-mit der Bibliothek Sonden.
	<li>Fügen Sie die folgenden Komponenten, um den Schlauch vom Schritt 3.1: 8.5 µL 2 X Hybridisierung Puffer, 2,7 µL Hybridisierung Enhancer und 1,8 µL Nuklease-freie DdH 2 O.</li> <ol>
		<li>Mix von oben und unten pipettieren und brüten in einem Thermomixer bei 95 ° C für 10 min.</li>
		<li>Nach Inkubation, sofort hinzufügen 4 µL des Custom-Probe. Inkubieren Sie Proben in einem Thermocycler bei 65 & #176; C mit Deckel erhitzt auf 75 ° C für 4 Std.</li>
	</ol></li> <li>DNA Fragmente Aufnahme <ol><li>inkubieren das hybridisierte Ziel DNA mit Streptavidin-Perlen, gefolgt vom Waschen der Perlen um ungebundene DNA zu entfernen. Verwenden Sie das kommerzielle Kit laut Hersteller &#39; s Anweisungen, um eine endgültige 20 µL resuspendierte Perlen mit aufgenommenen DNA Fragmente.</li>
	</ol></li> <li>Verstärkung der erfassten DNA Fragmente <ol><li>führen Sie PCR unter Verwendung der kommerziellen kit mit 2 µM Rückgrat Oligonukleotide, laut Hersteller &#39; s Anweisungen.</li>
		<li>Wenn der PCR-Reaktion abgeschlossen, 45 µL des suspendierten Perlen das PCR-Produkt direkt hinzufügen und bereichern die verstärkte Ziel DNA-Fragmente durch Elution mit 30 µL 10 mm Tris-HCl (pH 8) an die Perlen gebunden.</li>
	</ol></li> <li>Quantifizieren die DNA-Fragmente mit der Bibliothek Quantifizierung Kit und bestimmen Sie die durchschnittliche Fragmentlänge von Bioanalyzer ( Abbildung 2).</li></ol>
 4. Sequenzierung <ol><li>Sequenz gemultiplext Bibliotheken mit 75 bp gepaart-End läuft auf einem Benchtop-Sequenzer für 18 h. Gesamtdaten produziert bis zu 60 Gigabyte, 15 G wird für Patientenprobe Blut und 1G für Kontrolle Probe gDNA.</li></ol>
 5. Daten-Analyse-Workflows Hinweis: Abbildung 3 zeigt die allgemeine Arbeit Informationsfluss und Analyseprozess. Daten-Analyse-Parameter und Befehle sind unten aufgeführt.
<ol><li>Filter minderwertige liest und korrigiert Fehler und Maskierung der UID mit NCfilter. 
	NCfilter(own) NCfilter filter - Q 0,5 -l 5 - 0,1 n -T 3 - G -1 fastq1-2 fastq2 realSeq(own) Python bin/RealRealSeq fq1 MaskUID-1-2 fq2 -o Ausgang Dir -p Präfix -u 4 -s 7 - m 3 -i UidFile-f.</li>
	<li>Genom hg19 Referencing (menschliche Genom 19), suchen Sie die Sequenzierung Ergebnisse über die BWA (Version 0.7.12-r1039) Mem und ausrichten mit Genome Analysis Toolkit (GATK) (Version 3.4-46-gbc02625). 
	BWA Mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2 Java-d64-Server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g - Djava.io.tmpdir=/tmp/-Jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L TargetRegion-Dbsnp bekannt &#8212; 
	AllowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - Ich CancerBam-ich NormalBam Java-d64-Server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g &#8212; Djava.io.tmpdir=/tmp/-Jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-bekannt Dbsnp - AllowPotentiallyMisencodedQuals &#8212; TargetIntervals Abständen-ich CancerBam-ich NormalBam</li>
	<li>Cluster die Duplikate nach der UID und Position der Vorlage-Fragmente, die den Fehler zu korrigieren, Grundlagen von PCR/Sequenzierung eingeführt und ändern die Basis Qualität. 
	realSeq(own) Python RealSeq/bin/RealSeq CLUSTER -b unmarkdup_sort_merge.bam - R ChipRegion -o Output_dir -p Präfix -m 6</li> <li>neu ausrichten die gruppierten Duplikate von BWA-mem. 
	BWA Mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2</li> <li>führen Sie eine lokale Neuausrichtung gefolgt von eine Rekalibrierung der Basis Qualitätsfaktor mithilfe GATK (Version 3.4-46-gbc02625). 
	Gesundheitsamt Neuausrichtung: Java-d64-Server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g--Djava.io.tmpdir=/tmp/-Jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L TargetRegion-bekannt Dbsnp - AllowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 -Ich CancerBam-ich NormalBam Java-d64-Server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g--Djava.io.tmpdir=/tmp/-Jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-bekannt Dbsnp - AllowPotentiallyMisencodedQuals - TargetIntervals Intervalle-ich CancerBam-ich NormalBam Basis-Qualitätsfaktor Rekalibrierung: Java-d64-Server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - Jar GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R hg19 -L TargetRegion - KnownSites Dbsnp - KnownSites kosmische - AllowPotentiallyMisencodedQuals - Nct 10 - Ich Bam -o GFK Java-d64-Server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g--Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads-ich Bam - BQSR GFK -o Outbam -R hg19 - Nct 8 - AllowPotentiallyMisencodedQuals</li> <li>zum SNV (Einzel-Nukleotid-Variante) und INDEL (kleine Einfügungen oder Löschungen) telefonieren, die Genauigkeit der Niederfrequenz-Mutationen wird bestätigt durch die GSR (gute Unterstützung liest) mit beiden vorwärts und rückwärts Strang lesen Paare und Filtration durch Kontrollgruppe (Keimbahn-Mutationen) und Grunddatenbank. 
	realDcaller(own) Python RealDcaller -f hg19 - R ChipRegion - C BaselineDB - O -L 2 CancerBam NormalBam -p 30</li> <li>Grundlinie Proben als ein Steuerelement für CNV (Kopie Nummer Variation) Berufung verwenden. 
	NCcnv(own) Python NCcnv -o Cnvdir -t Tmpdir - R ChipRegion Cnv--Normgt NormalBam--Tumgt CancerBam--Repdb RepeatMarsk</li> <li>Realigned unzugeordnet, Clips und diskordanten paar liest SV (strukturellen Variationen) anrufen. 
	NCsv(own) NCsv -t Tmpdir - R hg19 -o Outputdir Python - X Transkript -w Bwapath -n 4 NormalBam CancerBam</li></ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Existenz zirkulierender Tumor-DNA (CtDNA) wurde vor mehr als 30 Jahren entdeckt, aber die Anwendung von CtDNA Analysen noch nicht routinemäßig in der klinischen Praxis ist. Interesse an der praktischen Anwendung von CtDNA Methoden hat mit der Entwicklung von Technologien zur CtDNA Erkennung und Analyse erhöht. Tumor-Überwachung mit CtDNA bietet einen minimal-invasive Ansatz für die Bewertung der mikroskopischen Resterkrankung, Reaktion auf Therapie und molekulare Tumor-Profile unter dem Hintergrund der Tumor Evo...

