Name: lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation
Uploaded: 2018-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
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Wir möchten alle bisherigen Mitglieder des Bouchier-Hayes Lab zu würdigen, die für die Entwicklung dieser Technik beigetragen. Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Texas Children Hospital Pediatric Pilot Award, LBH finanziert. Wir danken für die Erlaubnis, in Zusammenarbeit mit ihrem Team veröffentlichte Daten gehören Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas). Die Entwicklung der beschriebenen Reagenzien wurde durch die Zytometrie und Zellkern Sortierung am Baylor College of Medicine unterstützt mit Mitteln aus dem NIH (NIAID P30AI036211 NCI P30CA125123 und NCRR S10RR024574) und die Unterstützung des Joel M. Sederstrom

1. Vorbereitung der Zellen und Kultur Gerichte
Hinweis: Führen Sie Schritte 1-3 in einer Gewebekultur Laminar-Flow-Haube. Tragen Sie Handschuhe.
<ol><li>Wenn unten Glasschalen, bestreichen Sie das Glas mit Fibronektin. Fahren Sie mit Schritt 1.2, wenn Kunststoffgeschirr verwenden.<ol>
<li>Machen Sie eine 0,1 mg/mL Lösung von Fibronektin: 1 mL 1 mg/mL Fibronektin Lösung in 9 mL 1 X PBS verdünnen.</li>
		<li>Bedecken Sie den Glasboden von jedem Bohrloch mit 0,5-1 mL Fibronektin und 1-5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Mit einer Pipette, sammeln die Fibronektin-Lösung und Lagerung bei 4 ° C. Hinweis: Die Fibronektin-Lösung kann mehrfach wiederverwendet werden.</li>
		<li>Das Glas einmal mit 1-2 mL 1 X PBS waschen und aspirieren von PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platte 1 x 105 Zellen pro Bohrloch einer 6-Well-Platte in der entsprechenden Zelle 2 mL Kultur Medien (siehe Tabelle 1 für Zellzahlen für verschiedene große Brunnen verwenden). Wenn eine Zelllinie, die stabil die Caspase BiFC Komponenten ausdrückt (siehe Diskussion), Platte 2 x 105 Zellen und fahren Sie mit der Behandlungsschritt (Schritt 3).</li>
	<li>Können Sie Zellen, die Schüssel über Nacht bei 37 ° C in einer Gewebekultur Inkubator einzuhalten.</li>
</ol>2. die Transfektion von Zellen, die Caspase BiFC Komponenten einzuführen
<ol><li>Transfizieren Sie Zellen mit dem entsprechenden Transfektion Reagenz. Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Anweisungen für Lipofectamine 2000, die für minimale Toxizität optimiert wurde. Dieses Protokoll wird in Hela-Zellen, Zellen MCF7 und LN18 erfolgreich eingesetzt. Wenn zusätzliche Transfektion Reagenzien folgen Sie den Anweisungen des Herstellers und nach Bedarf zu optimieren.<ol>
<li>750 µL reduzierte Serum Medien in ein steriles Röhrchen 12 µL des Transfection Reagens hinzufügen.</li>
		<li>In 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 10 ng ein Reporter Plasmid (ein Plasmid Codierung ein fluoreszierendes Protein, z.B. rot fluoreszierende Protein [Ausschreibung], die die transfizierten Zellen beschriften wird) zu einem sterilen 1,5 mL Schlauch für jedes gut zu transfiziert werden.</li>
		<li>Fügen Sie 20 ng jeder Caspase BiFC Plasmids (z. B.20 ng von Caspase-2 prodomain [Pro C2]-VC und 20 ng von C2 Pro-VN) für jedes Rohr (Tabelle 2).</li>
		<li>Bringen Sie jedes Rohr bis zu einem Gesamtvolumen von 100 µL durch Hinzufügen von reduzierten Serum Medien.</li>
		<li>Fügen Sie mit Hilfe einer Pipette p200 hinzu, 100 µL der Transfektion Reagenzlösung aus Schritt 2.1.2 Plasmid-Mischung in gewissem Sinne tropfenweise.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Plasmid-Transfection Reagens Mischung für 20 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Aspirieren Sie die Medien aus den Zellen mit einer Pipette oder mit Absaugung und dann mit einer Pipette p1000 pipette 800 µL Serum freier Medien sanft auf der Seite des Brunnens.</li>
		<li>Fügen Sie mithilfe einer Pipette p200 200 µL der DNA-Lipid-Komplex tropfenweise in jede Vertiefung.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C für 3 h.</li>
		<li>Kümmert sich nicht um die Monolage stören, entfernen die Serum freier Medien enthält die DNA-Lipid-komplexe durch Absaugen mit Absaugung oder mit einer Pipette.</li>
