Nos gustaría reconocer a todos los miembros anteriores del laboratorio Bouchier-Hayes que contribuyeron al desarrollo de esta técnica. Este trabajo fue financiado en parte por el Premio de piloto pediátrica Hospital infantil Texas a LBH. Agradecemos a Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) permiso para incluir los datos publicados en colaboración con su equipo. El desarrollo de los reactivos descritos fue apoyado por la citometría y base de clasificación de la célula en el Baylor College of Medicine con la financiación de los NIH (NIAID P30AI036211 NCI P30CA125123 y NCRR S10RR024574) y la asistencia de Joel M. Sederstrom

1. preparación de células y platos de la cultura
Nota: Realice los pasos 1-3 en una campana de flujo laminar de cultivo de tejidos. Guantes.
<ol><li>Si usando platos de fondo de vidrio, capa del vidrio con fibronectina. Si utiliza platos de plástico, vaya al paso 1.2.<ol>
<li>Hacer una solución de 0,1 mg/mL de fibronectina: diluir 1 mL de solución de fibronectina de 1 mg/mL en 9 mL de 1 X PBS.</li>
		<li>Cubrir el fondo del vidrio de cada pozo con 0.5-1 mL de fibronectina e incubar durante 1-5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Usando una pipeta, recoger la solución de fibronectina y almacenar a 4 ° C. Nota: La solución de fibronectina puede reutilizarse varias veces.</li>
		<li>Lavar el vaso una vez con 1-2 mL 1 X PBS y aspirar de PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placa de 1 x 105 células por pocillo de una placa de 6 pozos en 2 mL de los medios de cultivo celular adecuado (ver tabla 1 para los números de celulares para diferentes pozos de tamaño). Si utiliza una línea celular que expresa estable los componentes de centro de caspasa (ver discusión), placa de 2 x 105 células y proceder al tratamiento paso (paso 3).</li>
	<li>Permitir que las células se adhieran a la placa durante la noche a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos.</li>
</ol>2. transfección de las células para introducir los componentes de centro de caspasa
<ol><li>Transfectar las células con el reactivo de transfección adecuada. Nota: Este protocolo esboza las instrucciones para Lipofectamine 2000, que ha sido optimizada para toxicidad mínima. Este protocolo se ha utilizado con éxito en células Hela, células MCF7 y LN18 células. Si usa más reactivos de transfección siguen las instrucciones del fabricante y optimización según sea necesario.<ol>
<li>Añadir 12 μl del reactivo de transfección a 750 μl de medios reducidos del suero en un tubo estéril.</li>
		<li>Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
		<li>Añadir 10 ng de un plásmido reportero (un plasmid codificando una proteína fluorescente, e.g. rojo proteína fluorescente [convocatoria], que se etiqueta las células transfected) a un tubo de 1,5 mL estériles para cada pozo a ser transfectadas.</li>
		<li>Añadir 20 ng de cada plásmido centro de caspasas (por ejemplo, 20 ng de caspasa-2 prodomain [C2 Pro]-VC y 20 ng de C2 Pro-VN) a cada tubo (tabla 2).</li>
		<li>Traer cada tubo hasta un volumen total de 100 μl mediante la adición de suero reduce los medios de comunicación.</li>
		<li>Utilizando una pipeta de p200, añadir 100 μl de solución de reactivo de transfección de paso 2.1.2 a la mezcla de plásmido en forma gota a gota.</li>
		<li>Incubar la mezcla de reactivo de transfección de plásmidos por 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspire los medios de comunicación de las células usando una pipeta o con la succión y luego, usando una pipeta p1000, pipetear 800 μl de medios libres de suero suavemente hacia abajo al lado del pozo.</li>
		<li>Utilizando una pipeta de p200, añadir 200 μL del ADN-lípido complejo gota a gota a cada pocillo.</li>
		<li>Incubar las células en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C durante 3 horas.</li>
		<li>Teniendo cuidado de no interrumpir la monocapa, retire los medios libres de suero que contiene los complejos DNA-lipídica por aspiración mediante succión o con una pipeta.</li>
		<li>Pipetear 2 mL de medio de crecimiento completo precalentado (37 ° C) suavemente por el lado de cada pozo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incube las células a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos para 24-48 h para la expresión de la proteína óptimo.</li>
