Este estudo foi parcialmente financiado pela Fundação de BrightFocus (para DS).

Procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) na Universidade de Pittsburgh e institucional Cuidado Animal
1. Preparar soluções
<ol><li>Prepare o crescimento médio pela completa Dulbecco modificado águia médio (DMEM), glicose alta com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% penicilina/estreptomicina, 2,5 mM L-glutamina e 1 x MEM não essenciais aminoácidos. Pré-aquecer a mídia na incubadora de 37 ° C antes do uso.</li>
	<li>Prepare a solução de trabalho 2% (wt/vol) dispase II:<ol>
<li>Prepare uma solução stock de dispase 100mg/mL II dissolvendo-se 30 mg de dispase II em 300 µ l HEPES salino (50mm KOH/HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl). Este volume é para 3-4 ratos, pode ser ajustado para cima ou para baixo com base no número de ratos para a experiência). Estas ações podem ser armazenadas pelo menos 1 semana a 4 ° C.</li>
		<li>Prepare a solução de trabalho de 2% dispase, juntando 300 µ l a 100 mg/ml estoque II dispase a 1,2 mL de DMEM estéril, glicose alta e filtrar a solução através de um filtro de 0,22 µm. Esta etapa deve ser executada no fluxo laminar em condições estéreis. Pré-aqueça o preparado dispase II em incubadora 37 ° C antes do uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. obtenção dos olhos de rato
<ol><li>Eutanásia o mouse usando qualquer método aprovado e colocá-lo em um absorvente.</li>
	<li>Usando luvas, colocar o polegar e o dedo indicador ao redor dos olhos e empurre suavemente a pele para proptose do globo ocular.</li>
	<li>Inserir a ponta da tesoura angulada entre a pele e o globo ocular e corte com cuidado para fora do olho. Para evitar contaminação, brevemente, mergulhe o olho em etanol a 70%.</li>
	<li>Coloca imediatamente o olho no tampão fosfato salino (PBS) em uma placa de Petri.</li>
	<li>Repita as etapas para remover o segundo olho da 2.2-2.4.</li>
</ol>3. dissecação do olho
<ol><li>Remova cuidadosamente o tecido conjuntivo do olho no microscópio de dissecação. Isso pode ser feito em PBS ou sobre o prato de Petri a seco.<ol>
<li>Use pinça de sutura para levantar os tecidos conjuntivos do globo ocular e cortá-los com uma tesoura Vannas. Não corte a esclera porque é praticamente impossível obter as viseiras posteriores intactas se a esclera é cortada.</li>
		<li>Após a limpeza do tecido conjuntivo, mantenha os olhos resultantes em PBS para a próxima etapa de lavagem. Nota: Todas as etapas a seguir devem ser executadas no fluxo laminar em condições estéreis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave os olhos duas vezes em previamente aquecido a 37 ° C DMEM (glicose alta). Transferi com cuidado os globos oculares para o pré-aquecido 37 ° C DMEM (glicose alta) usando fórceps. Aspire os globos oculares médio e transferência para meio fresco em um prato novo.</li>
	<li>Aspire médio DMEM (glicose alta) e incube-os olhos da solução de trabalho II dispase de 2% (wt/vol) pré-aquecido por 45 min em incubadora a 37 ° C. Nota: Em todas as etapas a seguir, coloque e manipular os olhos ou viseiras no meio de crescimento, que vão proteger o tecido e fornecer um meio bom para a dissecação.</li>
	<li>Remover a solução II dispase e lavar os olhos duas vezes, no meio de crescimento por aspiração do meio velho e adicionando o novo meio de crescimento previamente aquecido a 37 ° C (Figura 1a). Nota: Após a dissociação por dispase II, os globos oculares se tornam macios.</li>
	<li>O olho com a pinça e fazer uma incisão ao redor da ora serrata de cada olho usando Tesoura Vannas sob o microscópio dissecação colocado no fluxo laminar do armário.<ol>
<li>Manter o globo ocular na solução, Retire cuidadosamente a córnea anterior estendendo o corte em torno da circunferência de serrata ora e se afastando da córnea anterior após o corte foi completo.</li>