		<li>Pipette 2 mL vorgewärmten (37 ° C) komplette Wachstumsmedien sanft an der Seite von jedem Bohrloch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubation der Zellen bei 37 ° C in einer Gewebekultur-Inkubator für 24-48 h für optimale Protein-Expression.</li>
</ol>(3) Induktion von Caspase-Aktivierung
<ol><li>Behandlung mit einem Medikament oder Anregung, die Caspase Aktivierung ca. 24 h nach Transfektion induziert.<ol>
<li>Fügen Sie die gewünschte Konzentration des Medikaments vorgewärmt (37 ° C) bildgebenden Medien (komplette Wachstumsmedien ergänzt mit Hepes [20 mM, pH 7,2-7,5] und 2-Mercaptoethanol [55 µM]) und Mischung sanft (Tabelle 3).</li>
		<li>Aspirieren Sie die Medien aus den Zellen mit einer Pipette oder mit Absaugung und dann mit einer Pipette, pipette, 2 mL der Lösung von 3.1.1 sanft auf der Seite des Brunnens.</li>
		<li>Geben Sie bildgebende Medien ohne die Droge in einer als einer unbehandelten Kontrolle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C oder gehen Sie zu Schritt 4.3 für ein Time-Lapse-Experiment.</li>
</ol>4. Caspase BiFC Datenerfassung
<ol><li>
Caspase BiFC für einzelne Punkt Erwerb
	<ol>
<li>Schalten Sie das Mikroskop und fluoreszierende Lichtquelle, die Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Finden Sie die Zellen unter dem RFP Filter und konzentrieren sich auf die Reporter-gen-Fluoreszenz.</li>
		<li>Mit einer Hand-Stückzähler, zählen Sie alle RFP-positiven Zellen im Gesichtsfeld. Notieren Sie die Nummer.</li>
		<li>Unter Beibehaltung der gleichen Gesichtsfeld, wechseln Sie zu der GFP-Filter (oder YFP Filter falls vorhanden) und mit einer Hand-Stückzähler, die Anzahl der Erythrozyten, die auch grün sind (Venus-positiv). Und schalten Sie zwischen den beiden Filtern, um sicherzustellen, dass nur die roten Blutkörperchen für Venus-Positivität ausgewertet werden her. Notieren Sie die Nummer (Abbildung 3).</li>
		<li>Zählen Sie mindestens 100 RFP-positiven Zellen aller drei Einzelbereiche der Platte.</li>
		<li>In jedem Bereich Berechnung des Prozentsatzes der Venus positiven transfizierten Zellen (d.h. Erythrozyten, die auch grün sind). Durchschnitt der sich daraus ergebenden Prozentsätze um die Standardabweichung zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dreidimensionale Bildgebung von Caspase BiFC
	<ol>
<li>Schalten Sie das Mikroskop nach den Anweisungen des Herstellers und starten Sie der Datenerfassungs-Software zu.</li>
		<li>Wählen Sie die 60 X oder 63 X Öl Ziel und geben Sie einen Tropfen Öl auf das Ziel</li>
		<li>Ort der Kulturschale auf den Mikroskoptisch mit dem richtigen Plattenhalter.</li>
		<li>Mit entweder einem Epifluoreszenz Lichtquelle und das Mikroskop Okular oder die konfokale Laser und dem Computer-Bildschirm, navigieren Sie zu einem Feld von Interesse.</li>
		<li>Konzentrieren Sie sich auf die Reporter-Fluoreszenz der RFP Laser-oder Filter.</li>
		<li>Wenn Epifluoreszenz bis zu diesem Zeitpunkt verwendet wurde, wechseln Sie die Lichtquelle in der konfokalen Laser und visualisieren Sie das live-Bild der Zellen als durch die Kamera erworben und von der Datenerfassungs-Software auf dem Computerbildschirm angezeigt.</li>
		<li>Mit dem Joystick-Steuerung und das Fokussierrad, Feinabstimmung der Fokus und die Position der Zellen so, dass die Zellen in der Mitte des Sucher. Wählen Sie Zellen, die von einander getrennt sind und nicht überlappen.</li>
		<li>Geben Sie die Laserleistung Prozentsatz auf 50 % und die Belichtungszeit bei 100 ms für Venus und RFP als Ausgangspunkt, um die optimalen Einstellungen für das Experiment verwendet zu bestimmen.</li>
		<li>Schalten Sie live erfassen und untersuchen Sie das resultierende Bild und die dazugehörige Anzeige Histogramme für beide Kanäle.</li>
		<li>Wenn das Signal niedrig und das Bild schwer ist auszumachen, erhöhen Sie der Prozentsatz Laser macht und/oder Belichtung Zeit in Schritten, bis das Signal im Bild gut aussieht.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass das Signal nicht Sättigung erreicht. Überprüfen Sie das Display Histogramm, um sicherzustellen, dass eine deutliche Spitze sichtbar für jeden Fluor ist. Wenn der Gipfel die gesamte Histogrammanzeige umfasst, geben Sie unteren Laser macht und Belichtung Einstellungen (Abbildung 2).</li>