</ol>3. inducción de la activación de caspasas
<ol><li>Tratar con un fármaco o estímulo que induce la caspasa activación aproximadamente 24 h después de la transfección.<ol>
<li>Añadir la concentración deseada del fármaco a la caliente (37 ° C) proyección de imagen medios (crecimiento completo suplementado con Hepes [20 mM, pH 7.2-7.5] y 2-Mercaptoetanol [55 μm]) y mezclar suavemente (tabla 3).</li>
		<li>Aspire los medios de comunicación de las células usando una pipeta o con la succión y luego, usando una pipeta, pipeta 2 mL de la solución 3.1.1 suavemente hacia abajo al lado del pozo.</li>
		<li>Añadir imágenes medios de comunicación sin la droga a un pocillo como control sin tratamiento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar las células en una incubadora a 37 ° C de cultivo de tejidos o proceder a paso 4.3 para un experimento de Time-lapse.</li>
</ol>4. Adquisición de datos de Caspase BiFC
<ol><li>
Caspase BiFC para adquisición de punto de vez
	<ol>
<li>Encienda el microscopio y fuente de luz fluorescente siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Encontrar las células bajo el filtro de la RFP y enfoque en la fluorescencia del gen reportero.</li>
		<li>Utilizando un contador de mano cuenta, contar todas las celdas de RFP-positivo en el campo visual. Anotar el número.</li>
		<li>Manteniendo el mismo campo visual, cambiar el filtro GFP (o filtro YFP si está disponible) y, usando un contador de mano cuenta, contar el número de eritrocitos que también son verdes (Venus-positivo). Alternar entre los dos filtros para asegurar que sólo los eritrocitos son evaluados para Venus-positividad. Anotar el número (figura 3).</li>
		<li>Contar por lo menos 100 células de RFP-positivas de cada una de tres áreas individuales de la placa.</li>
		<li>En cada área, calculando el porcentaje de células transfectada Venus-positivo (es decir, las células rojas que también son de color verdes). Promedio de los porcentajes resultantes para obtener la desviación estándar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Proyección de imagen tridimensional de la caspasa centro
	<ol>
<li>Encienda el microscopio siguiendo las instrucciones del fabricante y ejecutar el programa de adquisición.</li>
		<li>Seleccione la x 60 o 63 x aceite objetivo y coloque una gota de aceite en el objetivo</li>
		<li>Coloque la placa de cultivo en la platina del microscopio usando el soporte de la placa correcta.</li>
		<li>Con una fuente de luz de epifluorescencia y el ocular del microscopio o el láser confocal y la pantalla del ordenador, vaya a un campo de interés.</li>
		<li>Se centran en la fluorescencia del reportero con el láser RFP o filtro.</li>
		<li>Si epifluorescencia se ha utilizado hasta este punto, cambiar la fuente de luz para el láser confocal y visualizar la imagen en vivo de las células como adquiridos por la cámara y visualizado por el software de adquisición en la pantalla del ordenador.</li>
		<li>Usando el control de joystick y la rueda de enfoque, afinar el enfoque y la posición de las células para que las células están en el centro del visor. Seleccione las celdas que están separadas unos de otros y no se solapan.</li>
		<li>Entrada de la energía del laser porcentaje al 50% y el tiempo de exposición a 100 ms para Venus y RFP como punto de partida para determinar la configuración óptima para el experimento.</li>
		<li>Encienda la captura vivo e inspeccione la imagen resultante y los histogramas de pantalla acompañamiento para ambos canales.</li>
		<li>Si la señal es baja y la imagen es difícil de hacer, aumentar el tiempo porcentaje láser potencia y/o exposición en incrementos de hasta que la señal en la imagen se ve bien.</li>
		<li>Asegúrese de que la señal no alcanza la saturación. Inspeccione el histograma de la pantalla para asegurarse de que un pico distinto es visible para cada fluor. Si el pico abarca la pantalla histograma completo, entrada de ajustes más bajos láser potencia y exposición (figura 2).</li>
		<li>Visualizar las células control (no tratados o no transfectadas) bajo las mismas condiciones para que la señal sea específica. Nota: Solo color transfectants puede utilizarse también para control de crossover, pero si las señales son espacialmente distintas (por ejemplo, mitocondrial y citosólica) esto no es necesario.</li>
