Name: high-resolution episcopic microscopy (hrem) - simple and robust protocols for processing and visualizing organic materials
Uploaded: 2017-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
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Die Autoren danken Tim Mohun für seine ungleichen Beiträge bei der Entwicklung von HREM und Petra Heffeter für die Bereitstellung von Proben.

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit ethischen Richtlinien an der Medizinischen Universität Wien durchgeführt. 1. Probenvorbereitung <ol><li> Vorbereitung von Embryonen und Embryogeweben (bis zu 5 x 5 x 5 mm 3 ) <ol><li> Fixieren Sie die Embryonen oder Teile der Embryonen in 4% PFA / PBS oder Bouins Fixiermittel bei 4 ° C für mindestens 16 - 24 h unter konstantem Schütteln. ANMERKUNG: Embryonen verschiedener Arten und verschiedener Entwicklungsstadien können verwendet werden, wie 48-h-Zebrafisch, 19-h-Küken und Wachtel, sowie pränatale Mausembryonen, die hier verwendet wurden (siehe Repräsentative Ergebnisse ). Die Proben wurden geerntet und in PBS bei Raumtemperatur zur Inszenierung überführt, bevor sie fixiert wurden. Bei Bedarf die Proben mit Mikroscheren oder Skalpellen vor der Fixierung an die Einbettungsformen anpassen. </li><li> Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie das Embryogewebe in PBS bei 4 ° C unter konstantem RockinG für 24 h (2-3 änderungen). </li><li> Die Proben in 70%, 80%, 90%, 96% Ethanol bei 4 ° C für jeweils 2 - 3 h dehydratisieren. Legen Sie die Röhrchen mit den Proben auf einen Rotator. HINWEIS: Bei kleinen Proben (&lt;2 x 2 x 2 mm 3 ) kann die Zeit, die eine Probe in jedem Ethanol aufnimmt, auf 60 min reduziert werden. Bei großen Proben (&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ) kann es auf 4 h verlängert werden. </li><li> Führen Sie die folgenden Infiltrationsschritte unter einer Dunstabzugshaube mit Schutzhandschuhen durch. <ol><li> Die Infiltrationslösung durch Zugabe von 1,25 g Benzoylperoxid (plastifizierter Katalysator) und 0,4 g Eosin auf 100 ml Lösung A (weitere Einzelheiten siehe Tabelle der Materialien ) vorbereiten . In einem Becher auf einer Magnetrührplatte bei 4 ° C aufrühren, bis Eosin und Katalysator vollständig aufgelöst sind (2 - 3 h). </li><li> Legen Sie die Proben für 12 - 24 h in die Infiltrationslösung. Halten Sie es bei 4 ° C unter kontinuierlichem Schütteln oder Drehen. Ersetzen Sie die Infiltrationslösung nach 3 und 12 mit frischer LösungH. HINWEIS: Verlängern Sie die Infiltrationszeit auf 48 h für große Embryonen (&gt; 1 cm Krone / Rumpflänge). </li></ol></li></ol></li><li> Vorbereitung von adulten Gewebeproben (bis zu 5 x 5 x 7 mm 3 ) <ol><li> Fixieren Sie die Gewebe in 2% PFA / PBS, enthaltend 4% Karbolsäure bei 4 ° C für mindestens 3 Tage. ANMERKUNG: Gewebeprobe, die aus Haut, Leber, Bauchspeicheldrüse, Niere, Schilddrüse, Herz, gestreiften Muskeln, Gehirn, Nerven und Tumormodellen von mehreren Neugeborenen und erwachsenen Menschen, Nagetiere, Schweine, Fruchtfliegen und Zebrastreifen in dieser Lösung fixiert werden kann Und dann für die HREM-Bildgebung verarbeitet (wir zeigen die Fixierung der Proben, siehe Repräsentative Ergebnisse ). Heben Sie die Gewebeproben mit Skalpellen, Scheren oder Biopsie-Schlägen an und überweisen sie direkt in Fixiermittel. Zur Fixierung von Nervengewebe verwenden Sie 4% PFA / PBS. </li><li> Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie das Gewebe unter fließendem Leitungswasser für 3-6 h. </li><li> Dehydrieren Sie die Proben nachträglichSie in 70%, 80%, 90%, 96% Ethanol, gemischt mit 0,4 g Eosin pro 100 mL (jeweils 2 - 3 h). Halten Sie die Lösungen mit Proben bei 4 ° C unter konstantem Schütteln oder auf einem Rotator. HINWEIS: Bei kleinen Proben (&lt;2 x 2 x 2 mm 3 ) kann die Zeit, die eine Probe in jedem Ethanol aufnimmt, auf 60 min reduziert werden. Bei großen Proben (&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ) kann es auf 4-8 h verlängert werden. </li><li> Führen Sie alle folgenden Infiltrationsschritte unter einer Dunstabzugshaube mit Schutzhandschuhen durch. <ol><li> Die Infiltrationslösung durch Zugabe von 1,25 g Benzoylperoxid (plastifizierter Katalysator) und 0,4 g Eosin auf 100 ml Lösung A (weitere Einzelheiten siehe Tabelle der Materialien ) vorbereiten . In einem Becher auf einer Magnetrührplatte bei 4 ° C rühren, bis der Eosin und der Katalysator vollständig aufgelöst sind (2 - 3 h). </li><li> Legen Sie Proben in die Infiltrationslösung für 24 - 36 h. Halten Sie es bei 4 ° C unter kontinuierlichem Schütteln oder Drehen. Ersetzen Sie die Infiltrationslösung nach 3 und nach der frischen Lösung12 h. HINWEIS: Bei großen Proben (&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ) verlängern Sie die Infiltrationszeit auf 48 h. </li></ol></li></ol></li><li> Vorbereitung anderer organischer Stoffe HINWEIS: Trim Hautersatz und Papier auf die gewünschte Größe mit gewöhnlichen Schere. Es ist keine Fixierung erforderlich. <ol><li> Überspringen, Waschen und Austrocknen. </li><li> Führen Sie alle folgenden Infiltrationsschritte unter einer Dunstabzugshaube mit Schutzhandschuhen durch. <ol><li> Die Infiltrationslösung durch Zugabe von 1,25 g Benzoylperoxid (plastifizierter Katalysator) und 0,4 g Eosin auf 100 ml Lösung A (weitere Einzelheiten siehe Tabelle der Materialien ) vorbereiten . In einem Becher bei 4 ° C auf einer Magnetrührplatte umrühren, bis Eosin und Katalysator vollständig gelöst sind (2 - 3 h). </li><li> Legen Sie Proben in Infiltrationslösung für 3 - 12 h. Halten Sie es bei 4 ° C unter kontinuierlichem Schütteln oder Drehen. Ersetzen Sie die Infiltrationslösung nach 1 und 2 - 4 h mit frischer Lösung. </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 2. Einbettung HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter einer Dunstabzugshaube mit Schutzhandschuhen durch. <ol><li> Vorbereiten der frischen Infiltrationslösung wie oben beschrieben (Schritt 1.1.4.1). Füge 4 ml Lösung B hinzu (für Details siehe Tabelle der Materialien ) bis 100 ml Infiltrationslösung zur Herstellung der Einbettungslösung. HINWEIS: Wenn eine