		<li>Visualisieren Sie (unbehandelte oder nicht transfizierten) Kontrollzellen unter den gleichen Bedingungen zu gewährleisten, dass das Signal spezifisch ist. Hinweis: Einzelne Farbe Transfectants kann auch zur Kontrolle für Crossover, aber wenn die Signale räumlich unterschiedliche (z.B. mitochondriale versus cytosolischen sind) ist dies nicht notwendig.</li>
		<li>Wählen Sie oder öffnen Sie das Z-Stapel-Modul in der Mikroskop-Software.</li>
		<li>Verwenden den Fokussierknopf, ungefähre der Fokuslage entspricht der Mitte der Zelle.</li>
		<li>Stellen Sie den Fokus in eine Richtung, bis die Zelle nicht mehr sichtbar ist, wählen Sie diese Option als die Top-Position.</li>
		<li>Stellen Sie den Fokus in die entgegengesetzte Richtung, bis die Zelle wieder nicht mehr sichtbar ist, und wählen Sie diese Option als die untere Position.</li>
		<li>Wählen Sie die optimale Schrittweite (in der Regel ca. 20 µm) und die Übernahme um die Kamera ein Bild automatisch in jedem Kanal jeweils 20 µm Schritte zwischen den oberen und unteren Positionen zu beauftragen.</li>
		<li>Verwenden Sie 3D Rendering-Software, um das 3D Bild (Abbildung 4Film 1) rekonstruieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Time-Lapse Bildgebung von Caspase BiFC
	<ol>
<li>Mindestens 1 h vor dem Experiment, schalten Sie das Mikroskop und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C.</li>
		<li>Wählen Sie die 40 X, 60 X oder 63 X Öl Ziel und geben Sie einen Tropfen Öl auf das Ziel.</li>
		<li>Ort der Kulturschale auf den Mikroskoptisch mit dem richtigen Plattenhalter.</li>
		<li>Wenn eine CO2 Quelle verfügbar ist, legen Sie die CO2 -Lieferung-Gerät (in der Regel eine Plexiglas Deckel befestigt, die Röhre, die das CO2liefert) auf den Kennzeichenhalter. Der CO-2 -Ebene auf 5 % festgelegt und schalten Sie die CO2 Controller von innerhalb der Software. Wenn eine CO-2 -Quelle nicht verfügbar ist, sind 20 mM Hepes, die Medien zu puffern.</li>
		<li>Navigieren Sie zu einem Feld von transfizierten Zellen und visualisieren Sie das live-Bild der Zellen als durch die Kamera erworben und von der Datenerfassungs-Software auf dem Computer-Bildschirm mit dem RFP Laser angezeigt.</li>
		<li>Geben Sie nach Schritte 4.2.8-4.2.12 die Einstellungen für Prozentsatz Laser Power und Belichtung Zeit für den RFP-Laser. Halten Sie diese Werte so niedrig wie möglich, während noch in der Lage, das Fluoreszenzsignal zu erkennen.</li>
		<li>Mit einer positiven Kontrolle (Beispiele siehe Tabelle 3 ), folgen Schritte 4.2.8-4.2.12, geben Sie die Einstellungen für Prozentsatz Laser macht und Belichtung für das Laserlicht YFP probieren. Halten Sie diese Werte so gering wie möglich, während noch in der Lage, Venus Signal zu erkennen.</li>
		<li>Wählen Sie für jede Vertiefung der Platte eine Anzahl von unterschiedlichen Positionen, die eine oder mehrere Zellen, die mit dem Ausdruck der Reporters enthalten.</li>
		<li>Geben Sie das Zeitintervall zwischen den Einzelbildern Zeitraffer und totale Anzahl der Frames getroffen werden. Stellen Sie sicher, es ist Zeit, um die ausgewählten Positionen zu erwerben, bevor das nächste Bild ist zu achten.</li>
		<li>Jede Position erneut zu besuchen und zu korrigieren und den Fokus bei Bedarf aktualisieren.</li>
		<li>Um für fokale Drift zu korrigieren, die durch Veränderungen in der Temperatur oder externen Vibrationen entstehen können, schalten Sie den Fokus-Drift-Korrektur-System (falls vorhanden).</li>
		<li>Beginnen Sie den Zeitraffer und sichern Sie Ihre Daten.</li>
		<li>Analysieren Sie die Daten über verfügbare imaging-Software (Abbildung 5Movie 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Split fluoreszierende Proteine, Caspase induzierte Nähe zu messen. Split-Venus wurde für diese Technik gewählt, weil es sehr hell ist, photostabil und die Umfaltung ist sehr schnell 13. So kann die Analyse der Venus Umfaltung auf Caspase induzierte Nähe in der Nähe von Echtzeit-Schätzungen von Caspase Proteindynamik Interaktion bieten. Venus ist aufgeteilt in zwei leicht überlappende Fragmente, die N-Terminus von Venus (Venus-N oder VN) bestehe...