		<li>Seleccione o abra el módulo de pila de Z en el software del microscopio.</li>
		<li>Usando la perilla de enfoque, aproximado de la posición focal correspondiente al centro de la célula.</li>
		<li>Ajuste el foco en una dirección hasta que la celda no está visible, seleccione esta como la posición superior.</li>
		<li>Ajuste el enfoque en la dirección opuesta hasta que la célula otra vez ya no sea visible y seleccione esta como la posición inferior.</li>
		<li>Elegir el tamaño de paso óptimo (generalmente aproximadamente 20 μm) y empezar la adquisición para indicar a la cámara para tomar automáticamente una sola imagen en cada canal en cada uno de los 20 pasos μm entre las posiciones superior e inferior.</li>
		<li>Utilizar software de Render 3D para reconstruir la imagen 3D (figura 4película 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imágenes de Time-lapse de la caspasa centro
	<ol>
<li>Al menos 1 h antes del experimento, encienda el microscopio y ajustar la temperatura a 37 ° C.</li>
		<li>Seleccione el 40 x, 60 x u objetivo de aceite x 63 y coloque una gota de aceite sobre el objetivo.</li>
		<li>Coloque la placa de cultivo en la platina del microscopio usando el soporte de la placa correcta.</li>
		<li>Si una fuente de CO2 está disponible, coloque el dispositivo de entrega de CO2 (generalmente una tapa de plexiglás al tubo que entrega el CO2) en la parte superior del sostenedor de la placa. Fijar el CO2 nivel 5% y encienda el CO2 controlador dentro del software. Si no hay una fuente de CO2 , son 20 mM Hepes para proteger los medios de comunicación.</li>
		<li>Desplácese a un campo de células transfected y visualizar la imagen en vivo de las células como adquiridos por la cámara y visualizado por el software de adquisición en la pantalla del ordenador usando el laser de la RFP.</li>
		<li>Siguiendo pasos 4.2.8-4.2.12, entrada de la configuración de tiempo de exposición y poder de láser porcentaje para el láser RFP. Mantener estos valores tan bajos como sea posible mientras que todavía siendo capaces de detectar la señal fluorescente.</li>
		<li>Utilizando un control positivo de la muestra (ver tabla 3 para los ejemplos), siga 4.2.8-4.2.12 pasos para la configuración de entrada para tiempo de exposición y poder de láser porcentaje para la luz de láser YFP. Mantener estos valores tan bajos como sea posible mientras que todavía siendo capaz de detectar la señal de Venus.</li>
		<li>Para cada pocillo de la placa, elija un número de diversas posiciones que contengan una o más células expresando el reportero.</li>
		<li>Entrada del intervalo de tiempo entre cada fotograma del time-lapse y total número de marcos a tomarse. Asegúrese de que hay tiempo para adquirir todas las posiciones seleccionadas antes de tomarse el siguiente fotograma.</li>
		<li>Volver a visitar cada posición y corregir y actualizar el enfoque según sea necesario.</li>
		<li>Para corregir para la deriva focal que puede resultar de cambios de temperatura o las vibraciones externas, encienda el sistema de la corrección de la deriva del foco (si está disponible).</li>
		<li>Comienza el lapso de tiempo y guardar los datos.</li>
		<li>Analizar los datos utilizando el software de imágenes disponible (figura 5película 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+mechanisms.">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li><li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+caspase+activation.">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li><li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CASBAH:+a+searchable+database+of+caspase+substrates.">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li><li>Baliga, B. C., Read, S. 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Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Este protocolo trata el uso de proteínas fluorescentes split para medir caspasas inducida por proximidad. Venus de Split fue elegida para esta técnica porque es muy brillante, altamente Fotoestables y el refolding es rápido 13. Así, el análisis de Venus refolding sobre proximidad de caspasas inducida puede proporcionar cerca de las estimaciones en tiempo real de la dinámica de interacción de la proteína caspasa. Venus se divide en dos fragmentos ligeramente superpuestas, la terminal N de V...