präzise Ausrichtung der Probe in den Einbettungsformen erforderlich ist und die Einbettung mehrerer Proben parallel erfolgt, verlangsamen Sie die Polymerisation der Stammlösung, indem Sie das Becherglas in ein Eisbad geben. </li><li> Für Formteile mit einem Routinevolumen von 6 x 8 x 5 mm 3 oder 13 x 19 x 5 mm 3 oder kundenspezifischen Formen mit Volumina bis zu 8 x 10 x 15 mm verwenden 3 ( Fig. 2 ). </li><li> Füllen Sie die Formen mit Einbettungslösung und überführen Sie die Probe in die Form mitein Löffel. Während des Transports sicherstellen, dass die Probe vollständig mit Einbettungslösung bedeckt ist, um eine Luftfalle zu vermeiden. HINWEIS: Dies kann bei Raumtemperatur erfolgen, wenn sofort nach dem Sammeln der Proben und der Einbettungslösung aus dem Kühlschrank begonnen wird. <ol><li> Orientieren Sie die Probe in die Form mit Nadeln oder Pinzette. </li><li> Sobald die Einbettungslösung viskos wird, legen Sie einen Blockhalter (siehe Tabelle der Materialien ) auf die Form und fügen Sie die Einbettungslösung durch das zentrale Loch des Blockhalters ein, bis der Boden des Blockhalters mit 1 - 2 bedeckt ist Mm Einbettungslösung. </li><li> Dichtung des Formschalenbehälters durch Abdecken mit flüssigem Paraffinwachs und warten, bis es gehärtet ist. Alternativ ein zweites Formschalen-Tablett mit der Unterseite auf die Formschale mit Proben legen und mit Klebeband auf luftdicht abdichten. </li></ol></li><li> Lassen Sie die Blöcke, um die Polymerisation zu beenden, indem Sie die versiegelten Formschalen für 1 -2 Tage bei Raumtemperatur. </li><li> Für die Nachpolymerisationsbearbeitung legen Sie die Formschalen mit den polymerisierten Blöcken in einen Standard-Laborofen und backen bei 70 - 80 ° C für mindestens 1 - 2 Tage, bis sie dunkelrot werden. Sammeln Sie die Tabletts aus dem Ofen und entfernen Sie die Blöcke aus der Form. HINWEIS: Das Backen kann unter normalen Umgebungsbedingungen erfolgen. Die Abdeckfolie, die in der ersten Phase nach dem Einbetten eine luftdichte Abdichtung gewährleistet, kann entfernt werden, um die Farbe des Harzes nach 10 h zu überprüfen. Unmittelbar nach dem Backen ist das Harz weich und die Blöcke können leicht aus dem Spritzbecher entfernt werden. Innerhalb von 2 - 3 h sind sie hart und können bei Raumtemperatur für mehrere Monate gelagert werden. </li></ol> 3. Datenerzeugung HINWEIS: Der hier verwendete HREM-Prototyp 18 , 25 umfasst die folgenden Punkte: (i) Rotationsmikrotom mit BlockblockDer nach jedem Schnitt an seinem oberen Wendepunkt aufhört. (Ii) Standard, nicht wegwerfbares Mikrotommesser, Hartmetall, Profil D (Details siehe Tabelle der Werkstoffe ). (Iii) Kopf des Fluoreszenzmikroskops mit Objektivrevolver und GFP-Filterwürfel (Erregung 470/40, Emissionsfilter 525/50) in seiner optischen Achse. Die optische Achse ist senkrecht zur frisch geschnittenen Fläche eines auf dem Mikrotom angebrachten Blocks angeordnet und wird von einer Vorrichtung gehalten, die eine Auf- und Abwärtsbewegung ermöglicht. (Iv) Motorischer Kreuztisch mit dem Mikrotom. Der Tisch kann in Richtung der optischen Achse und seitlich verschoben werden. (V) Digitale Videokamera, die an das Mikroskop mit fluoreszierender Verbindung angeschlossen ist. (Vi) Monochrome Lichtquelle (470 nm). (Vii) Computer an die Kamera angeschlossen, mit Datenerzeugungssoftware (Details siehe Tabelle der Materialien ). <ol><li> Verfahren <ol><li> Geben Sie die Region von Interesse an. <ol><li> Standardlabor verwendenGht Quelle (siehe Tabelle der Materialien ), um das weiße Licht schräg zur Blockoberfläche zu leiten. </li><li> Identifizieren Sie die Umrisse des eingebetteten Materials, wie es auf die Blockoberfläche projiziert. Geben Sie den interessierenden Bereich und das spätere Sichtfeld auf die Blockoberfläche mit einem Stift oder Rasierklinge an. HINWEIS: Dieser Schritt ist zwingend erforderlich, um das Ausmaß des Sichtfeldes vor dem Schnitt zu definieren. </li></ol></li><li> Definiere das Sichtfeld. <ol><li> Montieren Sie den Harzblock mit Probe auf dem Mikrotom. </li><li> Bewegen Sie den Blockhalter in seine Stoppposition (oberer Wendepunkt der Blockhalterauslenkung). </li><li> Starten Sie die Digitalkamera und Datenerzeugungssoftware und erwerben Sie ein Livebild. </li><li> Wählen Sie eine Objektivlinse mit einer geeigneten Vergrößerung, um den auf der Blockoberfläche angegebenen Bereich zu decken. HINWEIS: Ziele mit Vergrößerungen 2.5X, 5X, 10X, 20X und numerische Blenden zwischen 0,07 und 0,40 werden häufig verwendet. </liAufrechtzuerhalten <li> Bewegen Sie die Optik nach oben und nach unten und das Mikrotom seitlich mit dem motorisierten Kreuztisch, bis der interessierende Bereich mit dem auf dem Computerbildschirm angezeigten Sichtfeld übereinstimmt. </li></ol></li><li> Fokus. <ol><li> Führen Sie Schritt für Schritt manuelles Schneiden durch, bis erste Strukturen der Probe sichtbar werden. </li><li> Ordnen Sie die Blockoberfläche in der Fokusebene der Optik an, indem Sie das Mikrotom in Richtung der optischen Achse bewegen. </li><li> Wählen Sie Abschnitt Dicke; Abschnittsdicken von 0,5 bis 5 μm werden empfohlen. </li></ol></li></ol></li><li> Datenerzeugung und -verarbeitung <ol><li> Starten Sie die Software-Routine, die das Schneiden und die Bilderfassung orchestriert. Befolgen Sie die dokumentierte Anleitung der Imaging-Capturing-Software. </li><li> Stoppen Sie die Software-Routine und legen Sie eine Skalierung Folie vor der Blockoberfläche, sobald die Probe vollständig geschnitten ist. </li><li> Erfassen Sie ein Bild interaktiv für spätere Kalibra. HINWEIS: Dies muss jedes Mal geschehen, wenn ein Objektiv in einem neu angeordneten Setup verwendet wird. </li><li> Konvertieren Sie die Bildserie in 8-Bit-Graustufenbilder im Format .jpg. </li><li> Laden Sie Bildreihen in 3D-Visualisierungssoftware und passen Sie Kontraste an. HINWEIS: Die Bildkonvertierung und die 3D-Visualisierung können mit verschiedenen handelsüblichen oder frei verfügbaren Standard-Softwarepaketen nach den Anweisungen der jeweiligen Software erfolgen. </li></ol></li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