Die Caspase-Protease-Familie sind bekannt für ihre kritischen Rollen in Apoptose und angeborene Immunität 1. Wegen ihrer Bedeutung bestimmen, wann, wo und wie effizient bestimmte Caspasen aktiviert bieten entscheidende Einblicke in die Mechanismen der Caspase Aktivierung Wege. Die Bildgebung basierende Protokoll hier beschriebenen ermöglicht die Visualisierung der ersten Schritte in der Caspase-Kaskade Aktivierung. Diese Technik nutzt die dynamische Protein: Protein-Interaktionen, dass Laufwerk Caspase-Aktivierung.
Die Caspasen können in zwei Gruppen unterteilt werden: der Initiator Caspasen (Caspase-1, -2,-4-5, -8,-9,-10 und-12) und der Henker Caspasen (Caspase-3,-6 und-7). Der Henker Caspasen befinden sich in der Zelle als vorgeformte Dimere und werden durch Spaltung zwischen den großen und kleinen Untereinheit 2aktiviert. Wenn aktiviert, Spalten sie zahlreiche strukturelle und regulatorische Proteine wiederum Apoptose 3. Der Initiator Caspasen sind die ersten Caspasen in einen Pfad aktiviert werden und in der Regel die Aktivierung der Henker Caspasen auslösen. Im Gegensatz zum Henker Caspasen werden durch Dimerisierung 4,5Initiator Caspasen aktiviert. Diese Dimerisierung wird durch Rekrutierung von inaktiven Monomeren zu bestimmten hohem Molekulargewicht komplexe bekannt als Aktivierung Plattformen erleichtert. Montage der Aktivierung Plattformen unterliegt einer Reihe von spezifischen Protein: Protein-Interaktionen. Diese sind vermittelt durch konserviertes Protein Interaktion Motive in der proform Initiator Caspase vorhanden und gehören der Tod Domäne (DD), Tod-Effektor-Domäne (DED) und Caspase Recruitment Domain (CARD) 6 (Abb. 1A). Aktivierung-Plattformen umfassen in der Regel einen Rezeptor und eine Adapter-Protein. Der Rezeptor wird in der Regel bei der Bindung eines Liganden induziert eine Konformationsänderung, die die Oligomerisierung von zahlreichen Molekülen ermöglicht aktiviert. Der Rezeptor rekrutiert dann entweder die Caspase direkt oder Adapter-Moleküle, die wiederum die Caspase in die Anlage bringen. So kommen zahlreiche Caspase-Moleküle in der Nähe schönem Dimerisierung. Dies wird als induzierte Nähe Modell 7bezeichnet. Sobald dimerized, erfährt die Caspase Autoprocessing, die dazu dient, das aktive Enzym 4,8zu stabilisieren. Montage von Apaf1 Apoptosome wird z. B. durch Cytochrom c nach seiner Entlassung aus den Mitochondrien in einem Prozess namens mitochondrialen Außenmembran Permeabilisierung (MOMP) ausgelöst. Apaf1 Rekruten wiederum Caspase-9 durch eine Interaktion, die durch eine Karte in beiden Proteine 9vermittelt wird. Ähnlich wie Protein-Interaktionen führen in der Montage von CD95 Tod induzieren, komplexen Signalisierung (DISC), der zur Aktivierung der Caspase-8 führt; die PIDDosome, die Caspase-2 aktivieren können; und verschiedenen Inflammasome-komplexe, die Aktivierung der Caspase-1 10,11,12zu initiieren. So, sind Initiator Caspasen, spezifische Aktivierung Plattformen rekrutiert, durch einen gemeinsamen Mechanismus, wodurch induzierte Nähe und Dimerisierung, ohne die Aktivierung nicht erfolgt.