Next Generation Sequencing (NGS), ein leistungsfähiges Werkzeug zu untersuchen, die Geheimnisse des Genoms, bieten eine große Menge an Informationen, die genetische Veränderungen offenbaren kann. Die Anwendung der NGS-Analyse in der Klinik ist immer häufiger, vor allem für die personalisierte Medizin geworden. Eines der größten Einschränkungen der NGS, ist jedoch eine hohe Fehlerquote. Obwohl es für Studium vererbte Mutationen geeignet erachtet wird, ist die Analyse von seltenen Mutationen stark eingeschränkt1,2, vor allem bei der Analyse von DNA aus einer "Flüssigbiopsie" gewonnen.
Tumor im Umlauf ist DNA (CtDNA) zellfreie DNA (Blut) in das Blut, das von Tumorzellen vergossen wird. In den meisten Fällen ist die Menge der CtDNA äußerst gering, die die Erkennung und Analyse sehr anspruchsvoll. CtDNA hat jedoch viele attraktive Features: seine Isolation ist minimal invasiv, kann in den frühen Stadien des Tumorwachstums erkannt werden, die CtDNA Ebene reflektiert therapeutische Effizienz und CtDNA enthält DNA-Mutationen in primären und metastatischen Läsionen gefunden 3 , 4 , 5. daher angesichts die rasante Entwicklung der NGS-Technik und Analyse, die Anwendung der CtDNA-Erkennung ist attraktiver geworden.
Haben verschiedene massiv parallelen Sequenzierung Ansätze zur CtDNA Erkennung verwendet worden, aber keiner dieser Ansätze für den routinemäßigen Einsatz in Kliniken aufgrund ihrer Einschränkungen angenommen worden: niedrige Empfindlichkeit, Mangel an Vielseitigkeit und einen relativ hohen Preis6 ,7,8. Zum Beispiel korrigiert duplex Sequenzierung, basierend auf einem eindeutigen Bezeichner-Tag (UID), immer wieder Fehler in der Konsens bidirektional, die meisten Sequenzierung Fehler beheben. Die Machbarkeit dieser Methode ist jedoch aufgrund der hohen Kosten und geringe Auslastung9,10verloren. Ebenso haben CAPP-Seq und seine verbesserte Iteration, CAPP-IDES11,12, größeren Praktikabilität im Blut erkennen, obwohl die Genauigkeit und die Universalität dieser Methoden verbessert werden.
Um den aktuellen Bedarf für genaue CtDNA Detektion und Analyse, entwickelten wir eine neue Strategie, bereichern seltene Mutation Sequenzierung (ER-Seq). Dieser Ansatz verbindet die folgenden: einzigartige Sequenzierung Adapter effizient wiederherstellen CtDNA Moleküle mit bidirektionalen Fehlerkorrektur und die Fähigkeit, eine einzige Mutation von unterscheiden &#62; 1 × 107 Wildtyp Nukleotide; 1021 kb-Sonden, die Messung der Zielregionen zu bereichern, die decken mehr als 95 % der Tumor im Zusammenhang mit Mutationen von 12 Tumoren, einschließlich Lungenkrebs, Darmkrebs, Magenkrebs, Brustkrebs, Nierenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Leberkrebs, Schilddrüsen-Krebs, Gebärmutterhalskrebs, Speiseröhrenkrebs und Endometrium-Karzinom (Tabelle 1); und Grunddatenbank screening machen, effizient und einfach zu seltene Mutationen im CtDNA genau zu erkennen.
Um eine Baseline-Datenbank zu erstellen, finden Sie alle Gen-Mutationen durch ER-Seq aus einer Reihe von der gleichen Art von Proben (~ 1000 am Anfang). Diese echte Mutationen ist durch mehrere andere zuverlässige Nachweismethoden und Analyse nachzuweisen. Als nächstes zusammenfassen, das Muster der falschen Mutationen und cluster-die falsche Mutationen um die erste Grundlinie-Datenbank zu erstellen. Weitere falsche Mutationen gefunden von nachfolgenden Sequenzierung Experimente zu dieser Datenbank hinzufügen. Daher wird diese Grunddatenbank dynamische erweiterte Datenbank, die Sequenzierung Genauigkeit deutlich verbessert.
Um Fortschritte bei der Tumor-Diagnose und Überwachung zu fördern, präsentieren wir ER-Seq, eine kostengünstige und praktikable Methode für den Erwerb von allgemeinen Daten. Wir präsentieren eine Fallstudie, die ER-Seq Analyse unterzog sich demonstriert seine Genauigkeit zum Nachweis von seltenen Mutationen und Machbarkeit für den Einsatz in der Klinik.