HREM ist ein äußerst robustes mikroskopisches Verfahren, das sich ideal für die Visualisierung eines breiten Spektrums an organischen Materialien in der Biomedizin und der Industrie 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 befindet , 38 , 39 , 40 . Es kann als exklusive Bildgebungsmodalität eingesetzt werden, wie es derzeit von den Programmen der Entwicklungsstörungen (DMDD) 41 , 42 verwendet wird <suP&gt;, 43 , 44 oder als integrativen Teil der multimodalen Abbildungspipelines 45 . Eine voll funktionsfähige HREM-Datenerzeugungsvorrichtung kann aus herkömmlichen Laborkomponenten zusammengesetzt sein und umfasst ein motorisiertes Mikrotom, ein Mikroskop, einen motorisierten Kreuztisch und einen Computer mit entsprechender Software 25 . Es ist entscheidend, ein Mikrotom zu verwenden, das mit einem Blockhalter ausgestattet ist, der nach jedem Abschnitt an einer definierten Position reproduzierbar anhält und GFP-Filterwürfel innerhalb des optischen Weges. Allerdings können voll funktionsfähige All-Inclusive-Lösungen von Unternehmen wie Indigo Scientific bezogen werden. HREM steht den gleichen Einschränkungen wie alle histologischen Techniken gegenüber, mit der Ausnahme, dass keine Artefakte während der Schnitt- oder Schnittmontage eingeführt werden. Allerdings gibt es Einschränkungen, die sich aus der Notwendigkeit ergeben, die Proben vor dem Schneiden zu färben undAus den Eigenschaften des Einbettungsmaterials. Das Eindringen von Eosin durch die gesamte Probe ist erforderlich, um ausreichende Gewebekontraste zu erhalten; Sehr dichtes Material, Fettgewebe und anorganische Stoffe beeinträchtigen die Eosinpenetration und dies führt zu ungefärbten Geweben im Zentrum der Objekte. Mit speziellen Fixativen hilft Fleck Hautproben, aber es gibt noch keine richtige Methode für die vollständige Überwindung des Problems. Eine weitere Einschränkung ist, dass Harze, die mehr als 2 cm blockieren, dazu neigen, während des Schnittes zu brechen. Dies kann zum Teil durch das Schneiden der Proben und der Verarbeitung von Teilen getrennt vermieden werden. Eine korrekte Positionierung von kleinen Proben oder Proben mit unregelmäßigen Oberflächen in den Formen während der Einbettung ist oft problematisch. Die Abdeckung der Proben mit Agarose und die Verarbeitung der Agaroseblöcke, wie in dem Protokoll beschrieben, löst normalerweise dieses Problem 19 . Ein alternativer Ansatz, der auch hilft, wenn Blöcke während secti brechenEs ist, den bereits gehärteten Block aus seinem Halter zu entfernen und ihn nach dem beschriebenen Einbettungsverfahren neu einzubetten. Ein typischer HREM-Datensatz umfasst 500 bis 3.000 Einzelbilder. Seine numerische Auflösung wird durch den Abstand zwischen den aufeinanderfolgenden Bildern ( dh durch Schnittdicke), die Charakteristik des Kameradargets und die Eigenschaften der verwendeten Optik bestimmt. Wir verwendeten Schnittdicken zwischen 1 μm und 5 μm und erzielten gute Ergebnisse, obwohl die dargestellten Protokolle nicht vollständig aus den Artefakten 20 , 46 eliminieren. Diese Artefakte werden durch intensiv gefärbte Gewebe verursacht, die tief im Inneren des Blocks liegen, was zu einer Verwischung der Gewebeinformation auf den Blockoberflächen führt. Die Kameras hatten Zielabmessungen von 2.560 x 1.920 Pixel 2 , 2.048 x 2.048 Pixel 2 und 4.096 x 4.096 Pixel 2 und waren KombiMit 1,25X, 2,5X, 5X, 10X und 20X Objektiven. Dies führte zu numerischen Pixelgrößen zwischen 0,18 x 0,18 μm 2 und 5,92 x 5,92 μm 2 , was sich als ausreichend für die 3D-Analyse von Gewebearchitektur und Zellformen und sogar zur Visualisierung von Kernen erwies. Angesichts der hohen numerischen Auflösung sollten auch andere Zellorganellen sichtbar sein. Unzureichende Kontraste durch einfache Eosin-Färbung, und die optischen Eigenschaften der Ziele drastisch verringern die Möglichkeit, Strukturen zu unterscheiden. Die maximal wahre Ortsauflösung der HREM-Daten, die die numerische Apertur berücksichtigt, beträgt etwa 1 x 1 x 1 μm 3 und erlaubt somit nur eine effektive Diskriminierung von Strukturen größer als etwa 3 x 3 x 3 μm 3 . Ein gemeinsames Problem für alle digitalen bildgebenden Techniken ist der Kompromiß zwischen der Größe des Gesichtsfeldes, das den Teil der Probe definiert, der angezeigt werden kannD auf dem Kameradiel und die numerische Auflösung des Bildes. Je größer das Sichtfeld, desto geringer die maximal mögliche numerische Auflösung 46 . Der hier verwendete HREM-Aufbau erlaubt die Erzeugung von HREM-Daten mit einem Sichtfeld zwischen 0,74 x 0,7 mm 2 (20X Objektiv), das in einer numerischen Auflösung von 0,18 x 0,18 μm 2 und 12,12 x 12,12 mm 2 (1,25X Objektiv) angezeigt wird Eine numerische Auflösung von 2,96 x 2,96 μm 2 . Alternative, kommerzialisierte Setups können größere Sichtfelder bieten, aber auf Kosten der wahren Auflösung. Dennoch bieten sie hervorragende Ergebnisse, wie aus den Daten auf der Homepage des DMDD-Programms 47 hervorgeht .