Caspase bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC) ist ein Imaging-basierte Test, der entwickelt wurde, um diesen ersten Schritt bei der Aktivierung von Initiator Caspasen Messen ermöglicht direkten Visualisierung der Caspase induzierte Nähe nach Aktivierung Plattform Montage. Diese Methode nutzt die Eigenschaften des geteilten fluoreszierenden Proteins Venus. Venus ist ein heller und mehr photostabilen Version gelb fluoreszierenden Proteins (YFP), die in zwei nicht-fluoreszierende und leicht überlappende Fragmente unterteilt werden kann: der N-Terminus von Venus (Venus N oder VN) und dem C-Terminus der Venus (Venus C oder VC). Diese Fragmente behalten die Fähigkeit zu entfalten und fluoreszierende wenn in unmittelbarer Nähe 13. Jedes Fragment Venus ist mit der prodomain der Caspase ist an der Aktivierung Plattform bindet den minimalen Teil der Caspase verschmolzen. Dadurch behalten die Caspasen nicht enzymatische Aktivität und daher ist die gleichzeitige Analyse der nachgeschalteten Ereignisse im Zusammenhang mit endogenen Veranstaltungen möglich. Die Venus Fragmente Zurückfaltung, wenn die Caspase-Prodomains zur Aktivierung Plattform rekrutiert und induzierte Nähe zu unterziehen. (Abbildung 1 b). Die daraus resultierende Venus Fluoreszenz lässt sich präzise und speziell die subzelluläre Lokalisation, die Kinetik und die Effizienz der Versammlung der Initiator Caspase Aktivierung Plattformen in einzelnen Zellen überwachen. Bilddaten können erworben werden, durch konfokale Mikroskopie oder standard Fluoreszenz-Mikroskopie und kann auf eine Reihe von verschiedenen Mikroskopie Ansätzen einschließlich angepasst werden: Zeitraffer imaging zu verfolgen Caspase-Aktivierung in Echtzeit; hochauflösende Bildgebung für die präzise Bestimmung der subzellulären Lokalisierung; und Endpunkt Quantifizierung der Effizienz der Aktivierung.
Diese Technik wurde zuerst entwickelt, um die Aktivierung von Caspase-214zu untersuchen. Während die Aktivierung Plattform für Caspase-2 angenommen wird, die PIDDosome, bestehend aus den Rezeptor PIDD (p53-induzierte Protein mit einer Domäne Tod) und der Adapter RAIDD (RIP-assoziierte ICH-1/CAD-3 homologen Protein mit einer Domäne Tod), PIDDosome-unabhängige Caspase-2 Aktivierung wurde berichtet. Dies deutet darauf hin, dass zusätzliche Aktivierung Plattformen für Caspase-2 15,16vorhanden. Trotz nicht zu wissen, die volle Komponenten der Aktivierung der Caspase-2-Plattform, hat die Caspase BiFC Technik für erfolgreiche Befragung der Caspase-2 Signalwege auf der molekularen Ebene 14,17erlaubt. Wir haben dieses Protokoll für die inflammatorischen Caspasen (Caspase-1,-4 und-5-12) auch erfolgreich angepasst 18 und im Prinzip der gleiche Ansatz sollte ausreichen, ebenso jede der verbleibenden Initiator Caspasen zu analysieren. Dieses Protokoll kann entsprechend angepasst werden, andere Wege zu untersuchen wurden Dimerisierung ist eine wichtige aktivierende Zeichen. STAT-Proteine werden zum Beispiel durch Dimerisierung nach Phosphorylierung von Janus Kinase (JAK) 19aktiviert. So konnte das BiFC System einsetzbar für STAT Aktivierung sowie viele andere Wege, die durch dynamische Proteininteraktionen geregelt zu visualisieren. Das folgende Protokoll bietet schrittweise Anleitungen für die Einführung der Reporter in Zellen sowie Methoden zur Bildaufnahme und Analyse.

