Name: detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor
Uploaded: 2018-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 20 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor at JoVE.com

Wir danken Darren Obbard für Drosophila Bild in Abbildung 3 und video Manuskript; J. Marie Hardwick, Wade Gibson und Heather M. Lamb für wertvolle Diskussion dieser Handschrift. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright gewähren 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation Fellowship (H.L.T.) und NCI K22 gewähren CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang war ein Shurl und Kay Curci Foundation Fellow der Life Sciences Research Foundation (2014-2017).

(1) Vorbereitung der CaspaseTracker Biosensor fliegen
<ol><li>Betäuben Sie fliegen mit CO2zu, und verwenden Sie einen Pinsel, 7-10 Caspase-Sensitive Gal4 (DQVD)19 jungfräulichen Weibchen und 7 bis 10 G-Spur53 Gal4 Reporter junge männliche fliegen (oder umgekehrt) in der gleichen Flasche mit fliegen Essen und frische Hefe Paste übertragen. Hinweis: Kreuz von Caspase-Sensitive (DQVD) Gal4 und G-Spur fliegen erzeugt CaspaseTracker Nachkommen fliegen. Kreuz des Caspase -insensiblen (DQVA)19 Gal4 und G-Spur fliegen, erhalten Negativkontrolle fliegt (siehe Diskussion). Frische Hefe Paste dient als Proteinquelle, Ei-Produktion, zu verbessern, so dass die Anzahl der Nachkommen erhöht. Wählen Sie jungfräuliche Weibchen und junge Männchen fliegt nach ihren Phänotypen54.</li>
	<li>3 bis 7 Tagen inkubieren Sie fliegen bei 18 Grad Celsius (oC) während des Kreuzes und übertragen Sie dann die fliegen zu einem neuen Fläschchen zum Einrichten eines neuen Kreuzes bei 18 ° C. Weiterhin der Originalflasche bei 18 ° C inkubieren, bis Nachkommen Eclose fliegt. Hinweis: Übertragen Sie die Eltern fliegen auf neue Fläschchen zu vermeiden Überbelegung der Nachkommen in der Originalflasche. Elternteil fliegen Nachkommen mit frischen Lebensmitteln und Hefe Paste in den ersten 2 bis 3 Schaltern erzeugen können, und dann verringern die Produktivität deutlich mit der Zeit. Erhöhung der fliegen 18 ° C können unspezifische Signal des CaspaseTracker Biosensor reduzieren (siehe Diskussion).</li>
	<li>Wählen Sie Nachkommen fliegt mit richtigen Phänotypen54 für folgende Experimente. Hinweis: Transgene Caspase-Sensitive Gal4 und G-Spur hier befinden sich auf dem zweiten Chromosom mit CyO Balancer ausgeglichen. Wählen Sie die nicht lockig Flügel Nachkommen (ohne CyO), die beide transgene Caspase-Sensitive Gal4 und G-Spur hat.</li>
</ol>(2) die Anwendung der Transienten Zelle Tod Induktion, CaspaseTracker-Biosensor fliegen
<ol><li>Übertragen Sie 10 bis 20 neu geschlüpften Weibchen ein neues Fläschchen mit Fliege Frischwaren und frische Hefe Paste für 1 Tag auf 18 ° C fliegt um Ei-Kammer-Produktion durch Oogenese zu ermöglichen. Hinweis: Halten das Weibchen mit männlichen fliegen könnte Ei Kammer-Produktion erhöhen.</li>
	<li>Das Weibchen fliegt um Ei Kammern durch Kälteschock, Transfer Apoptose induzieren neue leere Fläschchen, die dann bei-7 ° C für 1 h platziert wird. Hinweis: Kälteschock verletzt Zellen durch Induktion Plasmamembran Bruch55,56.</li>
	<li>Um Ei Kammern durch Protein verhungern Apoptose induzieren, übertragen Sie die weiblichen fliegen zu einem neuen Fläschchen mit 8 % Saccharose und 1 % Agar Essen bei 18 ° C für 3 Tage. Hinweis: Protein-Hunger (nicht-Protein Lebensmittel) auslösen kann Ei Kammern um Apoptose57,58,59 und Autophagie60,61unterziehen. Schalter fliegt zu einem neuen Fläschchen mit 8 % Saccharose und 1 % Agar Essen jeden Tag um zu optimalen Zustand Saccharose fliegen Essen zu halten.</li>
	<li>Übertragen Sie die gestressten fliegen zurück zu einem neuen Fläschchen mit frischen fliegen Essen und frische Hefe Paste für 3 Tage bei 18 ° C, damit sie sich erholen. Sezieren Sie die hungrigen und die verhungert erholt fliegen Ei Kammern an Eierstöcken beschrieben62zu erhalten. Hinweis: Um Drosophila Eierstöcke zu sezieren, verwenden Sie 2 Paar Pinzette, um fliegen Kopf entfernen betäuben Sie fliegen mit CO2, zu und verwenden Sie die Zange, um die Basis des Bauches zu entfernen die Eierstöcke der fliegen zu ziehen.</li>
</ol>(3) Fixierung und Färbung der seziert Ei Kammern für die Bildgebung