La familia de proteasas caspasas es conocida por su crítico papel en apoptosis e inmunidad innata 1. Debido a su importancia, determinar cuándo, dónde y sobre la eficacia específicas caspasas son activadas puede proporcionar información crucial sobre los mecanismos de la caspasa vías de activación. El protocolo basado en proyección de imagen se describe aquí permite la visualización de los pasos más tempranos en la cascada de activación de la caspasa. Esta técnica aprovecha las interacciones proteína: proteína dinámica activación de la caspasa en coche.
Las caspasas pueden dividirse en dos grupos: los iniciadores de caspasas (caspasa-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 y -12) y el verdugo caspasas (caspasa-3, -6 y -7). El verdugo caspasas están presentes en la célula como dímeros preformadas y son activadas por clivaje entre las subunidades grandes y pequeñas 2. Cuando se activa, hienden numerosas proteínas estructurales y reguladoras, dando como resultado apoptosis 3. Los iniciadores de caspasas son las caspasas primera a activarse en un camino y generalmente desencadenan la activación de las caspasas de verdugo. En contraste con verdugo caspasas, iniciadores de caspasas son activadas por dimerización 4,5. Esta dimerización facilita el reclutamiento de monómeros inactivos a complejos de peso molecular grande específico conocidos como plataformas de activación. Montaje de plataformas de activación se rige por una serie de interacciones proteína: proteína específica. Estas son mediadas por motivos de interacción proteína conservada presentes en proform de lo caspase del iniciador e incluyen el dominio de la muerte (DD), dominio efector de muerte (DED) y caspasas reclutamiento dominio (CARD) 6 (figura 1A). Plataformas de activación generalmente incluyen una proteína receptora y una proteína del adaptador. El receptor se activa generalmente en Unión de un ligando, induce un cambio conformacional que permite la Oligomerización de numerosas moléculas. El receptor entonces recluta o la caspasas directamente o moléculas del adaptador que a su vez la caspasa al complejo. Así, numerosas moléculas caspasa entran en proximidad, que permite la dimerización. Esto se conoce como el modelo de proximidad inducida por 7. Una vez dimerized, la caspasa experimenta autoprocessing, que sirve para estabilizar la enzima activa 4,8. Por ejemplo, el montaje del apoptosome Apaf1 es accionada por citocromo c tras su liberación de la mitocondria en un proceso llamado permeabilización mitocondrial membrana externa (MOMP). Apaf1 alternadamente recluta a caspasa-9 a través de una interacción que es mediada por una tarjeta presente en dos de las proteínas 9. Similar resultado de interacciones de proteínas en la Asamblea del CD95 muerte induce señalización complejo (disco) que conduce a la activación de la caspasa-8; el PIDDosome, que puede activar la caspasa-2; y varios complejos de inflammasome que inician la activación de la caspasa-1 10,11,12. Por lo tanto, iniciadores de caspasas son reclutados a plataformas de activación específico por un mecanismo común en proximidad inducida y dimerización, sin la cual no se producirá la activación.
Caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro) es un ensayo basado en la proyección de imagen que se desarrolló para medir este primer paso en la activación de las caspasas de iniciador, que permite la visualización directa de la proximidad de caspasas inducida tras la plataforma de activación Asamblea. Este método aprovecha las propiedades de la proteína fluorescente split Venus. Venus es un más brillante y más Fotoestables versión de proteína fluorescente amarilla (YFP) que puede dividirse en dos fragmentos no fluorescente y ligeramente superpuestos: el N-terminal de Venus (Venus N o VN) y el C-terminal de Venus (Venus C o VC). Estos fragmentos conservan la capacidad de replegar y fluorescente en cerca de 13. Cada fragmento de Venus está fusionada a la prodomain de las caspasas, que son la mínima porción de la caspasa que se une a la plataforma de activación. Esto asegura que las caspasas no retienen actividad enzimática y por tanto es posible el análisis simultáneo de posteriores eventos asociados con eventos endógenos. Venus los fragmentos doblados cuando las prodomains caspasas son reclutados a la plataforma de activación y experimentar la proximidad inducida. (Figura 1B). La fluorescencia resultante de Venus puede utilizarse con precisión y específicamente monitorear la localización subcelular, la cinética y la eficacia del conjunto de plataformas de activación de caspasas de iniciador en las células. Datos de la proyección de imagen puede ser adquirido por microscopía confocal o por microscopía de fluorescencia estándar y puede ser adaptado a una serie de microscopía diferentes incluyendo: Time-lapse de imágenes para el seguimiento de la activación de caspasas en tiempo real; proyección de imagen de alta resolución para la determinación precisa de la localización subcelular; y cuantificación de la punto final de eficacia de la activación.
Esta técnica se desarrolló inicialmente para investigar la activación de la caspasa-214. Mientras que la plataforma de activación de la caspasa-2 se cree que el PIDDosome, compuesto por el receptor PIDD (inducida por p53 proteína con un dominio de la muerte) y el adaptador RAIDD (RIP-asociado de ICH-1/CAD-3 proteína homóloga con un dominio de la muerte), Se ha reportado activación de caspasa-2 PIDDosome-independiente. Esto sugiere que las plataformas de activación adicional para la caspasa-2 existen 15,16. A pesar de no saber los componentes completos de la plataforma de activación de la caspasa-2, caspasa centro técnica ha permitido eficazmente los interrogatorios de las vías de señalización de caspasa-2 en el nivel molecular 14,17. También hemos adaptado este protocolo para las caspasas inflamatoria (caspasa-1, -4, -5 y -12) 18 y, en principio, el mismo enfoque debería ser suficiente analizar del mismo modo cada uno de los restantes caspasas iniciador. Este protocolo de manera similar podría ser adaptado investigar otras vías era dimerización es una importante señal activadora. Por ejemplo, las proteínas STAT se activan por dimerización por fosforilación de Janus quinasa (JAK) 19. Así, el sistema de centro podría utilizarse para visualizar tendencia activación así como muchas otras vías regulados por las interacciones de la dinámica de la proteína. El siguiente protocolo proporciona instrucciones paso a paso para la introducción de los reporteros en las células, así como metodologías para el análisis y la adquisición de la imagen.