<table><tbody><tr><td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td><td>Mattek</td><td>P06G-1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td><td>Millipore</td><td>FC010-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>OPTI MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VC plasmid</td><td>Addgene</td><td>49261</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VN plasmid</td><td>Addgene</td><td>49262</td><td></td></tr><tr><td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td><td></td><td></td><td>available by request from LBH</td></tr><tr><td>HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components</td><td></td><td></td><td>available by request from LBH</td></tr><tr><td>DsRed mito plasmid</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td>similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>2 Mercaptoethanol 1000X</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>q-VD-OPH</td><td>Apex Bio</td><td>A1901</td><td></td></tr></tbody></table>

lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation

Die Familie Caspase Proteasen spielen eine entscheidende Rolle in Apoptose und angeborene Immunität. Unter diesen eine Untergruppe, bekannt als Initiator Caspasen sind die ersten, die in diesen Bahnen aktiviert werden. Zu dieser Gruppe gehören Caspase-2-9-8, sowie die inflammatorischen Caspasen, Caspase-1,-4 und-5. Der Initiator Caspasen sind alle durch Dimerisierung nach der Einstellung zu bestimmten Multi-komplexe genannt Aktivierung Plattformen aktiviert. Caspase bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC) ist ein Imaging-basierte Ansatz dem geteilt fluoreszierende Proteine fusioniert, Initiator Caspasen verwendet, um die Rekrutierung von Initiator Caspasen zu ihrer Aktivierung-Plattformen und die daraus resultierenden visualisieren induzierte Nähe. Diese Fluoreszenz bietet eine Anzeige von einer der frühesten für Initiator Caspase Aktivierung erforderlichen Schritte. Mit einer Reihe von verschiedenen Mikroskopie-basierte Ansätze, bieten diese Technik quantitative Daten über die Effizienz der Caspase-Aktivierung auf einem Niveau der Bevölkerung sowie die Kinetik der Caspase-Aktivierung und die Größe und Anzahl der Aktivierung von caspase komplexe pro Zelle.

