우리 아 이들의 종양학 그룹 AAML1531 연구 및 환자 샘플의 형태로 그들의 공헌에 대 한 간호사 건강 연구에서 참가자를 감사합니다. 이 작품은 건강의 국가 학회 (UM1 CA186107, RO1 CA49449 RO1 CA149445), 아 이들의 발견 연구소의 워싱턴 대학교 세인트 루이스 어린이 병원 (엠씨-II-2015-461)와 일 라이 세스 매튜 스 백혈병 재단에 의해 투자 되었다.

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	<li>Hoang, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+quantification+of+rare+somatic+mutations+in+normal+tissues+using+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal tissues using massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113, 9846-9851 (2016).</li><li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporadic+autism+exomes+reveal+a+highly+interconnected+protein+network+of+de+novo+mutations.">Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations.</a> Nature. 485, 246-250 (2012).</li><li>Young, A. 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저자는 공개 없다.

다른 질병에 낮은 VAFs와 돌연변이 연구를 쉽게 구현할 수 있는 오류 수정 시퀀싱 프로토콜의 집합을 설명 합니다. 그들은 원시 읽기 오류 보정을 가능 하 게 가장 중요 한 요소 시퀀싱 전에 각 분자 Umi의 법인입니다. 여기에 설명 된 방법을 상용 유전자 패널을 자체 설계 유전자 특정 oligos 사용자 지정된 Umi를 통합 하는 연구를 허용 합니다.
표준 NGS 프로토콜 precludes 시퀀싱 오류 비율 때문 2% 아래 VAF와 변이의 탐지 하 고이 희소 한 이체의 탐지는 중요 한 연구에서 NGS의 응용 프로그램을 제한 합니다. 우회 표준 NGS 오류율, ECS이 원시 이체의 민감한 감지 수 있습니다. 예를 들어, 이러한 돌연변이 처음 (따라서 데 낮은 VAF) 발생 때 병원 성 변이의 탐지 병14,15의 조기 개입에 게 필수적입니다. 백혈병 연구, 최소한의 잔류의 검출에에서 질병 (잔여 leukemic 세포 후 처리) 위험 계층을 알립니다 및 이진 흐름 cytometric 평가 수 없습니다 하는 방식으로 치료 옵션을 통보 하는 데 사용할 수. 또한, ECS 순환 종양 핵 산을 검출 하 고 단단한 종양 환자에서 전이성 잠재력을 평가 하는 존재/부재로의 기본 특성은 특정 돌연변이의 변형 부담을 평가 하 여 적용 됩니다. 종양16.
표 1에서처럼 변종 전화 위치 특정 오류 이항 분포-기반 모델을 사용 하 여 전원 시퀀싱 오류 모델을 구축 하는 데 사용의 깊이 뿐만 아니라 시퀀스 라이브러리의 수에 따라 달라 집니다. 오류 모델의 견고성 샘플 및 시퀀싱 깊이 더 높은 수가 증가합니다. 각 샘플에 대 한 오류 프로필 범위의 오류 수정 읽기 샘플 당 3000 x의 평균 최소한 10 시퀀스 샘플을 사용 하는 것이 좋습니다. 위치-특정 방식은 비슷한 MAGERI, 하지만 모든 6 다른 대체 종류에 대 한 집계 오류 비율을 사용 하는 대신 (A > C/T > G, A > G/T > C, A > T/T > A, C > A/G > T, C > G/G > C C > T/G > A)13, 우리 모든 위치에 독립적으로 각 대체 모델. 예를 들어, C의 오류 비율 > T는 genomic 위치는 다른 위치에서 다른. 우리의 접근 방법 또한 걸립니다 계정에 연속 배치 효과 관찰 한 시퀀싱 실행 기본 대체 속도에서 실행 하는 다른 다를 수 있습니다. 따라서 그것은 특히 다른 시퀀싱 실행에서 샘플 모델 구축 풀링되지 때 모든 대체 형식에 대 한 각 위치를 모델링 하는 것이 중요.
ECS 실험을 설계할 때 중요 한 고려 사항은 원하는 검출 임계값입니다. NGS 연구의 아름다움은 그 그들은 쉽게 확장할 수 유전자/대상 관심, 검출 임계값 (시퀀싱의 깊이 의해 결정), 및 쿼리 하는 개인의 수의 점에서. 예를 들어 연구원은 0.0001의 감지 임계값을 갖는 2 개의 amplicons에 드문 돌연변이 찾을 관심이 있다면, 그들은 최대 15 백만 읽기 출력 MiSeq V2 화학을 사용 하 여 실행 한 시퀀싱에 극대로 75 샘플 수영장 수 (2 amplicons * 10000 분자 * 10 오류 수정에 대 한 읽기 * 75 샘플 15 백만 시퀀싱 읽기 =). 연구원은 시퀀싱 또는 단일 시퀀스 검출 임계값 조정 실행에 풀링된 샘플 수로가 하는 분자의 수를 변화할 수 있다. 우리의 연구에서 우리 0.0001 VAF (1:10, 000)의 감지 임계값으로 돌연변이 찾을 목적 Illumina 유전자 패널을 사용 하 여. 우리가 일상적으로 250를 사용 하 여 상기 검출 임계값을 달성 하기 위해 충분 한 분자 캡처되는지 확인에 DNA 시작의 ng. 연구팀은 DNA의 낮은 금액으로 시작 하도록 선택할 수 있습니다 (50 ng는 것이 좋습니다) 원하는 검색 제한이 > 0.001 VAF.
Umi i5 인덱스에 추가 됩니다, 시퀀싱 설정을 적절 하 게 수정 되어야 할. 예를 들어 16 N Umi, 사용 하 고 시퀀싱 설정 된 2 x 144 짝된 끝 읽기, 인덱스 1의 8 주기 및 인덱스 2의 일반적인 8 사이클 반대로 인덱스 2의 16 주기. 인덱스 2 주기 증가 사이클 읽기에 할당 된의 총 수에 있는 감소에 의해 보상 된다. 연구원은 12N Umi10,17를 사용 하기로 선택한 경우 인덱스 2의 12 주기를 설정은 변경 되어야 합니다.
이 우미 기반 시퀀싱 방법은 시퀀싱 오류 수정 최적화 됩니다. 모든 확대 기반 방법에 대 한 문제는 차선의 PCR jackpotting 처리에 남아 있습니다. 라운드 후 시퀀싱 및 게시물-생물 정보학 유효성 검사 ddPCR를 사용 하 여 수행 하 고 거의 PCR jackpotting 때문에 어떤 잘못 된 반응 감지. 그럼에도 불구 하 고, 연구원은 낮은 증폭 오류를 고화질 중 합 효소를 사용 하 여 실험을 실시 하는 것이 좋습니다.