<ol><li>Übertragen Sie die seziert Ei Kammern zusammen mit rund 0,5 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf 1 mL Zentrifuge Röhren. Lassen Sie die Eiern zu beruhigen. Hinweis: Beschichten von Kunststoff Pipettenspitzen mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) aufgelöst in Wasser oder PBS Ei Kammern zum Aufkleben auf die Kunststoffoberfläche der Tipps zu verhindern. Führen Sie die folgenden Verfahren in Dunkelheit, Immunofluoreszenz rot fluoreszierenden Proteins (RFP, auch bekannt als DsRed) zu vermeiden und grün fluoreszierendes Protein (GFP) in die Ei-Kammern.</li>
	<li>Entfernen Sie die PBS durch pipettieren, und wenden Sie dann 0,5 mL 4 % Paraformaldehyd in PBS, Ei Kammern bei Raumtemperatur in Dunkelheit für 20 bis 30 min. zu beheben. Hinweis: Sanfte Drehung in dieser und die folgenden Inkubationsschritte anwenden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Paraformaldehyd durch pipettieren und dann gewaschen, die Ei-Kammer mit 0,5 mL PBST (PBS + 0,1 % Triton x-100) für 3 Mal. Hinweis: Verlängerte Fixierung könnte die RFP und GFP-Signale reduzieren.</li>
	<li>Die Ei-Kammern mit PBST für 1 bis 2 h bei Raumtemperatur inkubieren oder über Nacht bei 4 ° C mit sanften Drehung um das Ei Kammern permeabilize. Hinweis: PBST kann vermeiden, Ei Kammern, an die nicht-BSA beschichteten Kunststoff-Oberfläche.</li>
	<li>Entfernen Sie der PBST durch pipettieren und Ei Kammern für 1 bis 2 h bei Raumtemperatur für Kern Fleck dann zuweisen Sie 0,5 mL 10 μg/ml blauer nuklearen Hoechst Farbstoff in PBST. Hinweis1: Vermeiden Sie längeren Inkubation mit nuklearen Farbstoff, wie das unspezifische Signal zu erhöhen. Hinweis 2: Alternativer Ansatz zum Kern ohne Hoechst Fleck ist das Hinzufügen von 200 μl Anti-bleichen Montage Agent mit DAPI (siehe Material) und inkubieren Sie über Nacht63, vor der Montage das Gewebe auf Glas Deckglas, wie im Protokoll 3.8 beschrieben. NOTE3: führen Sie die Färbung und die folgenden Verfahren in Dunkelheit, Immunofluoreszenz zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen des nuklearen Farbstoffs durch pipettieren und dann gelten 0,5 mL PBST die Ei Kammern in die Zentrifuge Röhren 1 mL für 3 Mal mit 10 bis 20 min Inkubation mit sanften Drehung zwischen jedem Waschschritt zu waschen.</li>
	<li>Entfernen Sie alle PBST mit feinen Pipette, und wenden Sie dann 200 μL Anti-bleichen Montage Agent (siehe Material) Ei Kammern bei Raumtemperatur 3 Stunden oder über Nacht bei 4 ° C inkubieren, bis Ei Kammern auf der Unterseite des Rohres sinken. Hinweis: auf den Boden des Rohres sinken Gewebe, die vollständig den Montage-Agent aufgenommen haben.</li>
	<li>Montieren Sie die gefärbten Ei Kammern durch Übertragung mit 200 μl Anti-bleaching Montage-Agent auf einem vorgereinigten Objektträger für die Bildgebung durch pipettieren, Ei Kammern mit einem 20 x 20 mm vorgereinigten Glas Deckglas abdecken und verschließen das Deckglas auf Glasobjektträger indem man Nagellack am Rand des Deckglases. Hinweis1: Pre-reinigen Sie den Objektträger und Deckglas mit Wasser oder 70 % Ethanol. Hinweis 2: Gelten Sie Vaseline zwischen den Objektträger und Deckglas zu zerstören die Ei-Kammern durch Unterverdichtungen.</li>
	<li>Bild der Ei-Kammern mit Fluoreszenz oder confocal Mikroskop, mit einem 20 X, NA 0,8 Plan-Apochromat Objektive, mit Anregung Licht-Wellenlänge 405 nm für nukleare Färbung (Erkennung Emission ~ 461 nm), 561 nm für RFP (laufende oder kürzlich Caspase-Aktivität) Signal ( erkennen Emission ~ 590 nm), und 488 nm für GFP (vorbei an Caspase-Aktivität) Signal (Emission erkennen ~ 518nm). Hinweis: Sehen Sie unsere veröffentlichten Protokolle für Mikroskopie-20,-64.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das CaspaseTracker dual Biosensor-System ist ein neuartiges und einzigartiges Werkzeug, das ermöglicht die Erkennung von den vergangenen oder laufenden Caspase-Aktivität und Verfolgung von Zellen, die Zelle Tod rückgängig gemacht haben verarbeiten und Überleben nach Caspase-Aktivität in Vivozu erleben. Während traditionell Caspase-Aktivität als ein Markenzeichen der Apoptose angenommen hat, zeigen wachsende Untersuchungen, dass-apoptotische Caspase-Aktivität mögliche Rollen in diversen normalen Zellfunktionen wie Regulierung der neuronalen Aktivität79, spielt 80, lernen und Gedächtnis81,82,83,84, Unterdrückung der Necroptotic Zelle Tod85,86, Spermatid Individualisierung87 88, MicroRNA Verarbeitung89, Zelle Verbreitung90und Zelle Schicksal Musterung91. Neben der Apoptose und Anastasis erkennt das CaspaseTracker-Biosensor-System daher-apoptotische Caspase-Aktivität, die in das Gehirn und