Die strukturelle Analyse von organischen und anorganischen Materialien ist der erste Schritt zum Verständnis ihrer physikalischen Eigenschaften und ihrer Funktion. Die Grundlage für eine solche Analyse ist oft die zweidimensionale (2D) Information, die durch sorgfältige Beobachtung von histologischen Abschnitten gewonnen wird, mit einer Vielzahl einfacher und anspruchsvoller Bildgebungsverfahren, die Details der Gewebearchitektur, Zellmorphologie und Topologie, molekulare Zusammensetzung und biomechanische Eigenschaften extrahieren 1 , 2 , 3 Allerdings eignet sich 2D-Information nicht für die Erforschung räumlich komplexer Arrangements. Daher wurde in den letzten Jahrzehnten eine wachsende Zahl von In-vivo- und Ex-vivo- Methoden, die die Erzeugung von digitalen Volumendaten ermöglichen, etabliert und viele weitere sind in der Entwicklung. Das methodische Prinzip der meisten Volumenerzeugungsverfahren ist die Erzeugung von virtuellen StacksVon digitalen Bildern, die Abschnitte anzeigen, die durch virtuelle oder physikalische Teilung eines Objekts gewonnen werden. Wenn die Sektionsbilder ordnungsgemäß ausgerichtet sind, erzeugt dies ein Volume, das in virtuellen Sektionsebenen neu geschnitten werden kann oder für die Erstellung von 3D-Oberflächen- und Volume-gerenderten Modellen verwendet wird. Beliebte Techniken zur Visualisierung von Menschen und größeren biologischen Proben sind Magnetresonanztomographie (MRT), Computertomographie (CT), Positronenemissionstomographie (PET) und Einzelphotonenemissions-Computertomographie (SPECT). Kleine Exemplare werden in der Regel durch mikro-magnetische Resonanztomographie (μMRI), optische Projektionstomographie (OPT), optische Kohärenztomographie (OCT), photoakustische Tomographie (PAT), histologische Sektionsbasierte Methoden, konfokale Mikroskopie und Elektronentomographie 5 , 6 visualisiert , 7 , 8 , 9 , 10 <sUp&gt;, 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Eine relativ neue Volumendatenerzeugungstechnik, die digitale Daten von kleinen Exemplaren und histologischen Gewebeproben erzeugt, ist die HREM-Methode, die in enger Kooperation mit Tim Mohun 18 , 19 entwickelt wurde . Es handelt sich um eine einfache mikroskopbasierte Technik, die digitale Volumendaten aus harzgebundenem Material erzeugt, das auf einem Mikrotom geschnitten ist. Die Daten ermöglichen eine detaillierte Analyse der Gewebearchitektur und der Zellverteilungen sowie der metrischen Analyse von kleinen Merkmalen auf einer mittleren Lichtmikroskopie. HREM produziert Stapel von inhärent ausgerichteten digitalen Bildern, die wie aus e erkannt erscheinenOsin gefärbte histologische Abschnitte. Der Gewebekontrast und die Datenauflösung in Bezug auf das Gesichtsfeld übersteigen die von μCT, μMRI und OPT erzeugten Daten, sind aber niedriger als bei konfokaler Licht- und Elektronenmikroskopie 20 . Im Gegensatz zu letzterem ist HREM jedoch in der Lage, Proben mit relativ großen Volumina von bis zu 5 x 5 x 7 mm 3 in histologischer Qualität zu visualisieren. Eine Reihe von neueren Studien liefern detaillierte Charakterisierungen und Vergleiche von Vor- und Nachteilen der einzelnen bildgebenden Verfahren und beziehen sich im Hinblick auf die Objektivität auf diejenigen, die weitere Informationen über ihre Einschränkungen und potentiellen Anwendungsfelder 4 , 21 , 22 , 23 , 24 Diese Studie konzentriert sich auf die HREM Imaging-Methode und zielt darauf ab, zu bietenSehr einfache Protokolle zur Erzeugung von HREM-Daten eines breiten Spektrums von organischen Materialien sowie Beispiele für ihre Anwendung. Der Workflow zur Erstellung von HREM-Daten ist einfach und gilt für alle Materialien, die in Methacrylatharz eingebettet werden können ( Abbildung 1 ). Dennoch gibt es gewebespezifische Unterschiede in der Probenvorbereitung, die berücksichtigt werden müssen. Wir stellen daher drei Standardprotokolle zur Vorbereitung verschiedener Proben zur Verfügung. Einbettungs- und Datenerzeugungsprotokollschritte sind für alle identisch.