우리가 나이, mutagens, 게놈, 그리고이에 체세포 착오의 축적에서 세포 분열 결과 중 확률 오류 노출에 기초가 악성 변화의 근본적인 병 인 신경 발달 질환, 소아 질환과 정상적인 노화1,2. 질병-운전 잠재력 체세포 돌연변이 조기 발견 및 위험 관리3,,45에 대 한 중요 한 진단 및 예 후 바이오 마커. 더 나은 physiologic clonogenesis 이해, 어떤 임상 통보 되며 결정, 정확한 정량화 및이 돌연변이의 특성화 연구 기본 중요성 이다. 차세대 시퀀싱 (NGS)은 현재 이기종 DNA 샘플; 클론 변이 공부 하는 데 사용 됩니다. 그러나, NGS 식별에서 돌연변이로 제한 됩니다 > 0.02 변형 대립 유전자 분수 (VAF)-0.5-2.0의 고유한 오류 비율 때문 시퀀싱 플랫폼6,7,8%. 그 결과, 추적 진단 및 prognostically 중요 한 체세포 변종 낮은 VAF에 얻을 수 없다 표준 NGS를 사용 하 여.
최근, 다양 한 방법은 NGS8,9,,1011의 오류율을 회피 하기 위해 개발 되었습니다. 이러한 방법을 활용 분자 태그, 시퀀싱 후 오류 수정 가능 하 게 합니다. 각 분자 또는 시퀀싱 라이브러리에서 게놈 단편으로는 임의의 독특한 분자 식별자 (우미) 그 분자에 관련 된 태그입니다. Umi는 무작위 뉴클레오티드 (8-16 N)의 문자열의 순열에 의해 구성 됩니다. 두 번째 샘플 전용 바코드 또한 동일한 NGS 시퀀싱 실행에 여러 샘플을 멀티플렉싱 있도록 워크플로에 통합 된다. PCR 증폭 분자로 태그 라이브러리에서 수행 되 고 그 후 라이브러리 시퀀싱에 대 한 전송 됩니다. 라이브러리 준비 동안 PCR 증폭 및 시퀀싱8동안 오류 게놈 단편을 무작위로 소개 것 이다는 예상 된다. 임의의 연속 오류를 제거 하려면 원시 시퀀싱 읽기 우미에 따라 그룹화 됩니다. 시퀀싱에서 아티팩트 하지 진정한 variant를 충실 하 게 증폭 하 고 같은 바다를 공유 하는 모든 읽기에 시퀀싱 것 소개의 확률적 특성으로 인해 동일한 게놈 위치에 동일한 우미와 모든 읽기에 있을 예정 이다. 아티팩트는 제거 하는 bioinformatically. 여기, 우리가 설명 하는 세 가지 방법의 오류 수정 시퀀싱 (ECS) 단일 뉴클레오티드 변종 (SNVs) 및 작은 삽입-삭제 (Indels), 식별 하기 위해 dna 그리고 RNA 유전자 발현 아래의 정량화를 촉진 하기 위해 실험실에 최적화 된 NGS 오류 임계값입니다.
첫 번째 방법은 연구자에 의해 설계 된 유전자 특정 뇌관을 사용 하 여 희귀 체세포 이벤트에 대 한 보고 하는 방법을 설명 합니다. 라이브러리 준비, 이전 연구자 관심의 파편을 대상으로 프라이 머를 설계 해야 합니다. 우리가 사용 하는 웹 애플 리 케이 션 Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). 200-250 bp의 Amplicons 연쇄 반응 (PCR)에 대 한 이상적인 Umi 통합 되었습니다 일단이 것으로, 150 bp 쌍 간 읽기와 쌍 간 읽기 중복 생성. 사용 될 최적의 뇌관 디자인 조건: 최소 뇌관 크기 = 19; 최적의 뇌관 크기 = 25; 최대 뇌관 크기 = 30; 최소 Tm = 64 ° C; 최적의 Tm = 70 ° C; 최대 Tm = 74 ° C; 최대 Tm 차이 = 5 ° C; 최소 GC 내용 = 45; 최대 GC 내용 = 80; 반환 번호 = 20; 최대 3' 끝 안정성 = 100.