		<li>Retire a cápsula da lente e epitélio associado íris pigmentada puxando suavemente-os fora a viseira com pinça teethed (Figura 1b, 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incube as viseiras resultantes posteriores no meio de crescimento por 20 min a 37 ° C para facilitar a separação da retina neural o RPE.</li>
	<li>Corte as viseiras posteriores em 4 pétalas ao microscópio dissecação colocado no fluxo laminar do armário. Os cortes devem ser tempo suficiente para achatar a viseira, mas curto o suficiente para manter as pétalas conectadas (Figura 1D).<ol>
<li>Achate a viseira e remover a retina neural, muito delicadamente, puxando-o com pinça, mantendo o restante complexo RPE-coroide-esclera com outra pinça (Figura 1e). Comece a puxar das bordas, em vez do centro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferência de de que todos os tecidos esquartejados para uma nova placa de cultura estéril cheia pré aquecido médio de crescimento de 37 ° C.</li>
</ol>4. isolamento de células primárias de RPE
<ol><li>Segurando uma pétala do complexo coroide-RPE-esclera esquartejado com super fino pinça, retire suavemente as folhas intactas de RPE da membrana basal subjacente (membrana de Bruch) usando uma faca microcirúrgica crescente sob o microscópio de dissecação colocado no fluxo laminar (Figura 1f).<ol>
<li>Transfira as folhas RPE para a nova placa de cultura estéril contendo meio de cultura usando uma micropipeta P200. Quando a transferência de folhas RPE, molhar as pontas de pipeta com meio de cultura pipetando várias vezes para evita a aderência dentro a ponta do tecido. RPE será claramente distinguível de coroide: RPE parece mais amarronzado, enquanto coroide é mais escura e parece pegajoso e fofo.</li>
		<li>Como alternativa, use digestão enzimática e dissociação suave sem fórceps para desanexar o RPE a coroide14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavar os lençóis RPE 2 - 3 vezes usando previamente aquecido a 37 ° C médio de crescimento da placa de cultura estéril. Após cada etapa de lavagem, cuidadosamente recolha as folhas RPE, evitando outros tecidos como detritos de retina ou coroide. No final da última lavagem recolher as folhas RPE com uma micropipeta P200 e colocá-los em um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL. Nota: Não há nenhuma necessidade para Centrifugar as folhas RPE: eles irão sedimentos pela gravidade dentro de 1 min.</li>
	<li>Remova o meio de crescimento extra usando uma micropipeta P200. Ressuspender as células em um meio fresco pré-aquecido e suavemente, Triture-os com uma micropipeta P200. Evite a formação de bolhas. Uma suspensão de célula única é o ideal, mas também evitar demasiada trituração, caso contrário, as células RPE não são capazes de sobreviver. Recomendamos muito suavemente trituração por 40 - 50 vezes.</li>
</ol>5. cultivo de células RPE
<ol><li>As células numa placa de cultura da placa.<ol>
<li>Se as aplicações a jusante das células RPE exigem retenção de sua polaridade, placa o RPE células de 2 ratos em uma inserção de membrana de poliéster 12mm pré-carregado em placas de cultura 12-bem. Chapeamento as células em alta densidade é desejado porque nesse caso, as células RPE são capazes de manter as propriedades originais, tais como o formato hexagonal e pigmentação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Não mova a placa ou mudar o meio de crescimento para as primeiras 72 horas de cultivo. Depois de 3 dias, substitua o antigo médio com o meio fresco de crescimento previamente aquecido. Depois troque o meio de cultura todos os dias. Uma vez que as células RPE confluencia, reduza o FBS meio de crescimento de 2%. Nota: As células podem ser divididas usando tripsina 0,25%. No entanto, após a divisão das células podem perder sua forma hexagonal e pigmentação nas passagens subsequentes. Nós não recomendamos a divisão das células, mas se isso for exigido pelas aplicações a jusante da cultura, tenha em mente que as células primárias não podem ser passadas por tempo indeterminado: eles são conhecidos para diferenciar eliminação após 5-7 passagens.</li>
</ol>