<table><tbody><tr><td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td><td>Mattek</td><td>P06G-1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td><td>Millipore</td><td>FC010-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>OPTI MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VC plasmid</td><td>Addgene</td><td>49261</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VN plasmid</td><td>Addgene</td><td>49262</td><td></td></tr><tr><td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td><td></td><td></td><td>available by request from LBH</td></tr><tr><td>HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components</td><td></td><td></td><td>available by request from LBH</td></tr><tr><td>DsRed mito plasmid</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td>similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>2 Mercaptoethanol 1000X</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>q-VD-OPH</td><td>Apex Bio</td><td>A1901</td><td></td></tr></tbody></table>

lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation

La familia de caspasas de proteasas juega un papel esencial en la inmunidad innata y la apoptosis. Entre ellos, un subgrupo conocido como iniciadores de caspasas son los primeros en activarse en estas vías. Este grupo incluye a caspasa-2, -8, -9, como la inflamatoria caspasas caspasa-1, -4 y -5. Todos los iniciadores de caspasas son activadas por dimerización después de reclutamiento a complejos de multiproteínas específicos llamados plataformas de activación. Caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro) es un enfoque basado en la proyección de imagen de donde se dividen proteínas fluorescentes fusionadas al iniciador de caspasas se utilizan para visualizar el reclutamiento de las caspasas de iniciador a sus plataformas de activación y la resultante proximidad inducida. Esta fluorescencia proporciona una lectura de uno de los primeros pasos necesarios para la activación de caspase del iniciador. Utilizando un número de diferentes enfoques basados en la microscopía, esta técnica puede proporcionar datos cuantitativos sobre la eficacia de la activación de caspasas en un nivel de población, así como la cinética de la activación de caspasas y el tamaño y número de activación de la caspasa complejos de forma por la célula.