<table><tbody><tr><td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51105</td><td>DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>Measure cfDNA concentration</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA BR Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td>Measure library concentration</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 Reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>Measure cfDNA and library fragments</td></tr><tr><td>The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645L</td><td>Library Preparation</td></tr><tr><td>Agencourt SPRIselect Reagent</td><td>Beckman</td><td>B23317</td><td>DNA fragment screening and purification</td></tr><tr><td>Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML</td><td>Sigma</td><td>93283</td><td>Dissolution</td></tr><tr><td>xGen Lockdown Probes</td><td>IDT</td><td>&amp;mdash;&amp;mdash;</td><td>xGen Custom Probe</td></tr><tr><td>Human Cot-1 DNA</td><td>Life</td><td>15279-011</td><td>Targeted DNA capture</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td><td>Life</td><td>65305</td><td>Targeted DNA capture</td></tr><tr><td>xGen Lockdown Reagents</td><td>IDT</td><td>1072281</td><td>Targeted DNA capture</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>KAPA</td><td>KK2602</td><td>post-capture PCR enrichment libraries</td></tr><tr><td>KAPA Library Quantification Kit</td><td>KAPA</td><td>KK4602</td><td>Measure library concentration</td></tr><tr><td>NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles)</td><td>illumina</td><td>FC-404-2002</td><td>Sequence</td></tr><tr><td>Centrifuge5810</td><td>eppendorf</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop8000</td><td>Thermo Scientific</td><td>8000</td><td>Measure gDNA concentration</td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Quantify</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>eppendorf</td><td></td><td>Incubation</td></tr><tr><td>16-tube DynaMagTM-2 Magnet</td><td>Life</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Concentrator plus</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>AB</td><td>simplyamp</td><td></td></tr><tr><td>QPCR</td><td>AB</td><td>7500Dx</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500</td><td>illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection of rare mutations in ctdna using next generation sequencing