Sehlappen, Kardia, Darm, Malpighian Tubuli, Luftröhre, Muskeln und anderen Geweben des vorhanden ist Drosophila19,46,64. Dieses Biosensor-Signal kann auch die aktuelle oder vergangene Anastatic Aktivität während der Entwicklung des Embryos oder normale Homöostase in diesen Geweben darstellen. Um die Anastasis nach vorübergehender Zelle Tod-induzierende Umweltstress mit lebenden Tieren zu untersuchen, ist es wichtig, wählen Gewebe mit Zellen, die keine Caspase-Biosensor-Aktivität unter normalen physiologischen Bedingungen aufweisen, aber Caspase unterziehen induziert werden können Aktivierung durch vorübergehende Zelle Tod Induktion. Ei Kammern sind für diesen Zweck ideal, denn sie haben in der Regel keine Caspase-Aktivität von Germarium bis Stufe 10 während der Oogenese58,59,92.
Weibliche Drosophila , transiente Umweltbelastungen ausgesetzt, können wie z. B. Protein Hunger und Kälteschock, effizient Caspase-Aktivierung und Zelltod in Ei Kammern19,57,58auslösen, 78. Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls gehören die Vermeidung längerer Zelle Tod Induktion zu fliegen. Optimierten Bedingungen an Protein Hunger (8 % Saccharose in 1 % Agar für 3 Tage) und Kälteschock (1 h bei-7 oC) zur weiblichen fliegen können Caspase aktivierte Zelle Todesprozess in Ei Kammern auslösen und erlauben sie sich erholen, nachdem die gestressten fliegen an zurückgegeben werden Normalzustand19. Längere Behandlung mit einer Zelle Tod Reiz auslösen kann mehr Ei Kammern um den Zelle Todesprozess durchmachen, aber die Wiederfindungsrate wird ebenfalls reduziert, vermutlich weil die sterbenden Ei Kammern massive Schäden irreparabel erleben.
Ein weiteren wichtiger Schritt in diesem Protokoll wird zur Verringerung der CaspaseTracker Hintergrundsignal in Ei Kammern durch Kreuzung, anheben und die Aufrechterhaltung der CaspaseTracker bei einer niedrigeren Temperatur, z. B. 18 oC. fliegt Während die Mehrheit der Ei Kammern aus optimal aufgezogen fliegen zeigen keine Caspase-Aktivität in der Germarium durch Stufe 10 Oogenese58, etwa 1 % der Ei Kammern konnte zeigen Caspase-Biosensor-Aktivität ohne Zelle Tod Induktion19 . Dies spiegeln die normale Fluktuation aufgrund von angeborenen Fehlern oder kann während der Oogenese durch standard Laborbedingungen unbeabsichtigt ausgelöst werden. Wie Gal4 weniger Aktivität in fliegen bei niedriger Temperatur93angezeigt wird, kann fliegen am 18 oC und nicht bei Zimmertemperatur, Erhöhung der endogene Signal reduzieren, das das CaspaseTracker-System aktiviert. Alternativ kann fliegen die Umstellung auf eine höhere Temperatur, wie 29 oC, Erhöhung der Empfindlichkeit des CaspaseTracker Systems, wegen in die Gal4-Aktivität-93und mögliche andere endogene temperaturabhängige enzymatische erhöhen Aktivitäten.
Es ist wichtig, die CaspaseTracker-positiven Zellen unterscheiden, die durchmachen Zellprozess Tod oder Anastasis aus Zellen, die nicht-apoptotische Caspase-Aktivität aufweisen. Apoptotische Zellen express RFP (transient-Marker für laufende oder kürzlich Caspase-Aktivität) und oft GFP (permanent Maker für letzten Caspase-Aktivität) in der Behandlung der Apoptose-Induktion, da diese Zellen sterben laufenden Caspase-Aktivität, dass Gal4 Spalten aktiviert haben, die dann aktiviert die Transient (Gal4 aktivitätsabhängige RFP) und dauerhafte (Gal4 ausgelöst FLPase-FRT vermittelte GFP) Reporter von der G-Trace-System. Apoptose dieser Zellen kann bestätigt werden, dass morphologische und biochemische Markenzeichen wie nukleare Kondensation durch Färbung mit nuklearen Farbstoffe14,19,58erkannt und Caspase Spaltung von erkannt Immunostaining19,94. Zellen, die Anastasis bereits durchlaufen haben Anzeige permanent GFP Ausdruck aufgrund der FLPase-vermittelten Rekombination-Veranstaltung von G-Trace-System. Diese Zellen express keine RFP, da sie keine andauernde Caspase-Aktivität, noch andere Markenzeichen von Apoptose19haben. Diese Zellen werden auch normale nuklearen Morphologie angezeigt. Zellen haben andauernde-apoptotische Caspase Tätigkeit oft anzeigen RFP und GFP Ausdruck und haben auch eine normale nuklearen Morphologie-19.