Ein Beispiel von Caspase-2 BiFC durch DNA-Schäden induzierte ist in Abbildung 3dargestellt. Camptothecin, eine Topoisomerase ich Inhibitor, wurde verwendet, um DNA-Schäden und Caspase-2 Aktivierung induzieren. Das rot fluoreszierende Protein mCherry diente als Reporter zu zeigen, dass die Zellen die BiFC Sonde auszudrücken und zu helfen, die Gesamtzahl der Zellen zu visualisieren. Venus Fluoreszenz ist grün dargestellt und die großen Puncta stellen Caspa...

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Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Dieses Protokoll beschreibt Caspase bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC); eine Imaging-basierte Methode, die verwendet werden, um induzierte Nähe der Initiator Caspasen, zu visualisieren, das ist der erste Schritt in ihre Aktivierung.

Die Wege zur Aktivierung der Caspase bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung mit Beleuchtung

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

lighting-up-pathways-to-caspase-activation-using-bimolecular

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.0K Aufrufe.  Baylor College of Medicine. Dieses Protokoll beschreibt Caspase bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC); eine Imaging-basierte Methode, die verwendet werden, um induzierte Nähe der Initiator Caspasen, zu visualisieren, das ist der erste Schritt in ihre Aktivierung.

Serie: Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and decreases waste in costs and reagents. Here we describe optimization of a multiplex assay to assess apoptosis following a palmitic acid (PA) challenge in an in vitro hypothalamic model, using both fluorescent and luminescent based assays to measure viable cell counts and caspase-3/7 activity in a 96-well microtiter plate format. Following PA challenge, viable cells were determined by a resazurin-based fluorescent assay. Caspase-3/7 activity was then determined using a luminogenic substrate, DEVD, and normalized to cell number. This multiplexing assay is a useful technique for determining change in caspase activity following an apoptotic stimulus, such as saturated fatty acid challenge. The saturated fatty acid PA can increase hypothalamic oxidative stress and apoptosis, indicating the potential importance of assays such as that described here in studying the relationship between saturated fatty acids and neuronal function.

Multiplex assays can provide beneficial information for basic cellular mechanisms&#160;and eliminate waste of reagents and unnecessary repetitive experiments. We describe here a multiplex caspase-3/7 activity assay, using fluorescent- and luminescent-based methods, to determine cell viability in an in vitro hypothalamic model following oxidative challenge with palmitic acid.

Verwendung eines Caspase Multiplexing-Test zur Apoptose in einer Zelle Hypothalamus Modell ermitteln

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

Messung der Caspase-Aktivität mit einem fluorometrischen Assay oder einer Durchflusszytometrie

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Biochemie

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Biologie

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death processes that are generally assumed to be intrinsically irreversible. Promoting anastasis could in principle rescue or preserve injured cells that are difficult to replace such as cardiomyocytes or neurons, thereby facilitating tissue recovery. Conversely, suppressing anastasis in cancer cells, undergoing apoptosis after anti-cancer therapies, may ensure cancer cell death and reduce the chances of recurrence. However, these studies have been hampered by the lack of tools for tracking the fate of cells that undergo anastasis in live animals. The challenge is to identify the cells that have reversed the cell death process despite their morphologically normal appearance after recovery. To overcome this difficulty, we have developed Drosophila and mammalian CaspaseTracker biosensor systems that can identify and permanently track the anastatic cells in vitro or in vivo. Here, we present in vivo protocols for the generation and use of the CaspaseTracker dual biosensor system to detect and track anastasis in Drosophila melanogaster after transient exposure to cell death stimuli. While conventional biosensors and protocols can label cells actively undergoing apoptotic cell death, the CaspaseTracker biosensor can permanently label cells that have recovered after caspase activation - a hallmark of late-stage apoptosis, and simultaneously identify active apoptotic processes. This biosensor can also track the recovery of the cells that attempted other forms of cell death that directly or indirectly involved caspase activity. Therefore, this protocol enables us to continuously track the fate of these cells and their progeny, facilitating future studies of the biological functions, molecular mechanisms, physiological and pathological consequences, and therapeutic implications of anastasis. We also discuss the appropriate controls to distinguish cells that undergo anastasis from those that display non-apoptotic caspase activity in vivo.