Die Analyse der zirkulierenden Tumor-DNA (CtDNA) mit Next Generation Sequencing (NGS) ist ein wertvolles Werkzeug für die Entwicklung der klinischen Onkologie geworden. Die Anwendung dieser Methode ist jedoch schwierig wegen seiner niedrigen Empfindlichkeit bei der Analyse der Spur Menge an CtDNA im Blut. Darüber hinaus kann die Methode falsch-positive und negative Ergebnisse aus dieser Sequenzierung und die anschließende Analyse generieren. Um die Machbarkeit und Zuverlässigkeit der CtDNA-Erkennung in der Klinik zu verbessern, stellen wir hier eine Technik, die seltene Mutationen für die Sequenzierung, bereichern seltene Mutation Sequenzierung (ER-Seq) bereichert. ER-Seq unterscheiden eine einzige Mutation aus 1 x 107 Wildtyp Nukleotide, wodurch es ein viel versprechendes Instrument, extrem niedrigen Frequenzen genetische Veränderungen zu erkennen und somit an einem Studium von Krankheit Heterogenicity sehr nützlich sein wird. Aufgrund der einzigartigen Sequenzierung Adapter Ligation ermöglicht diese Methode eine effiziente Rückgewinnung von CtDNA Molekülen, während zur gleichen Zeit Korrektur für Fehler bidirektional (Sense und Antisense). Unsere Auswahl an 1021 kb Sonden bereichert die Messung der Zielregionen, die decken mehr als 95 % der Tumor-bezogene Fahrer Mutationen in 12 Tumoren. Diese kostengünstige und universelle Methode ermöglicht eine einzigartig erfolgreiche Anhäufung von genetischen Daten. Nach effizient Herausfiltern von Hintergrund-Fehler, kann ER-Seq seltene Mutationen genau erkennen. Mit einer Fallstudie, präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zeigen Sonde Design, Bibliotheksbau und Ziel DNA-Aufnahme Methoden, während auch einschließlich des Daten-Analyse-Workflows. Zur Durchführung dieser Methode in der Regel dauert 1-2 Tage.

Die 1021 kb-Sonden angereicherten Zielregionen in ER-Seq verwendet Tabelle 1 siehe werden, umfasst mehr als 95 % von Genmutationen in 12 gemeinsamen Tumoren. Die große Auswahl an diese Sonden macht diesen Prozess für eine Mehrheit der Krebspatienten. Darüber hinaus ermöglichen unsere einzigartige Sequenzierung Adapter und Grundlinie Datenbank Screening, seltene Mutationen genau zu erkennen.
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Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Mutationen von niedriger Frequenz in CtDNA, ER-seq. Diese Methode unterscheidet sich durch seine einzigartige Verwendung von zwei Richtungen Fehlerkorrektur, einen speziellen Hintergrund Filter und effiziente molekulare Aneignung.

Nachweis von seltenen Mutationen im CtDNA mit Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

detection-of-rare-mutations-in-ctdna-using-next-generation-sequencing

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

16.7K Aufrufe.  Geneplus-Beijing Institute. Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Mutationen von niedriger Frequenz in CtDNA, ER-seq. Diese Methode unterscheidet sich durch seine einzigartige Verwendung von zwei Richtungen Fehlerkorrektur, einen speziellen Hintergrund Filter und effiziente molekulare Aneignung.

Serie: Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

Next Generation Sequencing für den Nachweis von Mutationen umsetzbare in fester und flüssiger Tumoren

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Forschung

Krebsforschung

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging resistance mutations during therapy, or when patients have few circulating tumor cells. Wild-type blocking PCR followed by sequencing analysis offers high sensitivity, flexibility, and simplicity as a methodology for detecting these low frequency mutations. By adding a custom designed locked nucleic acid oligonucleotide to a new or previously established conventional PCR based sequencing assay, sensitivities of approximately 1 mutant allele in a background of 1,000 WT alleles can be achieved (1:1,000). Sequencing artifacts associated with deamination events commonly found in formalin fixed paraffin embedded tissues can be partially remedied by the use of uracil DNA glycosylase during extraction steps. The optimized protocol here is specific for detecting MYD88 mutation, but can serve as a template to design any WTB-PCR assay. Advantages of the WTB-PCR assay over other commonly utilized assays for the detection of low frequency mutations including allele specific PCR and real-time quantitative PCR include fewer occurrences of false positives, greater flexibility and ease of implementation, and the ability to detect both known and unknown mutations.