En la figura 3se muestra un ejemplo de centro de caspasa-2 inducida por daño en el ADN. Camptotecina, una topoisomerasa I inhibidor, fue utilizado para inducir daño y caspasa-2 activación de ADN. La proteína fluorescente roja mCherry fue utilizado como reportero para demostrar que las células expresan la sonda del centro y para ayudar a visualizar el número total de células. Fluorescencia de Venus se muestra en verde y el orificio grande representan ca...

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Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Este protocolo describe caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro); un método basado en la proyección de imagen que se puede utilizar para visualizar la proximidad inducida de las caspasas de iniciador, que es el primer paso para su activación.

Iluminación de las vías para la activación de caspasas mediante complementación Bimolecular de la fluorescencia

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

lighting-up-pathways-to-caspase-activation-using-bimolecular

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.0K vistas.  Baylor College of Medicine. Este protocolo describe caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro); un método basado en la proyección de imagen que se puede utilizar para visualizar la proximidad inducida de las caspasas de iniciador, que es el primer paso para su activación.

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Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and decreases waste in costs and reagents. Here we describe optimization of a multiplex assay to assess apoptosis following a palmitic acid (PA) challenge in an in vitro hypothalamic model, using both fluorescent and luminescent based assays to measure viable cell counts and caspase-3/7 activity in a 96-well microtiter plate format. Following PA challenge, viable cells were determined by a resazurin-based fluorescent assay. Caspase-3/7 activity was then determined using a luminogenic substrate, DEVD, and normalized to cell number. This multiplexing assay is a useful technique for determining change in caspase activity following an apoptotic stimulus, such as saturated fatty acid challenge. The saturated fatty acid PA can increase hypothalamic oxidative stress and apoptosis, indicating the potential importance of assays such as that described here in studying the relationship between saturated fatty acids and neuronal function.

Multiplex assays can provide beneficial information for basic cellular mechanisms&#160;and eliminate waste of reagents and unnecessary repetitive experiments. We describe here a multiplex caspase-3/7 activity assay, using fluorescent- and luminescent-based methods, to determine cell viability in an in vitro hypothalamic model following oxidative challenge with palmitic acid.

El uso de una Multiplexación Ensayo de la caspasa para determinar la apoptosis en un modelo de célula hipotalámica

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Investigación

Neurociencias

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

Medición de la actividad de las caspasas mediante un ensayo fluorométrico o citometría de flujo

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Bioquímica

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

Fluorescencia de Complementación bimolecular

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Biología

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death processes that are generally assumed to be intrinsically irreversible. Promoting anastasis could in principle rescue or preserve injured cells that are difficult to replace such as cardiomyocytes or neurons, thereby facilitating tissue recovery. Conversely, suppressing anastasis in cancer cells, undergoing apoptosis after anti-cancer therapies, may ensure cancer cell death and reduce the chances of recurrence. However, these studies have been hampered by the lack of tools for tracking the fate of cells that undergo anastasis in live animals. The challenge is to identify the cells that have reversed the cell death process despite their morphologically normal appearance after recovery. To overcome this difficulty, we have developed Drosophila and mammalian CaspaseTracker biosensor systems that can identify and permanently track the anastatic cells in vitro or in vivo. Here, we present in vivo protocols for the generation and use of the CaspaseTracker dual biosensor system to detect and track anastasis in Drosophila melanogaster after transient exposure to cell death stimuli. While conventional biosensors and protocols can label cells actively undergoing apoptotic cell death, the CaspaseTracker biosensor can permanently label cells that have recovered after caspase activation - a hallmark of late-stage apoptosis, and simultaneously identify active apoptotic processes. This biosensor can also track the recovery of the cells that attempted other forms of cell death that directly or indirectly involved caspase activity. Therefore, this protocol enables us to continuously track the fate of these cells and their progeny, facilitating future studies of the biological functions, molecular mechanisms, physiological and pathological consequences, and therapeutic implications of anastasis. We also discuss the appropriate controls to distinguish cells that undergo anastasis from those that display non-apoptotic caspase activity in vivo.