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</ol>

DS recebeu pesquisa financiamento da Bayer HealthCare e F. Hoffmann-La Roche, Alemanha, Suíça. Os restantes autores declaram sem interesses financeiros concorrentes. Este trabalho é apoiado pela pesquisa para evitar cegueira (subvenções irrestritas para o Wilmer Eye Institute e Universidade de Pittsburgh).  Este trabalho também é apoiado por fundos de start-up para DS de Oftalmologia, Universidade de Pittsburgh.

O protocolo detalhado apresentado permite estabelecimento confiável de rato primário RPE culturas que atingem a confluência após 1 semana e apresentar as principais características RPE como forma hexagonal e pigmentação após 2 semanas. As células RPE obtidas podem ser usadas para um número de aplicações a jusante, tais como vitamina A metabolismo9, fagocitose do fotoreceptor segmentos exterior10 e íon transporte11, células epiteliais polaridade2, dos lisossomos homeostase e autofagia12,13. Dependendo da aplicação a jusante, a morfologia das culturas derivadas pode ser validada pela transmissão e microscopia eletrônica conforme descrito em detalhe em outro lugar14. Ensaios adicionais para demonstrar a maturação das culturas pode incluir resistência elétrica transepitelial (TEER) do ensaio para demonstrar a polaridade das células RPE,4,22, testes funcionais (fagocitose de ensaios de permeabilidade 23) e formação de dome.
Em nossa experiência, as células mais que são banhados em um poço, melhor a confluência e o fenótipo. Neste protocolo, temos semeado as células RPE de 2 ratos em um inserções de 12 mm. No entanto, também é possível colocar as células RPE do 2 ratos para uma inserção de 6.5 mm para obter melhor confluência e TEER. Em muitos estudos, as placas para culturas de células RPE são revestidas com Matrigel ou laminina. Não vimos uma diferença significativa em anexo de célula RPE para estes vasos com ou sem revestimento. Além disso, a percentagem de FBS em meio de cultura pode ser modificada para alcançar melhores resultados. 10% FBS é geralmente bom para alcançar a confluência, mas caindo para menos FBS parece ser benéfica para o RPE diferenciação/maturação14,17.
A principal limitação deste método é a necessidade de formação precisa da pessoa realizando as dissecações de olho para garantir a máxima eficiência de recuperação de células RPE sem contaminação com células derivadas de outros tecidos oculares. Para evitar contaminação cruzada, o pesquisador deve dominar o passo crítico deste procedimento: cuidado descascando a retina seguido de separação precisa entre o RPE da coroide. A pureza das culturas obtidas pode ser validada usando immunostaining RPE-específicos. Um número de marcadores RPE está disponível para a caracterização das culturas RPE, incluindo genes envolvidos no ciclo visual, barreira e função de transporte, metabolismo, fagocitose e melanogênese15.
Outra limitação é o número de olhos que podem ser processados simultaneamente para obter as culturas. Em geral, não recomendamos trabalhar com mais de 2 ratos de cada vez. Para garantir a viabilidade das células RPE, os olhos devem ser dissecados tão rapidamente quanto possível. Depois que o usuário se tornar mais proficientes, é possível manipular mais ratos, alternando tempos de incubação.
Em geral, vários métodos têm sido publicados sobre o estabelecimento do mouse principal RPE culturas3,14,15, no entanto, pela primeira vez, apresentamos uma versão em vídeo do protocolo completo. Este protocolo pode ser usado como orientação sobre técnicas de dissecação a olho. No entanto, o equilíbrio ideal entre a alta velocidade e a precisão necessária para a dissecação pode ser alcançado apenas com a prática.