Es kann schwierig sein, Zellen unterscheiden, die Anastasis aus diesen Zellen, die vorbei-apoptotische Caspase-Aktivität erfahren, da beide nur GFP anzeigen und kein Markenzeichen des Zelltods haben. Daher müssen sorgfältige Experimente enthalten19sein. Für Beispiele um Anastasis in Ei Kammern zu studieren ist es wichtig, GFP Ausdruck betont erholte sich fliegen und nicht gestressten fliegen (Negativkontrolle) zu untersuchen. Wiederhergestellte fliegen sollte mehr GFP exprimierenden Zellen als entspannt fliegen zeigen, ob Anastasis nach der Aktivierung der Caspase aufgetreten ist. Es ist auch wichtig, unspezifische Auto-Fluoreszenz, wie in der Kutikula, Pigmente und Fett Körper19CaspaseTracker fluoreszierenden Signale unterscheiden. Negativkontrolle Biosensor fliegen erzeugten wir mutiert die Caspase-Spaltstelle von der Biosensor (DQVD) zu einer nicht spaltbaren Sequenz (DQVA) und damit rendering der Kontrolle Biosensor zu Caspase Tätigkeit19nicht mehr reagiert. Das Signal in die Caspase empfindlich (DQVD) erkannt, aber nicht in die negativ-Kontrolle (DQVA)-Biosensor-fliegen ist das Signal von Interesse, ausgelöst durch Caspase-Aktivität, sondern als Auto-Fluoreszenz.
Unsere aktuellen Drosophila dual CaspaseTracker Biosensor kann Zellen mit "neueste" Caspase-Aktivität durch Expression von RFP, und mit "Vergangenheit" Caspase-Aktivität durch Expression von GFP19identifizieren. Wir beachten Sie, dass RFP kein "Echtzeit" Caspase-Aktivität-Indikator ist, denn es ein paar Stunden Reaktionszeit für Gal4 dauert, die Expression von RFP in Reaktion auf Caspase-Aktivität zu fahren. Fügen Sie eine "Real Time"-Funktion, der Drosophila CaspaseTracker Biosensor ist kombinierbar mit der neu entwickelten iCasper Biosensor52, ein "Real-Time" und "dunkel bis hell" in Vivo -Biosensor, der nur seine dunkelrote Signal zeigt, wenn es von Caspasen gespalten.
Abgesehen von Apoptose, CaspaseTracker könnte möglicherweise auch während alternative Arten von Zelltod aktiviert werden, wie Zellen Zelle Tod wegen deren Verlauf wechseln können, die direkt oder indirekt Caspase-Aktivierung, wie z. B. Autophagie nach beinhaltet verhungern95,96, Nekrose durch die Kälte Schock-induzierte Plasmamembran Bruch19,55,56,78und Staurosporine-induzierten Necroptosis97, 98. Unsere gegenwärtigen und früheren Studien gezeigt, dass die CaspaseTracker Biosensoren erholte sich von dieser Zelle Tod Induktionen in Vitro oder in Vivo17,18,19 Zellen beschriften können , 20 , 21. wie diese Zelle Tod Induktionen allein gleichzeitig mehrere Zelle Tod Wege in den gleichen Zellen aktivieren konnte, die Wiederherstellung dieser Zellen sterben deutet darauf hin, dass Anastasis ist eine allgemeine Zelle Erholung Phänomen, das verschiedene Zelltod rückgängig machen kann Prozesse, einschließlich der Apoptose, Autophagie, Nekrose und Necroptosis, einzeln oder gleichzeitig.
Der in-Vivo -CaspaseTracker-Biosensor erleichtert Verfolgung des noch unbekannten Funktionen, Mechanismen und therapeutische Implikationen der Anastasis ()Abb. 4()21. Um die molekulare Signatur von Anastasis zu enthüllen, führten wir Zeitverlauf Vollständiggenom Microarray Genexpressionsstudien zu primären Leberzellen Maus während der Umkehrung der Ethanol-induzierten Apoptose zu analysieren, und Interessanterweise fand auffällige Veränderungen in die Transkription von Genen, die in mehrere Wege einschließlich pro-überleben, Anti-Oxidation, DNA-Schäden-Reaktion, Histon-Modifikation, Angiogenese, Zellwanderung und Transformation18,21. Dieser Befund wird durch unsere Validierungsstudie der Erholung der menschlichen Leber Krebs HepG2-Zellen von Apoptose18,21, und auch eine unabhängige RNA-Sequenzierung Studie von HeLa-Zellen bei der Beitreibung von Apoptose99unterstützt. Interessanterweise, Up-Verordnung einige pro-überleben-Faktoren in den Anastatic Zellen gefunden werden auch beobachtet in Umkehrung der Herzinsuffizienz, Tumorprogression und Krebs Wiederauftreten100,101,102, was darauf hindeutet die mögliche Beteiligung der Anastasis. Um die physiologischen, pathologischen und therapeutischen Potentiale von Anastasis zu studieren, ist es wichtig, die Anastatic Zellen zu identifizieren und verfolgen Sie ihr Schicksal bei Kleintieren, mechanistische und therapeutische Studien ermöglichen wird. Unsere Drosophila und Säugetieren CaspaseTracker Biosensoren werden nützliche Tools zum Testen der möglichen Beiträge der Anastasis in normale Entwicklung, Homöostase, Gewebe Erholung, Tumor-Evolution, Rezidiv und Metastasierung. Erkenntnis aus diesen Studien wird unser Verständnis der natürlichen Rolle der Anastasis zu steigern und bieten Potenzial revolutionäre neue Therapieansätze für hartnäckigen Krankheiten durch Vermittlung von Zelltod und Überleben durch controlling Anastasis zu identifizieren.