방법 2에서 우리가 ECS DNA 프로토콜 클론 SNVs 및 작은 Indels 희귀 0.0001 VAF amplicons의 수백을 포함 하는 상업적으로 이용 가능한 유전자 패널을 사용 하 여 조사를 Illumina 화학 결합 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 우리의 실험에 대 한 TruSight 골수성 시퀀싱 패널 (Illumina)를 사용 하 고 소아 골수성 질환에 대 한 관심의 추가 유전자를 포함 하는 확장 된 패널을 설계. 이러한 패널 팬 들은 그래서 우리 자신의 어댑터 전략이이 패널에 추가 했습니다 오류 정정을 촉진 것이 독특한 분자 식별자 (Umi)의 정보를 제공 하지는. ECS 작동 한다 다른 질병와 관련 된 유전자에 대 한 풍부 하 게 설계 된 다른 패널의 동등 하 게 잘. DNA 분리 및 조직 또는 관심의 샘플에서 후속 정량화, 다음 것이 좋습니다 적어도 500 재고 DNA 견본 당 ng. 우리는 정기적으로 250를 사용 하 여 단일 시퀀싱 라이브러리 확인 중복 및 VAF 계산으로 가능한 한 많은 독특한 게놈 단편으로 하류 캡처하기 위해 DNA의 ng 읽습니다. 선택적 복제 시퀀싱 라이브러리 나머지 250으로 만들어질 수 있다 DNA의 ng. 우리는 항상 표본, 당 2 개의 복제 라이브러리 만들고 참 긍정으로 둘 다 복제에 독립적으로 검색 하는 이벤트에만 생각. 우리는 또한4,13전화 이체의 정확도를 높이 genomic 위치 특정 이항 오류 모델 구현.
마지막으로,는 상용 QIAseq 대상 RNA 패널 (Qiagen)를 사용 하 여 사본 정량화에 대 한 RNA 시퀀싱에 ECS를 연결 하는 방법에 설명 합니다. 중복에는 Umi 필요한 오류 수정 키트에 통합 되었습니다 및 연구원은 제조 업체의 권장 사항에 따라 라이브러리를 만들 수 있습니다. Bioinformatically, 연구자는 ECS-DNA, 프로토콜 섹션에서 자세히 설명 될 것 이다를 위한 파이프라인을 따를 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Q5 High Fidelity Hot Start Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Custom Amplicon Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td></td></tr><tr><td>UMI i5 adapter sequences</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7442S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Ligation Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7595S</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864005</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Digital PCR System</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well Plates</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>TruSight Myeloid Sequencing Panel</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1010</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie 2</td><td>Johns Hopkins University</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Customized QIAseq Targeted RNA Panel</td><td>Qiagen</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Plus Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr></tbody></table>