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis is technically challenging to detect in vivo because the cells that have reversed the cell death process can be morphologically indistinguishable from normal healthy cells. Here we describe protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis in live animals by using our newly developed in vivo CaspaseTracker biosensor system.

Detección de Anastasis en Vivo por CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Medicina

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

Visualización de la proximidad inducida por caspasas inflamatorias en macrófagos derivados de monocitos humanos

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Inmunología e Infección

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is the initiation of innate immune programmed cell death (PCD) to eliminate infected or damaged cells and propagate immune responses. However, excess PCD is associated with inflammation and pathology. Therefore, understanding the activation and regulation of PCD is a central aspect of characterizing innate immune responses and identifying new therapeutic targets across the disease spectrum.
This protocol provides methods for characterizing innate immune PCD activation by monitoring caspases, a family of cysteine-dependent proteases that are often associated with diverse PCD pathways, including&#160;apoptosis,&#160;pyroptosis, necroptosis, and PANoptosis. Initial reports characterized caspase-2, caspase-8, caspase-9, and caspase-10 as initiator caspases and caspase-3, caspase-6, and caspase-7 as effector caspases in apoptosis, while later studies found the inflammatory caspases, caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-11, drive pyroptosis. It is now known that there is extensive crosstalk between the caspases and other innate immune and&#160;cell death molecules across the previously defined PCD pathways, identifying a key knowledge gap in the mechanistic understanding of innate immunity and PCD and&#160;leading to the characterization of PANoptosis. PANoptosis is a unique innate immune inflammatory PCD pathway regulated by PANoptosome complexes, which integrate components, including caspases,&#160;from other cell death pathways.
Here, methods for assessing the activation of caspases in response to various stimuli are provided. These methods allow for the characterization of PCD pathways both in vitro and in vivo, as activated caspases undergo proteolytic cleavage that can be visualized by western blotting using optimal antibodies and blotting conditions. A protocol and western blotting workflow have been established that allow for the assessment of the activation of multiple caspases from the same cellular population, providing a comprehensive characterization of the PCD processes. This method can be applied across research areas in development, homeostasis, infection, inflammation, and cancer to evaluate PCD pathways throughout cellular processes in health and disease.

This protocol describes a comprehensive method for assessing caspase activation (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, and caspase-11) in response to both in vitro and in vivo (in mice) models of infection, sterile insults, and cancer to determine the initiation of cell death pathways, such as pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and PANoptosis.

Evaluación de la activación de la caspasa para evaluar la muerte celular inmune innata

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Estrategias para Anastasis Seguimiento, una célula de supervivencia Fenómeno que Invierte Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

To detect healthy cells in whole animals that contain low levels of caspase activity, the highly sensitive biosensor designated CaspaseTracker was generated for Drosophila. Caspase-dependent biosensor activity is detected in long-lived healthy cells throughout the internal organs of adult animals reared under optimized conditions in the absence of death stimuli.

En Vivo biosensor Pistas de apoptosis no caspasa actividad en Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

Source: Bol&#237;var, B. E., et. al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/63162">Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates the activation of caspase proteins in human macrophages using bimolecular fluorescence complementation reporter proteins. The pro-domains of caspase-1 are fused with non-fluorescent fragments of Venus proteins, which are recruited to inflammasome complexes. The proximity of inflammasomes induces the refolding and fluorescence of Venus fragments, confirming caspase activation in the macrophages.

Visualización de la activación de caspasas en macrófagos derivados de monocitos humanos

Source: Bol&#237;var, B. E., et. al., Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. 
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JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immune Response

Immune Modulation

Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/62842">Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video describes the chemiluminescence-based western blotting of immunoprecipitated lysates. The technique helps determine protein processing and activation. The chemiluminescent signal detected is proportional to the level of protein processing during its activation.

Ensayo de Western Blot quimioluminiscente para el procesamiento de proteínas

Source: Hillert-Richter, L. K. et al., Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex. J. ...