<table><tbody><tr><td>JB-4 Plus Embedding Kit</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>18570-1</td><td>includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B</td></tr><tr><td>Polyethylene Molding Cup Trays, 6 x 8 x 5 mm hexagon (9 cavities)</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>17177A-3</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Molding Cup Trays, 13 x 19 x 5 mm (9 cavities)</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 Plastic Block Holders</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>15899-50</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Waldeck GmbH &amp;amp; Co. KG, Division Chroma</td><td>1A-196</td><td></td></tr><tr><td>Microtec CUT 4060E</td><td></td><td></td><td>rotary microtome</td></tr><tr><td>Leica DM LM, fluorescence compound microscope</td><td>Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP filter set</td><td>Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td><td>11090937180000</td><td></td></tr><tr><td>Motorised cross table</td><td>Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH &amp;amp; CO. KG</td><td>KT5-LSMA</td><td></td></tr><tr><td>Digital video camera SPOT-FLEX</td><td>Visitron Systems GmbH.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>precisExcite High-Power LED</td><td>Visitron Systems GmbH.</td><td></td><td>light source</td></tr><tr><td>VisiView 2.1.4</td><td>Visitron Systems GmbH.</td><td></td><td>Image capturing software</td></tr><tr><td>Hard metal knife (tungsten carbide), profile D</td><td>Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KL 2500 LCD</td><td>Schott AG</td><td></td><td>light source</td></tr></tbody></table>

high-resolution episcopic microscopy (hrem) - simple and robust protocols for processing and visualizing organic materials

Wir bieten einfache Protokolle zur Erstellung digitaler Volumendaten mit der hochauflösenden episkopischen Mikroskopie (HREM) Methode. HREM ist in der Lage, organische Materialien mit Volumina bis zu 5 x 5 x 7 mm 3 in typischen numerischen Auflösungen zwischen 1 x 1 x 1 und 5 x 5 x 5 μm 3 abzubilden. Die Proben werden in Methacrylatharz eingebettet und auf ein Mikrotom geschnitten. Nach jedem Abschnitt wird ein Bild der Blockoberfläche mit einer digitalen Videokamera aufgenommen, die auf dem mit dem zusammengesetzten Mikroskopkopf verbundenen Phototube sitzt. Die optische Achse durchläuft einen Filterwürfel aus grünem fluoreszierendem Protein (GFP) und ist mit einer Position ausgerichtet, an der der Bockhalterarm nach jedem Abschnitt ruht. Auf diese Weise wird eine Reihe von inhärent ausgerichteten digitalen Bildern erzeugt, die nachfolgende Blockflächen anzeigen. Das Laden einer solchen Bildserie in die dreidimensionale (3D) Visualisierungssoftware erleichtert die sofortige Umwandlung in digitale Volumendaten, die virtuelle s erlaubenEctioning in verschiedenen orthogonalen und schrägen Ebenen und die Schaffung von Volumen und Oberfläche gerendert Computer-Modelle. Wir präsentieren drei einfache, gewebespezifische Protokolle für die Verarbeitung verschiedener Gruppen von organischen Proben, einschließlich Maus-, Küken-, Wachtel-, Frosch- und Zebelfisch-Embryonen, menschliches Biopsie-Material, unbeschichtetes Papier und Hautersatzmaterial.