Programmierten Zelltod, z. B. Apoptose, spielt eine wesentliche Rolle in der embryonalen Entwicklung und normale Homöostase durch den Wegfall von unerwünschter, verletzter oder gefährliche Zellen in mehrzelligen Organismen1,2,3. Der Verlust des Gleichgewichts zwischen Zelle Tod und überleben kann zu fatalen Folgen wie Krebs, Herzversagen, Autoimmunität und Degeneration4,5,6,7,8führen. Aktivierung des Henkers, die Caspasen traditionell als der "Point Of No Return" Apoptose9,10,11, als es betrachtet löst schnelle und massive zellulären Abriss12, 13,14,15,16. Anspruchsvolle dieses allgemeinen Dogma, haben wir bewiesen, kultivierten sterbenden primäre Zellen und Krebszellen nicht nur nach Aktivierung der Caspase, sondern auch folgende wichtige Zelle Tod Kennzeichen einschließlich der Plasmamembran Blebbing, Schrumpfung der Zelle wiederherstellen zu können, mitochondriale Fragmentierung, Freisetzung von mitochondrialen Cytochrom c in das Zytosol, nukleare und Chromatin Kondensation, DNA-Schäden, nukleare Fragmentierung, Zelle Oberfläche Exposition von Phosphatidylserin (PS) und Bildung von apoptotischen Körper 17 , 18 , 19 , 20 , 21. schlagen wir die Anastasis ist eine innere Zelle Erholung Phänomen, wie sterbende Zellen nach Entfernung der Zelle Tod Reize17,18,19,20, erholen können 21. wir prägte den Begriff "Anastasis" (Αναστάσης)18, was bedeutet "steigt zum Leben" in griechischer Sprache, zu dieser unerwarteten Zelle Erholung Phänomen zu beschreiben. Unsere Beobachtung der Anastasis wird weiter unterstützt durch unabhängige Studien, die zeigen auch Erholung der Zellen nach Phosphatidylserin Externalisierung22,23,24, mitochondriale begrenzte äußeren Membran Permeabilisierung25, Aktivierung der gemischte Abstammung Kinase-wie (MLKL) und Zelle Schrumpfung26.
Charakterisierung der Mechanismen zur Regulierung der Anastasis wird Paradigma-Verschiebung physiologische, pathologische und therapeutische Konsequenzen haben. Anastasis könnte einen bisher unbekannten zellschützenden Mechanismus zu retten oder bewahren wichtige postmitotischen Zellen und Gewebe, die schwer zu ersetzen sind, und möglicherweise Konto für Herzinsuffizienz Umkehrung von ventrikulären entladen mit Links ventrikulären darstellen unterstützen Sie Geräte (LVAD)27,28, Wiederherstellung der Sehzellen nach vorübergehender Exposition von übermäßigen hellen29,30,31, oder Reparatur von Neuronen nach Gehirn Verletzungen32. Wenn ja, Förderung der Anastasis Zell- und Erholung verbessern könnte. Umgekehrt könnte Anastasis eine unerwartete Flucht Taktik zu Zelle Tod-induzierenden Therapie verursacht Krebs Wiederauftreten17,18Überleben von Krebszellen verwendet werden. Deshalb unterdrücken Anastasis im sterben Krebszellen während und nach Behandlung von Krebs könnte eine neuartige therapeutische Strategie, Krebs zu heilen, durch ihren Rückfall zu verhindern.
Während des Prozesses der Anastasis haben wir festgestellt, dass einige wiederhergestellten Zellen erworben dauerhafte genetische Veränderungen und unterzog sich onkogenen Transformation, wahrscheinlich aufgrund von DNA-Schäden entstehen während der Apoptose18,20,21 . Umkehrung des Prozesses der Tod von DNA-beschädigte Zellen könnte ein Mechanismus der Tumorgenese, potenziell zugrunde liegt die Beobachtung, die Gewebeverletzung wiederholt erhöht das Risiko von Krebs in einer Vielzahl von Geweben, wie z. B. chronische thermische Schädigung in der Speiseröhre induziert durch den Verzehr von sehr heißen Getränken33,34,35, Leberschäden durch Alkoholismus36,37, Tumor-Evolution nach genotoxische Krebs Therapie38, 39,40und die Entwicklung von Neuerkrankungen von normalen Zellen, die in den Pausen zwischen den Zyklen der Anti-Krebs-Therapie41,42,43,44 entstehen . Wenn "true", könnte targeting Anastasis verhaften Krebsentstehung und Progression oder verhindern. Wir haben festgestellt, dass Hunger-induzierte sterbenden Keimzellen Anastasis erneut zugeführt werden, Drosophila19unterziehen.  Wenn Anastasis in Keimzellen mit DNA-Schädigung auftritt, könnte es sein, entfallen die Beobachtung, die Umweltbelastungen verlängert Entwicklung genetischer Erkrankungen fördert. Z. B. zur Hungersnöte Entwicklung der transgenerationalen vererbbare Krankheiten wie Diabetes und koronare Herzkrankheiten45. Daher könnten Verständnis Anastasis Strategien zur Prävention von vererbbaren Krankheiten, die durch diesen möglichen Mechanismus zu entwickeln.
Um die Entdeckung der Anastasis zu nutzen und zu lenken, innovative Therapien zu entwickeln, ist es wichtig, die Ursache und Folge der Anastasis mit lebenden Tieren zu studieren. Jedoch ist es technisch schwierig zu identifizieren und verfolgen Anastatic Zellen in Vivo, da die Zellen, die Zelle Todesprozess erholt morphologisch nicht zu unterscheiden von normalen gesunden Zellen erscheinen, und es keine Biomarker der Anastasis gibt identifiziert noch17,18,21. Um diese Probleme anzugehen, haben wir vor kurzem entwickelt eine neue in-Vivo Caspase Biosensor bezeichnet "CaspaseTracker"19, zu identifizieren und verfolgen von Zellen, die Apoptose nach Caspase Aktivierung19,46, überleben die Markenzeichen der Apoptose10,14. Unterscheidet sie von der "Echtzeit" Caspase-Biosensoren wie SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 und iCasper52 erkennen, dass andauernde Caspase-Aktivität, der CaspaseTracker-Biosensor zusätzlich bietet die Möglichkeit, dauerhaft Zellen diese ausdrückliche Caspase-Aktivität sogar vorübergehend beschriften. Der CaspaseTracker-Biosensor ermöglicht somit, langfristige Verfolgung von Anastasis nach Umkehr der Caspase-vermittelte Zelle Tod Prozess in Vivo.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;CONSUMABLES AND REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium</td><td>Vector Products</td><td>H-1000</td><td>Antifade mounting medium</td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium (with DAPI)</td><td>Vector Products</td><td>H-1200</td><td>Antifade mounting medium with DAPI</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td></tr><tr><td>Hanging Drop Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Glass slides</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Molecular Probes</td><td>H1399</td><td>DNA stain</td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>M-7512</td><td>Mitochondria stain</td></tr><tr><td>Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9661</td><td>Stain for active fragment of caspase-3</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BAS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td>Blocking agent for immunostaining</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>114-056-101</td><td>Medium for washing and immunostaining</td></tr><tr><td>Triton&amp;trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Detergent for cell permeabilization</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM780 confocal microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Drosophila dissection</td></tr><tr><td>AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316&amp;nbsp;</td><td>Light source</td></tr></tbody></table>

detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor

Anastasis (griechisch für "Rising zum Leben") ist ein vor kurzem entdeckten Zelle Erholung Phänomen, wobei Zellen sterben Tod Spätstadium Zellprozesse rückgängig machen kann, die in der Regel angenommen werden, per se nicht rückgängig gemacht werden. Förderung der Anastasis Körperverletzungen im Prinzip Rettungs- oder Konserve Zellen, die schwer zu ersetzen, wie Kardiomyozyten oder Nervenzellen, wodurch Gewebe Erholung sind. Umgekehrt kann unterdrücken Anastasis in Krebszellen die Apoptose nach Anti-Krebs-Therapien unterziehen Krebs Zelltod zu gewährleisten und reduzieren die Wahrscheinlichkeit eines erneuten Auftretens. Allerdings haben diese Studien behindert wurde, durch den Mangel an Tools für die Verfolgung des Schicksals der Zellen, die Anastasis mit lebenden Tieren zu unterziehen. Die Herausforderung ist es, die Zellen zu identifizieren, die die Zelle Tod trotz ihrer morphologisch normale Erscheinung nach der Wiederherstellung rückgängig gemacht haben. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, haben wir entwickelt, Drosophila und Säugetieren CaspaseTracker-Biosensor-Systeme, die erkennen und dauerhaft zu verfolgen, die Anastatic Zellen in Vitro oder in Vivo. Hier präsentieren wir Ihnen in-Vivo -Protokolle für die Erzeugung und Nutzung von das CaspaseTracker dual Biosensor-System zu erkennen und verfolgen Anastasis in Drosophila Melanogaster nach vorübergehenden Aussetzung zu Zelle Tod Reize. Während konventionelle Biosensoren und Protokolle Zellen aktiv durchmachenden apoptotischen Zelltod beschriften können, der CaspaseTracker-Biosensor kann dauerhaft beschriften, Zellen, die nach der Aktivierung der Caspase - ein Markenzeichen der Spätphase Apoptose, erholt haben und gleichzeitig aktive apoptotische Prozesse zu identifizieren. Dieser Biosensor kann auch die Erholung der Zellen aufspüren, die andere Formen des Zelltods versucht, die direkt oder indirekt Caspase-Aktivität beteiligt. Daher ist dieses Protokoll ermöglicht es uns, kontinuierlich verfolgen das Schicksal dieser Zellen und deren Nachkommen, die Erleichterung der Zukunftsforschung der biologischen Funktionen, molekulare Mechanismen, physiologischen und pathologischen folgen und therapeutische Implikationen der Anastasis. Wir diskutieren auch die entsprechenden Steuerelemente, um Zellen zu unterscheiden, die Anastasis von denen zu unterziehen, die nicht-apoptotische Caspase-Aktivität in Vivoanzeigen.