rare event detection using error-corrected dna and rna sequencing

기존의 차세대 시퀀싱 기술 (NGS) 10 년 이상에 대 한 거 대 한 게놈 특성에 대 한 수 있다. 특히, NGS 악성에 클론 돌연변이의 스펙트럼을 분석 하 사용 되었습니다. 비록 전통적인 Sanger 방법, 식별 하는 ~0.5–2.0 %의 그것의 높은 에러율으로 인해 드문 클론와 subclonal 돌연변이와 NGS 투쟁 보다 훨씬 더 효율적. 따라서, 표준 NGS는 돌연변이 대 한 검색의 제한이 > 0.02 변형 대립 유전자 분수 (VAF). 이 환자에서 희소 한 돌연변이 대 한 임상 중요성 동안 알려진된 질병 불분명, 남아 없이 백혈병 치료 하는 환자 크게 향상 결과 잔여 질병 때 < 0.0001 cytometry에 의해. NGS의이 artefactual 배경, 완화 하기 위해 수많은 방법이 개발 되었습니다. 여기 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱 (ECS), 개별 분자 임의의 인덱스 오류 수정에 대 한 혈압의 16와 다중화 8 혈압 환자 특정 인덱스를 태그를 포함 하는 방법을 설명 합니다. 우리의 방법은 감지 하 고 변형 대립 유전자 분수 (VAFs) 두 배나 NGS의 검출 한계 보다 낮은 희귀 0.0001 VAF에 클론 변이 추적할 수 있습니다.