O epithelium retinal do pigment (RPE) é uma única camada de células epiteliais polarizadas que se localiza entre a retina neural e a coroide do olho. A funcionalidade das células RPE e a integridade da monocamada RPE são críticos para a visão porque o RPE desempenha um papel importante em vários processos, tais como a manutenção da barreira hemato-retiniana exterior, transporte de água e íons entre a retina e o absorção de coroide, luz, proteção contra o estresse oxidativo, controle do metabolismo de retinoide e fagocitose dos segmentos exteriores dos FOTORRECEPTORES1,2. A localização do RPE na parte de trás do olho, bem como sua função de barreira impedindo medicamentos administrados sistemicamente da passagem do sangue para o humor vítreo, tornam difícil estudar a complexidade do RPE função na vivo. Assim, há uma grande necessidade para o estabelecimento de culturas de células RPE para estudar as células RPE em um ambiente flexível e controlado3,4.
Existem várias linhas de células RPE estabelecidas, fornecendo uma maneira fácil e conveniente de obter e armazenar as células; no entanto, passadas as células têm algumas desvantagens em comparação com as células primárias2,3,4. Primeiro, eles são frequentemente caracterizados por alterações na morfologia celular. Por exemplo, nenhuma das linhas celulares existentes foram encontradas para ser adequado para um estudo confiável das propriedades de barreira de RPE devido a perda do fenótipo de polaridade celular e desaparecimento parcial das junções apertadas4. Além da perda de polaridade e ligações de celular para celular adequadas, as linhas de células RPE rapidamente perdem sua pigmentação devido à ausência das enzimas chave melanogênese no adulto RPE5. A pigmentação pode ser restaurada, mas a análise abrangente do mecanismo de re-pigmentação que inclua uma combinação de microscopia eletrônica de transmissão, gene expressão ensaios análise e químico para confirmar a presença de melanina tem nunca foram realizados6. Uma limitação mais é que as linhas de células RPE tem vida estendida da célula (às vezes - imortalidade) e sob certas condições podem se transformar em células-tronco multipotentes auto renovadora que desanexar do substrato e forma flutuante colônias7, 8. essa limitação torna impossível usar as linhas de células para transplante de experiências3.
Tendo em conta as desvantagens das linhas celulares RPE estabelecidas, culturas de células RPE primárias obtidas de tecidos frescos podem servir como um modelo mais biologicamente relevante para estudar o RPE. Células RPE primárias foram usadas não só para estudar funções específicas do RPE, tais como vitamina A metabolismo9, fagocitose do fotoreceptor segmentos exterior10 e íon transporte11, mas também para estudar Biologia celular básica tais como epiteliais polaridade de célula2 , homeostase dos lisossomos e autofagia12,13.
Nos últimos anos tem havido um número de publicações sobre o estabelecimento de culturas primárias de RPE, indicando um crescente interesse nesta área de pesquisa de14,3,15. Inúmeros protocolos para células humanas RPE e células RPE não-humanos como as células RPE de bovinos e suínas foram publicados16,17,18,19. No entanto, é mais difícil de manipular as células RPE rato devido ao seu tamanho muito menor. Apesar de um grande número de publicações tem descrito protocolos para isolar as células RPE do rato14,20,21, ainda existem muitos pesquisadores lutando para isolar as células RPE sem contaminação de coroide células ou células de detritos de retina neural. Aqui nós apresentamos o protocolo para o estabelecimento de mouse principal cultura de células RPE, incluindo a obtenção dos olhos do rato, dissecção dos olhos e isolamento das folhas de RPE para produzir as células para cultivo. Este protocolo de vídeo seria especialmente útil para pesquisadores que estão começando a trabalhar com culturas primárias de RPE rato e precisa de orientação sobre as técnicas de dissecação.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;animals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2~3-week old wildtype mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM), high glucose</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro</td><td>61-034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Ambion</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>RPE65 antibody</td><td>A gift from Dr. Michael Redmond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Phalloidin&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>F432</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11011&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00380</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Polyclonal Antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;instruments and equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow cabinet</td><td>Baker</td><td>SterilGARD SG403A</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope)</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator with hot air sterilization</td><td>Binder</td><td>C150</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &amp;micro;m, Sterile</td><td>Corning Incorporated</td><td>COR-3460</td><td></td></tr><tr><td>Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp</td><td>STEPHENS instruments</td><td>S7-1320</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo suturing forceps 0.12mm</td><td>Stroz Ophthalmic Instruments</td><td>E1796</td><td></td></tr><tr><td>Crescent straight knife</td><td>Beaver-Visitec International</td><td>373808</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors, 8 cm, 45&amp;deg; Angle, Standard</td><td>World Precision Instruments</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>SLGL0250S</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 5 mL</td><td>BD</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Laboratory Microscope&amp;nbsp;Leica DM IL LED</td><td>&amp;nbsp;Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barrier and non-filtered pipette tips</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium

O epithelium retinal do pigment (RPE) é um altamente polarizado epitélio multi-funcional que se localiza entre a retina neural e a coroide do olho. É uma única folha de células pigmentadas que são embaladas hexagonalmente e conectadas por junções apertadas. As principais funções do RPE incluem a absorção da luz, fagocitose dos segmentos exteriores galpão fotoreceptor, buffer espacial dos íons, transporte de nutrientes, íons e água, bem como participação activa no ciclo visual. Com tais funções importantes e diversas, é criticamente importante estudar a biologia das células RPE. Um número de linhas de células RPE foram estabelecido; no entanto, passadas e imortalizadas células são conhecidas para perder rapidamente algumas das características morfológicas e fisiológicas das células RPE naturais. Assim, as células primárias são mais adequadas para estudar diferentes aspectos da biologia de pilha RPE e função. Cultura de células RPE primária mouse é muito útil para pesquisadores, desde modelos de mouse são amplamente utilizados em estudos biológicos, no entanto, coletar RPE células de rato também é muito difícil devido ao seu pequeno tamanho. Aqui, apresentamos um protocolo para o estabelecimento de culturas de células RPE mouse principal que inclui Enucleação e dissecção dos olhos e isolamento das folhas de RPE para produzir as células para cultivo. Este método permite a recuperação eficiente da célula. As células RPE obtidas de dois ratos podem chegar a confluência em uma inserção de membrana de poliéster 12mm pré-carregado em placa de cultura, depois de uma semana de cultura e mostrar algumas das propriedades originais de boa-fé RPE células como forma hexagonal e pigmentação após dois semanas de cultura.

A rato RPE cultura primária estabelecida de 2 ratos em 12mm membrana de poliéster inserção atinge 90-95% confluência após 1 semana na cultura. Depois de 2 semanas de cultura, as células alcançou a confluência de 100% e começaram a formar um mosaico de células hexagonais, pigmentadas e bi-nucleated. Por 3 semanas de cultura, as células continuou a formar a forma e pigmentação, no entanto, após 4 semanas uma parte das células tem hiperpigmentadas (Figura 2).
A pureza da cultura de pilha RPE primária pode ser avaliada por imunocoloração usando o anticorpo RPE65 (retinoide isomerohydrolase, uma enzima crítica no ciclo de vertebrados visual que permite a conversão de all-trans-retinil ésteres em 11-cis-retinol durante fototransdução) (Figura 3, vermelho). A integridade dos cruzamentos de célula para célula e a presença de formato hexagonal podem ser demonstradas usando phalloinin coloração (Figura 3, verde). Além disso, a expressão da proteína ZO-1, um importante componente das junções apertadas, pode ser validado usando mancha ocidental (Figura 4) ou immunostaining.
Nossos resultados demonstram que as culturas RPE primárias obtidos do mouse são capazes de proliferar, retêm pigmentação, formato hexagonal e junções apertadas e expressar marcadores funcionais tais como RPE65.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56997/56997fig1.jpg"> Figura 1 . Culturas de células de diferentes etapas de dissecação do olho para obter o RPE primária. (um) após a dissociação em dispase de 2%, o olho é lavado no meio de crescimento. (b) a posterior ocular é obtida através da remoção da córnea e a lente. (c) a viseira resultante é mais limpo, removendo a íris associada pigmentado epitélio. (d) após mais de incubação em meio de crescimento, a viseira é cortada radialmente para gerar quadrantes. (e) A retina neural é descascada fora do complexo coroide-RPE-esclera restante. (f) folhas o RPE suavemente são separadas da membrana de Bruch. Nota que o RPE parece mais amarronzadas (setas), enquanto a coroide é mais escura e muito pegajoso. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56997/56997fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56997/56997fig2.jpg"> Figura 2 . Células RPE primárias de um rato 3 semana de idade, cultivadas em uma inserção de membrana de poliéster 12mm pré-carregado em placas de cultura de 12 poços. A rato RPE cultura primária estabelecida de 2 ratos em 12mm membrana de poliéster inserção atinge 90-95% confluência após 1 semana na cultura (a). Depois de 2 semanas de cultura, as células alcançou a confluência de 100% e começaram a formar um mosaico de células hexagonais, pigmentadas e bi-nucleated (b). Por 3 semanas de cultura, as células continuaram a formar a forma e pigmentação (c), no entanto, após 4 semanas uma parte das células tem hiperpigmentadas (d). Barra de escala: 100 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56997/56997fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56997/56997fig3.jpg"> Figura 3 . O marcador de células RPE, RPE65, é detectável em células RPE mouse principal. As células RPE mouse principal após 4 semanas da cultura foram fixadas em paraformaldeído 4% (PFA) e incubadas com anticorpo RPE65 ou tampão de bloqueio como controlo negativo (NC). Faloidina (verde) e DAPI (azul) também foram adicionados para manchar as membranas celulares e núcleos. Barra de escala: 100 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56997/56997fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56997/56997fig4.jpg"> Figura 4 . O marcador de junções apertadas, ZO-1 é expressa nas células RPE primárias. As células RPE mouse principal (mRPE) foram colhidas após 3 semanas de cultura e 8 µ g do lisado celular foi executado em um Western blot. A quantidade equivalente de células ARPE-19 (linha comercialmente disponível de celular estável RPE) foram utilizados como controle negativo. ZO-1 foi altamente expressa em células RPE primárias ao ser ausente das células ARPE-19. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56997/56997fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