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Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis ist technisch anspruchsvoll, um in Vivo zu erkennen, da die Zellen, die der Zelle Todesprozess umgekehrt haben morphologisch nicht zu unterscheiden von normalen gesunden Zellen sein können. Hier beschreiben wir Protokolle für die Erkennung und Verfolgung von Zellen, die Anastasis mit lebenden Tieren zu unterziehen, durch den Einsatz unserer neu entwickelten in Vivo -CaspaseTracker-Biosensor-System.

Erkennung von Anastasis In Vivo durch CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

9.2K Aufrufe.  Johns Hopkins University School of Medicine. Anastasis ist technisch anspruchsvoll, um in Vivo zu erkennen, da die Zellen, die der Zelle Todesprozess umgekehrt haben morphologisch nicht zu unterscheiden von normalen gesunden Zellen sein können. Hier beschreiben wir Protokolle für die Erkennung und Verfolgung von Zellen, die Anastasis mit lebenden Tieren zu unterziehen, durch den Einsatz unserer neu entwickelten in Vivo -CaspaseTracker-Biosensor-System.

Serie: Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first to be activated in these pathways. This group includes caspase-2, -8, and -9, as well as the inflammatory caspases, caspase-1, -4, and -5. The initiator caspases are all activated by dimerization following recruitment to specific multiprotein complexes called activation platforms. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is an imaging-based approach where split fluorescent proteins fused to initiator caspases are used to visualize the recruitment of initiator caspases to their activation platforms and the resulting induced proximity. This fluorescence provides a readout of one of the earliest steps required for initiator caspase activation. Using a number of different microscopy-based approaches, this technique can provide quantitative data on the efficiency of caspase activation on a population level as well as the kinetics of caspase activation and the size and number of caspase activating complexes on a per cell basis.

This protocol describes caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC); an imaging-based method that can be used to visualize induced proximity of initiator caspases, which is the first step in their activation.

Die Wege zur Aktivierung der Caspase bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung mit Beleuchtung

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Forschung

Biochemie

cAMP-Analyse mit cADDis: Einzelzell- bis Hochdurchsatz-Screening

Real-Time cAMP Dynamics in Live Cells Using the Fluorescent cAMP Difference Detector In Situ

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is a novel biosensor that allows for the continuous measurement of cAMP levels in living cells. The biosensor is created from a circularly permuted fluorescent protein linked to the hinge region of Epac2. This creates a single fluorophore biosensor that displays either increased or decreased fluorescence upon binding of cAMP. The biosensor exists in red and green upward versions, as well as green downward versions, and several red and green versions targeted to subcellular locations. To illustrate the effectiveness of the biosensor, the green downward version, which decreases in fluorescence upon cAMP binding, was used. Two protocols using this sensor are demonstrated: one utilizing a 96-well plate reading spectrophotometer&#160;compatible with high-throughput screening and another utilizing single-cell imaging on a fluorescent microscope. On the plate reader, HEK-293 cells cultured in 96-well plates were stimulated with 10 &#181;M forskolin or 10 nM isoproterenol, which induced rapid and large decreases in fluorescence in the green downward version. The biosensor was used to measure cAMP levels in individual human airway smooth muscle (HASM) cells monitored under a fluorescent microscope. The green downward biosensor displayed similar responses to populations of cells when stimulated with forskolin or isoproterenol. This single-cell assay allows visualization of the biosensor location at 20x and 40x magnification. Thus, this cAMP biosensor is sensitive and flexible, allowing real-time measurement of cAMP in both immortalized and primary cells, and with single cells or populations of cells. These attributes make cADDis a valuable tool for studying cAMP signaling dynamics in living cells.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der Echtzeit-cAMP-Detektion in Zellen mit dem cADDis-Biosensor

The protocol presented in this study illustrates the effectiveness of the cAMP Difference Detector In Situ in measuring cAMP through two methods. One method utilizes a 96-well plate reading spectrophotometer with HEK-293 cells. The other method demonstrates individual HASM cells under a fluorescent microscope.