Targeted Error-Corrected dna 시퀀싱, 함께 우리는 돌연변이 환자 상업 genomic DNA에 DNA를 diluting 원리 실험의 증거를 수행 했습니다. 환자 GATA1 돌연변이 했다 (chrX:48650264, C > G) 0.19의 원래 VAF와. ECS 단일 뉴클레오티드 변종 1:10,000의 수준으로 양적은 그림 1 에서 설명 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> 그림 1: GATA1 SNV 보여주는 ECS 1:10,000의 수준으로 양적은 희석 시리즈. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
우리는 또한 ECS DNA 안정적으로 성인 급성 골수성 백혈병 (AML) 건강 한 노인 개인4에 recurrently 유전자에 드문 클론 변이 감지 하는지 보여준다. 우리는 간호사의 건강 연구 틀 약 떨어져 ~ 10 년에서에서 20 건강 한 개인에서 버 피 코트 샘플을 얻었다. 우리는이 샘플에 ECS-DNA 패널 프로토콜을 적용. 이 실험에 대 한 우리 Illumina TruSight 골수성 시퀀싱 패널 568 amplicons (자세한 내용은 https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html에 유전자 목록에) 구성 된 적응 및 시퀀싱 20 개인에서 80 라이브러리 (다른 시간 지점에서 2 컬렉션, 시간 당 개인 당 2 복제 지점) 47.7 백만 쌍 간 읽기의 평균 및 오류를 수정 하는 3.4 백만의 평균을 생성 Illumina NextSeq 플랫폼을 사용 하 여 도서관4당 합의 시퀀스입니다. 라이브러리 당 평균 뉴클레오티드 커버리지 (3.4 수백만 568로 나눈 값) x 6000 대략 이었다. 각 샘플에 대 한 우리는 동일한 샘플에서 되지 않은 시퀀스 된 라이브러리를 사용 하 여 위치 특정 오류 프로필을 건설 한다. 우리는 하나 이상의 컬렉션 시간 지점의 두 복제에 109 클론 체세포 돌연변이 발견. 이러한 돌연변이 VAF 0.0003-0.1451에서 배열 있다. 우리가 알려진된 우주 표현으로 21 돌연변이 선택 하 고 하나 또는 두 개의 컬렉션 시간 포인트 ddPCR를 사용 하 여 모든 21 돌연변이 확인 (n = 34, 그림 2, 젊은 외. 20164에서 적응).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> 그림 2: ECS로 식별 하는 돌연변이 매우 조화 된 VAFs와 ddPCR를 통해 확인 했다. (n = 34, 젊은 외. 20164수정). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
ECS RNA 프로토콜을 사용 하 여 오류 수정 식 수준에 관하여 우리 다양 한 암 (QIAseq 인간의 암 Transcriptome 패널에서 적응), 그리고 우리와 관련 된 것으로 알려진 416 유전자의 구성 된 QIAseq 화학을 사용 하 여 유전자 패널 사용자 정의 ( 보충 자료1에서 유전자 목록) 주어진된 유전자의 가장 일반적으로 표현한 exon 증폭. 우리 쌍 간 형식 라이브러리, 당 8.3 백만 읽기의 평균을 준 Illumina MiSeq 플랫폼을 사용 하 여 라이브러리를 시퀀싱 그리고 우리 0.417 백만 오류 수정 합의 시퀀스의 평균을 잡으려고 관리. 우리 식 수준 낮은 풍부한 사본 보여주었다 (< 50에서 1000 사본 수 총 RNA의 ng) 복제 사이 높은 재현성은 (데이터 요소 n = 300, 그림 3). DdPCR (식의 다양 한 정도의 6 선택 된 유전자)에 의해 유효성 검사 유전자의 식 수준 올바르게 정규화에 대 한 필요 없이 ECS 프로토콜에 의해 점령 되었습니다 했다 설명 했다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> 그림 3: 상단, 대 본의 상관 관계 계산 ECS RNA에 의해 동일한 샘플의 복제 사이 (n = 300). 하단, ECS로 식별 하는 건의 했다 ddPCR에 의해 확인 하는 사본 (n = 6). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼 (~0.5–2.0%)의 높은 오류 속도 의해 제한 되는 genomic 특성 분석을 위한 강력한 도구입니다. NGS 오류율을 제거 하 고 변형 대립 유전자 분수 0.0001 희귀에서 변이 감지 수 있는 오류 수정 시퀀싱의 우리의 방법을 설명 합니다.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

rare-event-detection-using-error-corrected-dna-and-rna-sequencing

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

11.9K 조회수.  Washington University School of Medicine. 차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼 (~0.5–2.0%)의 높은 오류 속도 의해 제한 되는 genomic 특성 분석을 위한 강력한 도구입니다. NGS 오류율을 제거 하 고 변형 대립 유전자 분수 0.0001 희귀에서 변이 감지 수 있는 오류 수정 시퀀싱의 우리의 방법을 설명 합니다.

비디오: Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging resistance mutations during therapy, or when patients have few circulating tumor cells. Wild-type blocking PCR followed by sequencing analysis offers high sensitivity, flexibility, and simplicity as a methodology for detecting these low frequency mutations. By adding a custom designed locked nucleic acid oligonucleotide to a new or previously established conventional PCR based sequencing assay, sensitivities of approximately 1 mutant allele in a background of 1,000 WT alleles can be achieved (1:1,000). Sequencing artifacts associated with deamination events commonly found in formalin fixed paraffin embedded tissues can be partially remedied by the use of uracil DNA glycosylase during extraction steps. The optimized protocol here is specific for detecting MYD88 mutation, but can serve as a template to design any WTB-PCR assay. Advantages of the WTB-PCR assay over other commonly utilized assays for the detection of low frequency mutations including allele specific PCR and real-time quantitative PCR include fewer occurrences of false positives, greater flexibility and ease of implementation, and the ability to detect both known and unknown mutations.