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis is technically challenging to detect in vivo because the cells that have reversed the cell death process can be morphologically indistinguishable from normal healthy cells. Here we describe protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis in live animals by using our newly developed in vivo CaspaseTracker biosensor system.

Erkennung von Anastasis In Vivo durch CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Medizin

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

Visualisierung von entzündlichen Kaspasen induzierter Nähe in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Immunologie und Infektion

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is the initiation of innate immune programmed cell death (PCD) to eliminate infected or damaged cells and propagate immune responses. However, excess PCD is associated with inflammation and pathology. Therefore, understanding the activation and regulation of PCD is a central aspect of characterizing innate immune responses and identifying new therapeutic targets across the disease spectrum.
This protocol provides methods for characterizing innate immune PCD activation by monitoring caspases, a family of cysteine-dependent proteases that are often associated with diverse PCD pathways, including&#160;apoptosis,&#160;pyroptosis, necroptosis, and PANoptosis. Initial reports characterized caspase-2, caspase-8, caspase-9, and caspase-10 as initiator caspases and caspase-3, caspase-6, and caspase-7 as effector caspases in apoptosis, while later studies found the inflammatory caspases, caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-11, drive pyroptosis. It is now known that there is extensive crosstalk between the caspases and other innate immune and&#160;cell death molecules across the previously defined PCD pathways, identifying a key knowledge gap in the mechanistic understanding of innate immunity and PCD and&#160;leading to the characterization of PANoptosis. PANoptosis is a unique innate immune inflammatory PCD pathway regulated by PANoptosome complexes, which integrate components, including caspases,&#160;from other cell death pathways.
Here, methods for assessing the activation of caspases in response to various stimuli are provided. These methods allow for the characterization of PCD pathways both in vitro and in vivo, as activated caspases undergo proteolytic cleavage that can be visualized by western blotting using optimal antibodies and blotting conditions. A protocol and western blotting workflow have been established that allow for the assessment of the activation of multiple caspases from the same cellular population, providing a comprehensive characterization of the PCD processes. This method can be applied across research areas in development, homeostasis, infection, inflammation, and cancer to evaluate PCD pathways throughout cellular processes in health and disease.

This protocol describes a comprehensive method for assessing caspase activation (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, and caspase-11) in response to both in vitro and in vivo (in mice) models of infection, sterile insults, and cancer to determine the initiation of cell death pathways, such as pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and PANoptosis.

Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Strategien für die Spurhaltung Anastasis, einer Zelle Überleben Phänomen, das Apoptose Kehrt

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

To detect healthy cells in whole animals that contain low levels of caspase activity, the highly sensitive biosensor designated CaspaseTracker was generated for Drosophila. Caspase-dependent biosensor activity is detected in long-lived healthy cells throughout the internal organs of adult animals reared under optimized conditions in the absence of death stimuli.

In - vivo - Biosensor - Spuren Non-apoptotischen Caspase - Aktivität in Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

Source: Bol&#237;var, B. E., et. al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/63162">Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates the activation of caspase proteins in human macrophages using bimolecular fluorescence complementation reporter proteins. The pro-domains of caspase-1 are fused with non-fluorescent fragments of Venus proteins, which are recruited to inflammasome complexes. The proximity of inflammasomes induces the refolding and fluorescence of Venus fragments, confirming caspase activation in the macrophages.

Visualisierung der Caspase-Aktivierung in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Source: Bol&#237;var, B. E., et. al., Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. 
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JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immune Response

Immune Modulation

Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/62842">Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video describes the chemiluminescence-based western blotting of immunoprecipitated lysates. The technique helps determine protein processing and activation. The chemiluminescent signal detected is proportional to the level of protein processing during its activation.

Chemilumineszenz-Western-Blot-Assay für die Proteinverarbeitung

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex. J. ...