O epithelium retinal do pigment (RPE) é um epitélio multi-funcional do olho. Aqui nós apresentamos um protocolo para estabelecer culturas de célula primária derivadas o RPE murino.

Culturas de células primárias do Mouse epithelium Retinal do Pigment

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

primary-cell-cultures-from-the-mouse-retinal-pigment-epithelium

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

21.0K visualizações.  University of Pittsburgh School of Medicine. O epithelium retinal do pigment (RPE) é um epitélio multi-funcional do olho. Aqui nós apresentamos um protocolo para estabelecer culturas de célula primária derivadas o RPE murino.

Vídeo: Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

Modelos experimentais para estudo da fisiologia epitélio pigmentar da retina e Fisiopatologia

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Neurociência

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

Isolamento de Células-Tronco da retina do olho do rato

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Biologia

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

Cultivo de longo prazo, sem soro de explantes de retina de rato organotipo com epitélio pigmento de retina intacto

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Caracterização e Dinâmica Morfológica de RPE Murino Primário Cultivado

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Autor em destaque: Isolamento eficiente de células epiteliais pigmentares primárias da retina de camundongos adultos para pesquisa de retinopatia

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Cultura Primária de Células Epiteliais do Pigmento da Retina Suína

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

Isolamento das células epitélio pigmentadas do rato primário

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential application in molecular biology studies, including gene expression analyses. In the context of eye growth regulation and myopia, the RPE likely plays a role as a cellular relay for growth modulatory signals, as it is located between the retina and the two walls of the eye, such as the choroid and sclera. While protocols for isolating the RPE have been developed for both chicks and mice, these protocols have proven not to be directly translatable to the guinea pig, which has become an important and widely used mammalian myopia model. In this study, molecular biology tools were used to examine the expression of specific genes to confirm that the samples were free of contamination from the adjacent tissues. The value of this protocol has already been demonstrated in an RNA-Seq study of RPE from young pigmented guinea pigs exposed to myopia-inducing optical defocus. Beyond eye growth regulation, this protocol has other potential applications in studies of retinal diseases, including myopic maculopathy, one of the leading causes of blindness in myopes, in which the RPE has been implicated. The main advantage of this technique is that it is relatively simple and&#160;once perfected, yields high-quality RPE samples suitable for molecular biology studies, including RNA analysis.

We describe a simple and efficient method for isolating cells of the retinal pigment epithelium (RPE) cells from the eyes of young pigmented guinea pigs. This procedure allows for follow-up molecular biology studies on the isolated RPE, including gene expression analyses.

Culturas de células primárias do Mouse epithelium Retinal do Pigment

Resumo

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