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

와일드 형은 PCR은 낮은 주파수 체세포 돌연변이의 검출을위한 고감도 방법으로 직접 시퀀싱과 결합 블로킹

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

연구

유전학

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

Ribosomal DNA에 따라 RNA 샘플에서 DNA 오염 평가

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

암 연구학

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Naked-Eye Detection of Rare Point Mutations in DNA

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen application of the method is the identification of rare mutations in circulating cell-free DNA from liquid biopsies, with a relevance in cancer diagnostics and stratification of oncological patients for personalized therapy. As a proof of concept, the test has been designed to detect the BRAFV600E mutation in the BRAF gene, which is important to identify the sub-group of melanoma patients that can benefit from targeted therapies with BRAF inhibitors. However, this colorimetric test can be easily generalized to other somatic mutations of clinical relevance due to the use of universal detection probes, thus providing strong potential in oncological diagnostics.
The test detects 0.5% of BRAFV600E in an excess of BRAFWT DNA, which matches the sensitivity of some commercial instrumental assays. Such sensitivity is clinically relevant for diagnostic purposes, allowing the early identification of drug-sensitive patients. In contrast to commercial assays based on real-time PCR, this test requires minimal instrumentation and processing, as it can be performed on DNA amplified with a standard PCR (or isothermal techniques) and provides a naked-eye readout with a one-tube reaction of a few steps in only one hour. At present, the test has been used only on synthetic DNA samples. However, the latter have been designed to mimic a real sample amplified from circulating cell-free DNA, to favor the translation of the test to clinical diagnostics.

This protocol permits the naked-eye identification of point mutated DNA in a 200-fold excess of wild type DNA molecules, by exploiting gold nanoparticles and paramagnetic microparticles.

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen ...

생화학

<meta charset="utf8"></head><body>Wild-Type Blocking PCR을 통한 저빈도 돌연변이 검출 최적화

Wild-type Blocking PCR Combined with Sanger Sequencing for Detection of Low-frequency Somatic Mutation

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting for drug resistance mutations and circulating tumor cell mutations during therapy. Traditional Sanger sequencing has 5%-20% wild-type mutation detection, so its limit of detection cannot meet the corresponding requirements. The wild-type blocking technologies that have been reported to overcome this include blocker displacement amplification (BDA), non-extendable locked nucleic acid (LNA), hot-spot-specific probes (HSSP), etc. These technologies use specific oligonucleotide sequences to block wild-type or recognize wild-type and then combine this with other methods to prevent wild-type amplification and amplify mutant amplification, leading to characteristics like high sensitivity, flexibility, and convenience. This protocol uses BDA, a wild-type blocking PCR combined with Sanger sequencing, to optimize the detection of RHOA G17V low-frequency somatic mutations, and the detection sensitivity can reach 0.5%, which can provide a basis for MRD monitoring of angioimmunoblastic T-cell lymphoma.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 암 조직에서 저주파 돌연변이 검출의 발전

This article introduces the application of a low-frequency detection method based on Sanger sequencing in angioimmunoblastic lymphoma. Provide a basis for applying this method to other diseases.

저빈도 체세포 돌연변이 검출을 위한 Sanger 염기서열분석과 결합된 야생형 차단 PCR

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

파편을 사용하여 풀링된 장면에서 드문 게놈 변종의 탐지

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

요약

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진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

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Naked-Eye Detection of Rare Point Mutations in DNA

저빈도 체세포 돌연변이 검출을 위한 Sanger 염기서열분석과 결합된 야생형 차단 PCR

저빈도 체세포 돌연변이 검출을 위한 Sanger 염기서열분석과 결합된 야생형 차단 PCR

저빈도 체세포 돌연변이 검출을 위한 Sanger 염기서열분석과 결합된 야생형 차단 PCR

파편을 사용하여 풀링된 장면에서 드문 게놈 변종의 탐지