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Genetik

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently developed method uses a medical wire functionalized with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies for in vivo isolation of circulating tumor cells (CTCs)1. A patient-matched cohort in non-metastatic prostate cancer showed that the in vivo isolation technique resulted in a higher percentage of patients positive for CTCs as well as higher CTC counts as compared to the current gold standard in CTC enumeration. As cells cannot be recovered from current medical devices, a new functionalized wire (referred to as Device) was manufactured allowing capture and subsequent detachment of cells by enzymatic treatment. Cells are allowed to attach to the Device, visualized on a microscope and detached using enzymatic treatment. Recovered cells are cytocentrifuged onto membrane-coated slides and harvested individually by means of laser microdissection or micromanipulation. Single-cell samples are then subjected to single-cell whole genome amplification allowing multiple downstream analysis including screening and target-specific approaches. The procedure of isolation and recovery yields high quality DNA from single cells and does not impair subsequent whole genome amplification (WGA). A single cell&#39;s amplified DNA can be forwarded to screening and/or targeted analysis such as array comparative genome hybridization (array-CGH) or sequencing. The device allows ex vivo isolation from artificial rare cell samples (i.e. 500 target cells spiked into 5 mL of peripheral blood). Whereas detachment rates of cells are acceptable (50 - 90%), the recovery rate of detached cells onto slides spans a wide range dependent on the cell line used (&#60;10 - &#62;50%) and needs some further attention. This device is not cleared for the use in patients.

This protocol is to recover and prepare rare target cells from a mixture with non-target background cells for molecular genetic characterization at the single-cell level. DNA quality is equal to non-treated single cells and allows for single-cell application (both screening based and targeted analysis).

Ziel Zelle Voranreicherung und ganze Genome Amplifikation für einzelne Zelle nachgelagerten Charakterisierung

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. In the clinical setting, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues are widely used for genetic testing. However, FFPE DNA is generally damaged and fragmented during the fixation process with formalin. Therefore, FFPE DNA is sometimes not adequate for genetic testing because of low quality and quantity of DNA. Here we present a method of touch imprint cytology (TIC) to obtain genomic DNA from cancer cells, which can be observed under a microscope. Cell morphology and cancer cell numbers can be evaluated using TIC specimens. Furthermore, the extraction of genomic DNA from TIC samples can be completed within two days. The total amount and quality of TIC DNA obtained using this method was higher than that of FFPE DNA. This rapid and simple method allows researchers to obtain high-quality DNA for genetic testing (e.g., next generation sequencing analysis, digital PCR, and quantitative real time PCR) and to shorten the turnaround time for reporting results.

Obtaining high-quality genomic DNA from tumor tissues is an essential first step for analyzing genetic alterations using next generation sequencing. In this article, we present a simple and rapid method to enrich tumor cells and obtain intact DNA from touch imprint cytology specimens.

Einfache und schnelle Methode, um qualitativ hochwertige Tumor DNA von klinischen pathologischen Proben mit Touch Impressum Zytologie zu erhalten

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

Nachweis zellfreier DNA in Blutplasmaproben von Krebspatienten

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

Medizin

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

Erkennen Somatische Genetische Veränderungen in Tumorproben von Exon-Abscheidung und-Massively Parallel Sequencing

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Biologie

Droplet Digital Polymerase Chain Reaction: A Method to Generate Nanodroplet PCR Reactions for Detecting Rare Tumor Mutations

Source: Bonner, E. R. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/59721" target="_blank">Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we present a step-by-step procedure to generate emulsified nano-droplets to detect target nucleic acids by digital polymerase chain reaction or dPCR.

Tröpfchen-Digitalpolymerase-Kettenreaktion: Eine Methode zur Erzeugung von Nanotröpfchen-PCR-Reaktionen zum Nachweis seltener Tumormutationen

Source: Bonner, E. R. et al. Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids. J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we ...