HREM erzeugt eine Reihe von inhärent ausgerichteten digitalen Bildern mit Kontrasten ähnlich den Bildern von Hämatoxylin / Eosin-gefärbten histologischen Abschnitten. Im Gegensatz zu 2D-Schnittbildern ermöglichen Stapel von HREM-Bildern die Visualisierung und Analyse der Gewebearchitektur, der Morphologie und der Topologie einer breiten Vielfalt an organischen Materialien in 3D. Der hohe Kontrast erleichtert oftmals eine schnelle und einfache 3D-Visualisierung von volumengesteuerten Computermodellen und halbautomatischen Konturbefunden für die Erzeugung von Oberflächenmodellen. Die Größe der HREM-Daten variiert je nach Größe des Kameradargets, dem Modus der Bildaufnahme (8, 12, 16 Bit, Graustufen, Farbe) und der Anzahl der einzelnen Blockbildbilder. Kleinere Datensätze von 1.000 8-bit.jpg Graustufenbildern von 2.048 Pixeln x 2.048 Pixeln haben eine Größe von ca. 900 MB. Größere Datensätze von 3.000 8-bit.jpg Graustufenbildern von 4.096 pIxel x 4,096 Pixel haben Volumen von ca. 20 GB. Die Protokolle sind einfach und robust, und während des letzten Jahrzehnts wurden sie zur Erzeugung von HREM-Daten von vielen verschiedenen Exemplaren eingesetzt. Protokoll 1.1 wurde für die Verarbeitung von ganzen Embryonen biomedizinischer Modellorganismen mit einer Länge von bis zu 1 cm und Embryo-Gewebeproben mit einer Abmessung von bis zu 5 x 5 x 5 mm 3 optimiert; Wir haben diese Methode zur Herstellung von HREM-Daten von Embryonen der folgenden Spezies verwendet: Maus ( Mus Musculus) , Chick ( Gallus gallus ), Zebra Fisch ( Danio rerio ), Wachtel ( Coturnix Coturnix) , afrikanischer Krallenfrosch ( Xenopus laevis ), Pferd ( Equus ferus caballus ), Softweed Bug ( Oncopeltus fasciatus ), Krokodil ( Crocodylia ) und Oktopus ( Octopus vulgaris ). Die Daten aller Arten waren von hervorragender Qualität ( zB Abbildung 3 ) <p clAss = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Protokollabschnitt 1.2 wurde für die Verarbeitung von juvenilen und adulten Gewebeproben mit Abmessungen bis zu 5 x 5 x 7 mm 3 optimiert und zur Visualisierung von Gewebeproben der Haut, Leber, Pankreas, Niere, Schilddrüse, Herz, gestreifter Muskel, Gehirn, Nerven und Tumormodelle, die von Menschen geerntet wurden ( Homo sapiens ), Mäuse ( Mus Musculus ), Ratten ( Rattus norvegicus ), Schweine ( Sus scrofa domestica ) Frettchen ( Mustela Furo ), Fruchtfliege ( Drosophila melanogaster ) und Zebrafisch ( Danio rerio ). Während die Ergebnisse bei den meisten Exemplaren hervorragend waren ( z. B. Abbildung 4 , Animation 1 ), blieben die sehr zentralen Teile der Haut (mit Epidermis) und Hirnproben größer als 3 x 3 x 3 mm 3 oft unbemerkt wegen unzureichender Penetration von Eosin durch Diese Gewebe. Protokoll sEction 1.3 wurde für die Verarbeitung von faserigem organischem Material optimiert und zur Visualisierung der Faserarchitektur von gestrichenem Papier, unbeschichtetem Papier, nativem dermalen Substitutionsmaterial und stammzellgestemmtem Hautmaterial verwendet. Diese Proben waren einfach und schnell zu verarbeiten. Die Daten des unbeschichteten Papiers und der meisten Hautersatzstoffe waren von guter Qualität ( Abbildung 5 , Animation 2 ). Bei der Verarbeitung des beschichteten Papiers traten Probleme auf, als das anorganische Material das Eindringen von Eosin behinderte. Ein anderes Problem trat bei der Verarbeitung der Hautersatzstoffe auf der Basis von Agar auf, weil sie teilweise durch die Infiltrationslösung verdaut wurden. <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig1.jpg" /> Abbildung 1: Workflow. Die in den roten Boxen gezeigten Schritte erfordern Änderungen nach den Mustermerkmalen. Schritte in den grünen Kästen sind die, dieSind in allen Proben ähnlich. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig2.jpg" /> Abbildung 2: Kundenspezifische Formen. Formen können angepasst werden, indem man ein Loch in die ursprüngliche Form schneidet, die Glühbirne einer Pasteurpipette einsetzt und mit dem Modelliermaterial versiegelt. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig3.jpg" /> Abbildung 3: Beispielhaft sichtbare Embryonen. (A, B) Mausembryo am embryonalen Tag geerntet, E = 9,5. HREM-Schnittbild ist in (A) </Stark&gt;. Lautstärke gerendertes 3D-Modell, das die Oberfläche zeigt, ist in (B) gezeigt . (C) Virtueller sagittaler Schnitt durch ein Volumenmodell des Halses eines E15.5-Maus-Embryos. (D) Chick-Embryo bei der Entwicklung Hamburger Hamilton (HH) Stufe 18. Oberflächenmodell der Lumina der Herz-Kreislauf-Komponenten kombiniert mit Volumen-Rendering aller Embryo-Gewebe. Maßstäbe = 200 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig4.jpg" /> Abbildung 4: Beispielhaft ausgewiesene erwachsene Gewebeproben. (A) Teil eines HREM-Schnittbildes durch einen menschlichen Nerv. Inlay zeigt einen Abschnitt des Bildes im Detail. (B) Teil eines HREM-Schnittbildes durch Schweineleber. Beachten Sie die nUclei (C) Teil eines HREM-Schnittbildes menschlichen Lymphgewebes (D, E) Dichte Haut eines menschlichen Daumenpolsters Volumen gerendertes 3D-Modell der gesamten Biopsie. (D) Oberfläche gerenderten Modelle von Arterien, Venen und Nerven vor einer virtuellen Resektion durch HREM-Daten (E) . (F) Experimenteller Tumor im erwachsenen Mausgewebe Volume gerendert 3D-Modell vor drei virtuellen Abschnitten durch HREM-Daten. Beachten Sie die nekrotischen Teile (Pfeilspitzen). Maßstäbe = 200 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig5.jpg" /> Abbildung 5: Beispielhaft fasziniertes Material. (A, B) HREM-Schnittbild von unbeschichtetem, braunem Papier (B) </sTrong&gt; zeigt einen Abschnitt von (A) . Beachten Sie die Fasern und ihr Lumen. (C) HREM-Abschnitt aus gestrichenem Papier Beachten Sie, dass die Fasern ungefärbt bleiben. (D) Volumenmodell des nativen Hautmaterials. Beachten Sie das unterschiedliche Kaliber und die Form der Fasern. Maßstäbe = 100 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov1.jpg" /> Animation 1: Volume Rendered Modell der dicken Haut eines menschlichen Thumb Pad. Die Größe des Gewebeblocks beträgt etwa 4,2 x 2,7 x 2,7 mm 3 . Voxelgröße beträgt 1,07 x 1,07 x 2 μm 3 . <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/animation1.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download).</a> <pClass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov2.jpg" /> Animation 2: Volume Rendered Modell des Native Dermal Ersatzmaterials. Die Größe der Probe beträgt etwa 1,2 x 0,85 x 0,4 mm 3 . Voxelgröße beträgt 0,54 x 0,54 x 2 μm 3 . <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/animation2.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download).</a>

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High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Wir bieten einfache und robuste Protokolle zur Verarbeitung von Biopsiematerialien verschiedener Arten, Embryonen biomedizinischer Modellorganismen und Proben von anderen organischen Geweben, um eine digitale Volumendatenerzeugung mit der hochauflösenden episkopischen Mikroskopie zu ermöglichen.

Hochauflösende episkopische Mikroskopie (HREM) - Einfache und robuste Protokolle zur Verarbeitung und Visualisierung von organischen Materialien

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

high-resolution-episcopic-microscopy-hrem-simple-robust-protocols-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

10.1K Aufrufe.  Medical University of Vienna.  Wir bieten einfache und robuste Protokolle zur Verarbeitung von Biopsiematerialien verschiedener Arten, Embryonen biomedizinischer Modellorganismen und Proben von anderen organischen Geweben, um eine digitale Volumendatenerzeugung mit der hochauflösenden episkopischen Mikroskopie zu ermöglichen. 

Serie: High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

Hochauflösende LWL-Mikroendoskopiesysteme für In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Forschung

Biotechnik

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) morphometric data. Here, we describe the detailed protocol to image the entire mouse embryo. The protocol consists of four major sections: sample preparation, embedding, image acquisition and finally, 3D visualization. The technology requires specimens to be stained with a fluorescent dye, which can be problematic for large or dense specimens. To overcome this limitation, we have improved the existing protocol to enhance tissue penetration of the dye by pretreating the specimen with a solution containing urea and sodium dodecyl sulfate. The protocol uses only routine laboratory equipment and reagents for easy adaptation in standard laboratory settings. We show that the resulting high-resolution 3D images faithfully recapitulate the detailed morphologic features of the internal organs of mouse embryos, thereby permitting morphometric analyses. Together, we present a detailed and improved protocol using standard laboratory equipment to acquire high-resolution 3D images of small and large sized specimens.

We describe a detailed protocol using high-resolution episcopic microscopy to acquire three-dimensional (3D) images of mouse embryos. This improved protocol utilizes a modified tissue preparation method to enhance penetration of the fluorescent dye, thereby permitting morphometric analysis of both small and large-sized specimens.

Schnelle Erfassung von 3D-Bildern mit hoher Auflösung Episcopic Mikroskopie

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

Entwicklungsbiologie

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, methods involved in processing different biological samples involve unique practices. All conventional practices described in the literature for processing samples still find useful applications, but subtle changes in the sample preparation can alter image quality, as well as, introduce artifacts. Hence, using a unique sample preparation technique specific to the type of tissue analyzed is required to obtain a good quality image with ultrastructural resolution. The focus of this study is to provide the optimal sample preparation protocols for imaging embryos, rigid eggshells, and fungal cultures using SEM. The following optimizations were recommended to yield good results for the three different delicate biological samples studied. Use of milder fixatives like 4% paraformaldehyde or 3% glutaraldehyde followed by dehydration with ethanol series is mandatory. Fungal mycelium on agar blocks obtained by slide cultures yields a better ultrastructural integrity compared to cultures taken directly from agar plates. Chemical drying of embryos with HMDS provides drying without introducing surface tension artifacts compared to critical point drying. HMDS prevents cracking caused by shrinkage as samples are less brittle during drying. However, for fungal culture, critical point drying provides acceptable image quality compared to chemical drying. Eggshells can be imaged with no special preparation steps except for thorough washing and air drying prior to mounting. Preparation methodologies were standardized based on acceptable image quality obtained with each trial.&#160;

Here, we present detailed processing protocols for imaging delicate tissue samples using scanning electron microscopy (SEM). Three different processing methods, namely, hexamethyl disilazana (HMDS) chemical drying, simple air drying, and critical point drying are described for preparing rigid eggshells, embryos at early developmental stages, and fungal cultures respectively.

Verarbeitung von Embryo-, Eierschalen- und Pilzkultur für die Rasterelektronenmikroskopie

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Umwelt

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a combination of light and electron microscopy. Samples embedded in resin are sectioned into arrays consisting of ribbons of hundreds of ultrathin sections and deposited on pieces of silicon wafer or conductively coated coverslips. Arrays are imaged at low resolution using a digital consumer like smartphone camera or light microscope (LM) for a rapid large area overview, or a wide field fluorescence microscope (fluorescence light microscopy (FLM)) after labeling with fluorophores. After post-staining with heavy metals, arrays are imaged in a scanning electron microscope (SEM). Selection of targets is possible from 3D reconstructions generated by FLM or from 3D reconstructions made from the SEM image stacks at intermediate resolution if no fluorescent markers are available. For ultrastructural analysis, selected targets are finally recorded in the SEM at high-resolution (a few nanometer image pixels). A ribbon-handling tool that can be retrofitted to any ultramicrotome is demonstrated. It helps with array production and substrate removal from the sectioning knife boat. A software platform that allows automated imaging of arrays in the SEM is discussed. Compared to other methods generating large volume EM data, such as serial block-face SEM (SBF-SEM) or focused ion beam SEM (FIB-SEM), this approach has two major advantages: (1) The resin-embedded sample is conserved, albeit in a sliced-up version. It can be stained in different ways and imaged with different resolutions. (2) As the sections can be post-stained, it is not necessary to use samples strongly block-stained with heavy metals to introduce contrast for SEM imaging or render the tissue blocks conductive. This makes the method applicable to a wide variety of materials and biological questions. Particularly prefixed materials e.g., from biopsy banks and pathology labs, can directly be embedded and reconstructed in 3D.

This protocol targets specific cells in tissue for imaging at nanoscale resolution using a scanning electron microscope (SEM). Large numbers of serial sections from resin-embedded biological material are first imaged in a light microscope to identify the target and then in a hierarchical manner in the SEM.

Multimodale hierarchische Darstellung der Schnittserien für die Suche nach spezifischen zellulären Ziele innerhalb großer Mengen

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Biologie

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Visualisierung von synaptischen Strukturen der Netzhaut in 3D mit Volumenelektronenmikroskopie

Preparation of Retinal Samples for Volume Electron Microscopy

Volume electron microscopy (Volume EM) has emerged as a powerful tool for visualizing the 3D structure of cells and tissues with nanometer-level precision. Within the retina, various types of neurons establish synaptic connections in the inner and outer plexiform layers. While conventional EM techniques have yielded valuable insights into retinal subcellular organelles, their limitation lies in providing 2D image data, which can hinder accurate measurements. For instance, quantifying the size of three distinct synaptic vesicle pools, crucial for synaptic transmission, is challenging in 2D. Volume EM offers a solution by providing large-scale, high-resolution 3D data. It is worth noting that sample preparation is a critical step in Volume EM, significantly impacting image clarity and contrast. In this context, we outline a sample preparation protocol for the 3D reconstruction of photoreceptor axon terminals in the retina. This protocol includes three key steps: retina dissection and fixation, sample embedding processes, and selection of the area of interest.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Retinale neurowissenschaftliche Studien mit Volumenelektronenmikroskopie

This protocol describes the detailed steps for preparing retinal samples for volume electron microscopy, focusing on the structural features of retinal photoreceptor terminals.

Präparation von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie

Volume electron microscopy (Volume EM) has emerged as a powerful tool for visualizing the 3D structure of cells and tissues with nanometer-level ...

Neurowissenschaften

<meta charset="utf8"></head><body>Optimiertes Protokoll für die Vorbereitung von retinalen Organoid-Proben für TEM

Preparing Retinal Organoid Samples for Transmission Electron Microscopy

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) under specific conditions. Synapse development and maturation in ROs have been studied immunocytochemically and functionally. However, the direct evidence of the synaptic contact ultrastructure is limited, containing both special ribbon synapses and conventional chemical synapses. Transmission electron microscopy (TEM) is characterized by high resolution and a respectable history elucidating retinal development and synapse maturation in humans and various species. It is a powerful tool to explore synaptic structure in ROs and is widely used in the research field of ROs. Therefore, to better explore the structure of RO synaptic contacts at the nanoscale and obtain high-quality microscopic evidence, we developed a simple and repeatable method of RO TEM sample preparation. This paper describes the protocol, reagents used, and detailed steps, including RO fixation preparation, post fixation, embedding, and visualization.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Analyse der synaptischen Ultrastruktur in reifen retinalen Organoiden mit TEM

This protocol provides an optimized and elaborate preparation procedure for retinal organoid samples for transmission electron microscopy. It is suitable for applications that involve the analysis of synapses in mature retinal organoids.

Vorbereitung von retinalen Organoidproben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem ...

Hochauflösende episkopische Mikroskopie (HREM) - Einfache und robuste Protokolle zur Verarbeitung und Visualisierung von organischen Materialien

Zusammenfassung

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Hochauflösende LWL-Mikroendoskopiesysteme für In situ Cellular Imaging

Schnelle Erfassung von 3D-Bildern mit hoher Auflösung Episcopic Mikroskopie

Verarbeitung von Embryo-, Eierschalen- und Pilzkultur für die Rasterelektronenmikroskopie

Multimodale hierarchische Darstellung der Schnittserien für die Suche nach spezifischen zellulären Ziele innerhalb großer Mengen

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

Präparation von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie

Präparation von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie

Präparation von Netzhautproben für die Volumenelektronenmikroskopie

Vorbereitung von retinalen Organoidproben für die Transmissionselektronenmikroskopie