Echtzeit-cAMP-Dynamik in lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden cAMP-Differenzdetektor in situ

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is a novel biosensor that allows for the continuous measurement of cAMP levels in living cells. The biosensor is ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

Nanosensoren Protease-Aktivität In Vivo für die nicht-invasive Diagnostik zu erkennen

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

Biotechnik

CRISPR-Cas Synthetischer Urin-Biomarker-Test für die Krebsdiagnostik

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for traditional biofluid measurements. Synthetic biomarkers generally make use of reporters that provide readable signals in the biofluid to reflect the biochemical alterations in the local disease microenvironment during disease incidence and progression. The pharmacokinetic concentration of the reporters and biochemical amplification of the disease signal are paramount to achieving high sensitivity and specificity in a diagnostic test. Here, a cancer diagnostic platform is built using one format of synthetic biomarkers: activity-based nanosensors carrying chemically stabilized DNA reporters that can be liberated by aberrant proteolytic signatures in the tumor microenvironment. Synthetic DNA as a disease reporter affords multiplexing capability through its use as a barcode, allowing for the readout of multiple proteolytic signatures at once. DNA reporters released into the urine are detected using CRISPR nucleases via hybridization with CRISPR RNAs, which in turn produce a fluorescent or colorimetric signal upon enzyme activation. In this protocol, DNA-barcoded, activity-based nanosensors are constructed and their application is exemplified in a preclinical mouse model of metastatic colorectal cancer. This system is highly modifiable according to disease biology and generates multiple disease signals simultaneously, affording a comprehensive understanding of the disease characteristics through a minimally invasive process requiring only nanosensor administration, urine collection, and a paper test which enables point-of-care diagnostics.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung molekularer Werkzeuge für die Erkennung und Bildgebung von Krankheiten

This protocol describes a CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test that enables point-of-care cancer diagnostics through the ex vivo analysis of tumor-associated protease activities.

CRISPR-Cas-vermittelter synthetischer Multianalyt-Urin-Biomarker-Test für tragbare Diagnostik

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

Visualisierung von entzündlichen Kaspasen induzierter Nähe in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Immunologie und Infektion

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is the initiation of innate immune programmed cell death (PCD) to eliminate infected or damaged cells and propagate immune responses. However, excess PCD is associated with inflammation and pathology. Therefore, understanding the activation and regulation of PCD is a central aspect of characterizing innate immune responses and identifying new therapeutic targets across the disease spectrum.
This protocol provides methods for characterizing innate immune PCD activation by monitoring caspases, a family of cysteine-dependent proteases that are often associated with diverse PCD pathways, including&#160;apoptosis,&#160;pyroptosis, necroptosis, and PANoptosis. Initial reports characterized caspase-2, caspase-8, caspase-9, and caspase-10 as initiator caspases and caspase-3, caspase-6, and caspase-7 as effector caspases in apoptosis, while later studies found the inflammatory caspases, caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-11, drive pyroptosis. It is now known that there is extensive crosstalk between the caspases and other innate immune and&#160;cell death molecules across the previously defined PCD pathways, identifying a key knowledge gap in the mechanistic understanding of innate immunity and PCD and&#160;leading to the characterization of PANoptosis. PANoptosis is a unique innate immune inflammatory PCD pathway regulated by PANoptosome complexes, which integrate components, including caspases,&#160;from other cell death pathways.
Here, methods for assessing the activation of caspases in response to various stimuli are provided. These methods allow for the characterization of PCD pathways both in vitro and in vivo, as activated caspases undergo proteolytic cleavage that can be visualized by western blotting using optimal antibodies and blotting conditions. A protocol and western blotting workflow have been established that allow for the assessment of the activation of multiple caspases from the same cellular population, providing a comprehensive characterization of the PCD processes. This method can be applied across research areas in development, homeostasis, infection, inflammation, and cancer to evaluate PCD pathways throughout cellular processes in health and disease.

This protocol describes a comprehensive method for assessing caspase activation (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, and caspase-11) in response to both in vitro and in vivo (in mice) models of infection, sterile insults, and cancer to determine the initiation of cell death pathways, such as pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and PANoptosis.

Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Erkennung von Anastasis In Vivo durch CaspaseTracker Biosensor

Zusammenfassung

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Die Wege zur Aktivierung der Caspase bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung mit Beleuchtung

Echtzeit-cAMP-Dynamik in lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden cAMP-Differenzdetektor in situ

Echtzeit-cAMP-Dynamik in lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden cAMP-Differenzdetektor in situ

Echtzeit-cAMP-Dynamik in lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden cAMP-Differenzdetektor in situ

Nanosensoren Protease-Aktivität In Vivo für die nicht-invasive Diagnostik zu erkennen

CRISPR-Cas-vermittelter synthetischer Multianalyt-Urin-Biomarker-Test für tragbare Diagnostik

CRISPR-Cas-vermittelter synthetischer Multianalyt-Urin-Biomarker-Test für tragbare Diagnostik

CRISPR-Cas-vermittelter synthetischer Multianalyt-Urin-Biomarker-Test für tragbare Diagnostik

Visualisierung von entzündlichen Kaspasen induzierter Nähe in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods