Name: application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices
Uploaded: 2017-07-31T14:00:00.000+00:00
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Wir sind dankbar für die finanzielle Unterstützung der Whitehall Foundation. Wir danken Samuel T. Kissinger für die wertvollen Kommentare.

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	<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposome+preparation+for+imaging+and+patch-clamp+electrophysiology.">Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).</li><li>Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATLAB-based+automated+patch-clamp+system+for+awake+behaving+mice.">MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+operation+of+the+autopatcher+for+automated+intracellular+neural+recording+in+vivo.">Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo.</a> Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+autopatching+with+automated+pipette+and+cell+detection+in+vitro.">Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro.</a> J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).</li><li>Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-assisted+multi-electrode+patch-clamp+system.">A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system.</a> J Vis Exp. (80), e50630 (2013).</li><li>Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+patch+clamp+recording+performed+on+a+planar+glass+chip.">Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip.</a> Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. (20), (2008).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACQ4:+an+open-source+software+platform+for+data+acquisition+and+analysis+in+neurophysiology+research.">ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research.</a> Front Neuroinform. 8 (3), (2014).</li><li>Kolb, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+patch-clamp+pipettes+for+immediate+reuse.">Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li></ol>

Eine nicht vorläufige Patentanmeldung &quot;SYSTEME UND METHODEN FÜR AUTOMATISIERTE BILDGEFÜHRTE PATCH-CLAMP-ELEKTROPHYSIOLOGIE IN VITRO&quot; US Serial Nr .: 15 / 353,719, wurde am 16. November 2016 eingereicht, Ref. Nr .: PRF 67270-02.

Hier beschreiben wir eine Methode für automatische bildgeführte Patch-Clamp-Aufnahmen in vitro . Die wichtigsten Schritte in diesem Prozess sind wie folgt zusammengefasst. Zuerst wird Computer Vision verwendet, um die Pipettenspitze automatisch mit einer Reihe von Bildern zu erkennen, die über ein Mikroskop aufgenommen wurden. Diese Information wird dann verwendet, um die Koordinatentransformationsfunktion zwischen dem Mikroskop und den Manipulator-Koordinatensystemen zu berechnen. Computer Vision wird verwendet, um automatisch fluoreszenzmarkierte Zellen zu erkennen und ihre Koordinaten zu identifizieren. Diese Schritte sind mit Pipetten-Targeting und dem automatischen Patching-Algorithmus unter Verwendung der Open-Source-Python-Programmiersprache, PyQT und OpenCV-Bibliotheken integriert. Im Vergleich zu bestehenden In-vitro- Patch-Clamp-Methoden macht dieses System in den verschiedenen Bereichen deutliche Verbesserungen. Es minimiert menschliches Eingreifen. Dieses System automatisiert die meisten Schritte im Patch-Clamp-Experiment, minimiert die AnforderungFür menschliches Eingreifen. Einige der verbleibenden manuellen Schritte, einschließlich der Umschaltung zwischen den Low- / High-Magnification-Mikroskop-Objektiven, können mit zusätzlichen motorisierten Hardware automatisiert werden. Die Patch-Clamp-Methode verbessert den Durchsatz. Patch-Clamp-Experimente mit diesem System erzielten höhere Erfolgsraten und kürzere Zeiten für jede Studie, was zu einer deutlichen Steigerung des Gesamtdurchsatzes beiträgt. Der Computer-Vision-Algorithmus für die Fluoreszenzzellenerfassung und die Pipettenspitzenerkennung ist sehr robust und die Fehlerrate war sehr gering. Der durchschnittliche Fehler für die Pipettenspitzenerfassung betrug 1,6 μm, und die falsch-positive Rate für die Fluoreszenzzelldetektion betrug 4,9% ± 2,25%. Ein detaillierter Vergleich zwischen traditionellen manuellen Patching und automatischen Patching wurde gemacht 6 . Detaillierte Dokumentation von Experimenten ist möglich. Patch-Protokolle jeder Studie können gespeichert und analysiert werden post-hoc . So ausführlichDie Dokumentation war bisher nicht für das manuelle Patching verfügbar. Dies ermöglicht die systematische Analyse von Patching-Experimenten in einzigartigen experimentellen Bedingungen, Zelltypen, Spezies und Slice-Präparaten. Diese Methode zeigt die Kompatibilität mit Standard- In-vitro- Patch-Clamp-Ausrüstung. Unser System, wie in diesem Manuskript gezeigt, wurde entwickelt, um bestehende in vitro Patch-Clamp-Rigs zu erweitern, so dass sie die Fähigkeit, automatische Patching zu führen. Im Gegensatz zum Planar-Patch-Ansatz eignet sich dieses System auch für Laboratorien, die bereits eine manuelle Patch-Clamping durchführen, um ihre Geräte zu minimalen Kosten umzuwandeln. Gleichzeitig gibt es noch die Möglichkeit, manuell oder halbautomatisch mit demselben System zu patch. Wegen der Anpassungsfähigkeit des oben erwähnten Systems ist die Verbindung der Hardware und die Konfiguration der Software vom Experimentator erforderlich, wenn das System zum ersten Mal eingerichtet wird. Probleme können auftretenVon falscher Portzuweisung und unzureichenden Treiberbibliotheken für die Steuerung bestimmter Hardware. Bitte beachten Sie die Schritte 1.2 - 1.4 bei der Fehlersuche. Im Vergleich zur Teilautomatisierung bestehender Anlagen erreicht dieses System bei der konventionellen In-vitro- Patch-Clamping von akuten Hirnschnitten (und anderen in vitro- Präparaten) den maximalen Automatisierungsgrad. Dies gilt für alle Schritte, von der Zellenerkennung bis zur Pipettenkalibrierung bis zum Patching 7 , 11 . Der einzige Engpass ist der manuelle Prozess des Füllens und Änderns der Patchpipetten zwischen den Trails. Die jüngsten Entwicklungen bei der Wiederverwendung von Patchpipetten können dieses Problem potenziell lösen 12 . Neben der Qualität der Scheibenvorbereitung entsteht der häufigste Grund für erfolglose Versuche von manipulatorischen mechanischen Fehlern und der Bewegung der Scheibe in der Kammer. Diese Einschränkungen sind außerhalb unserer Kontrolleaktuelles System. Es werden Anstrengungen unternommen, um eine enge, Echtzeit-Erkennung und Steuerung der Pipettenbewegung zu implementieren, um dieses Problem zu berücksichtigen. Für die zukünftige Entwicklung sind wir daran interessiert, die derzeitigen Fluoreszenzzellen-Erkennungsfunktionen auf die allgemeine Zelldetektion unter DIC-Optik zu erweitern.

Die Patch - Clamp - Technik wurde zuerst von Neher und Sakmann in den 1970er Jahren entwickelt , um die Ionenkanäle von erregbaren Membranen 1 zu studieren. Seitdem wurde die Patch-Clamping auf die Untersuchung vieler verschiedener Subjekte auf zellulärer, synaptischer und Circuit-Ebene angewendet - sowohl in vitro als auch in vivo - in vielen verschiedenen Zelltypen, einschließlich Neuronen, Kardiomyozyten, Xenopus-Oozyten und künstlichen Liposomen 2 . Dieser Prozess beinhaltet die korrekte Identifizierung und Ausrichtung einer Zelle von Interesse, komplizierte Mikromanipulator-Steuerung, um die Patch-Pipette in der Nähe der Zelle zu bewegen, die Anwendung von positiven und negativen Druck auf die Pipette zur richtigen Zeit, um eine enge Gigaseal Patch, Und ein Einbruch, um eine Ganzzell-Patch-Konfiguration zu etablieren. Patch-Clamping wird in der Regel manuell durchgeführt und erfordert umfangreiche Schulungen zu meistern. Auch für einen Forscher, der mit dem Patch erlebt wurdeKlemme, die Erfolgsquote ist relativ gering. In jüngster Zeit wurden mehrere Versuche unternommen, Patch-Clamp-Experimente zu automatisieren. Zwei Hauptstrategien haben sich entwickelt, um die Automatisierung zu erreichen: die Erweiterung der Standard-Patch-Clamp-Ausrüstung, um die automatische Steuerung des Patching-Prozesses und die Gestaltung neuer Geräte und Techniken von Grund auf zu ermöglichen. Die frühere Strategie ist an vorhandene Hardware anpassbar und kann in einer Vielzahl von Patch-Clamp-Anwendungen verwendet werden, einschließlich in vivo Blind Patch Clamp 3 , 4 , 5 , in vitro Patch Clamp von akuten Hirnschnitten, organotypischen Slice Kulturen und kultivierten dissoziierten Neuronen 6 . Es ermöglicht die Abfrage von komplexen lokalen Schaltungen durch die Verwendung mehrerer Mikromanipulatoren gleichzeitig 7 . Die Planar-Patch-Methode ist ein Beispiel für die neue Entwicklungsstrategie, die gleichzeitig den Hochdurchsatz erreichen kannAtch Klemme von Zellen in Suspension für Drogen-Screening-Zwecke 8 . Allerdings ist das Planar-Patch-Verfahren nicht für alle Zelltypen, insbesondere für Neuronen mit langen Prozessen oder intakten Schaltungen, die umfangreiche Verbindungen enthalten, anwendbar. Dies beschränkt seine Anwendung auf die Abbildung der komplizierten Schaltungen des Nervensystems, was ein wichtiger Vorteil der traditionellen Patch-Clamp-Technologie ist. Wir haben ein System entwickelt, das den manuellen Patch-Clamp-Prozess in vitro automatisiert, indem er Standard-Patch-Clamp-Hardware erweitert. Unser System, Autopatcher IG, bietet automatische Pipettenkalibrierung, Fluoreszenzzelle Zielidentifikation, automatische Steuerung der Pipettenbewegung, automatisches Ganzzellpatching und Datenlogging. Das System kann automatisch mehrere Bilder von Gehirnscheiben in verschiedenen Tiefen erwerben; Analysiere sie mit Computer Vision; Und extrahieren Informationen, einschließlich der Koordinaten von fluoreszenzmarkierten Zellen. Diese Information kann dann seinVerwendet, um zu zielen und automatisch patch Zellen von Interesse. Die Software ist in Python geschrieben - eine freie, Open-Source-Programmiersprache - mit mehreren Open-Source-Bibliotheken. Dies sorgt für die Zugänglichkeit für andere Forscher und verbessert die Reproduzierbarkeit und Strenge der elektrophysiologischen Experimente. Das System ist modular aufgebaut, so dass zusätzliche Hardware problemlos mit dem hier dargestellten System verbunden werden kann.

<table><tbody><tr><td>CCD Camera</td><td>QImaging</td><td>Rolera Bolt</td><td></td></tr><tr><td>Electrophysiology rig</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope Pro 2000</td><td>Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is &amp;ldquo;Linlab2&amp;rdquo;.</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>computer-controlled microelectrode amplifier</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td>LED light source</td><td>Cool LED</td><td>pE-100</td><td>488 nm wavelength</td></tr><tr><td>Data acquisition board</td><td>Measurement Computing</td><td>USB1208-FS</td><td>Secondary DAQ.&lt;br/&gt; See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td></tr><tr><td>Solenoid valves</td><td>The Lee Co.</td><td>LHDA0531115H</td><td></td></tr><tr><td>Air pump</td><td>Virtual industry</td><td>VMP1625MX-12-90-CH</td><td></td></tr><tr><td>Air pressure sensor</td><td>Freescale semiconductor</td><td>MPXV7025G</td><td></td></tr><tr><td>Slice hold-down</td><td>Warner instruments</td><td>64-1415 (SHD-40/2)</td><td>Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm</td></tr><tr><td>Python</td><td>Anaconda</td><td>version 2.7 (32-bit for windows)</td><td>https://www.continuum.io/downloads</td></tr><tr><td>Screw Terminals</td><td>Sparkfun</td><td>PRT - 08084</td><td>Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin)</td></tr><tr><td>(2-Pin)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Channel MOSFET 60 V 30 A</td><td>Sparkfun</td><td>COM - 10213</td><td></td></tr><tr><td>DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-07937</td><td></td></tr><tr><td>LED - Basic Red 5 mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09590</td><td></td></tr><tr><td>LED - Basic Green 5mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09592</td><td></td></tr><tr><td>DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-12748</td><td></td></tr><tr><td>Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA</td><td>Sparkfun</td><td>TOL-09442</td><td></td></tr><tr><td>Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-11367</td><td></td></tr><tr><td>Locking Male x Female x Female Stopcock</td><td>ARK-PLAS</td><td>RCX10-GP0</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings</td><td>Fisher scientific</td><td>14-171-129</td><td>Outer Diameter: 1/8 in.&lt;br/&gt; Inner Diameter: 1/16 in.</td></tr><tr><td>BNC male to BNC male coaxial cable</td><td>Belkin Components</td><td>F3K101-06-E</td><td></td></tr><tr><td>560 Ohm Resistor (5% tolerance)</td><td>Radioshack</td><td>2711116</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>General Valve</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr></tbody></table>

application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices

Voll-Zell-Patch-Clamp ist die Gold-Standard-Methode, um die elektrischen Eigenschaften von einzelnen Zellen zu messen. Allerdings bleibt die In-vitro- Patch-Clamp aufgrund ihrer Komplexität und ihrer hohen Abhängigkeit von Benutzerbetrieb und -steuerung eine anspruchsvolle und leistungsstarke Technik. Dieses Manuskript zeigt ein bildgeführtes automatisches Patch-Clamp-System für in-vitro- Ganzzell-Patch-Clamp-Experimente in akuten Hirnschnitten. Unser System implementiert einen computervisionsbasierten Algorithmus, um fluoreszenzmarkierte Zellen zu detektieren und sie zum vollautomatischen Patching mit einem Mikromanipulator und einer internen Pipettendruckkontrolle zu zielen. Der gesamte Prozess ist hoch automatisiert, mit minimalen Anforderungen für menschliches Eingreifen. Echtzeit-experimentelle Informationen, einschließlich elektrischer Widerstand und interner Pipettendruck, werden elektronisch für die zukünftige Analyse und für die Optimierung auf verschiedene Zelltypen dokumentiert. Obwohl unser System im Kontext der akuten brai beschrieben wirdN Slice-Aufnahmen kann es auch auf die automatisierte bildgeführte Patch-Clamp von dissoziierten Neuronen, organotypischen Slice-Kulturen und anderen nicht-neuronalen Zelltypen angewendet werden.

<html> Unser System wurde auf seine Fähigkeit getestet, Zellen in akuten Hirnschnitten, Maus induzierten Pluripotenten Stammzellen (iPSCs) differenziert in Neuronen, und HEK 293 Zellen künstlich ausdrücken Kanäle von Interesse. Abbildung 3 zeigt ein Experiment mit Thy1-ChR2-YFP-transgenen Mäusen (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J), die auf fluoreszenzmarkierte Schicht-5-Pyramiden-Neuronen im visuellen Kortex zielen. Die Zielzelle war eine der automatisch identifizierten grün fluoreszenz-positiven Zellen ( Abbildung 3b ). Fig. 3a ist das Differential Interference Contrast (DIC) -Bild des gepatchten Neurons. Die Ganzzellkonfiguration wurde durch das automatische Patching-Protokoll in den Schritten 2.5 - 2.6 erreicht und wurde durch stufenstrominduzierungsinduzierte Aktionspotentiale validiert ( Abbildung 3c ) 1 &quot;&gt; Um die zusätzliche&quot; Command Sequence &quot;-Funktion zu demonstrieren, haben wir 500 mM KCl für 200 ms an drei Stellen auf einer Hirnscheibe geliefert, während wir eine Zelle patchten ( Abbildung 4 ). Zuerst haben wir 3 Standorte auf der Gehirnscheibe ausgewählt: eine enge Die Koordinaten wurden in die &quot;Command Sequence&quot; GUI unter &quot;Unit1&quot; geladen, was der Manipulator war, dass die KCl- Es wurden die Befehle in die linke Spalte gesetzt, um ein + 5-V-TTL-Signal für 500 ms zu senden, gefolgt von 0 V für 10 s ( Abbildung 4a ) von Port A-Kanal 0 auf der sekundären DAQ-Platine, Die mit dem Digitizer &quot;start trigger&quot; -Eingang verbunden war, Abbildung 4c zeigt, dass die gepatchte Zelle ein regelmäßiges Spiking-Neuron war. Die Drogenanwendungspipette (Einheit 1) durchquerte die drei ausgewählten Orte aUtomatisch ( Abbildung 4b ), und wir haben 10 s für jede Anwendung unter Spannungsklemme aufgezeichnet ( Abbildung 4d ). Die Farbe der Spuren in Fig. 4d entspricht der Randfarbe in Fig. 4b . Als KCl an der Zelle paffte, wurde ein großer nach innen gerichteter Strom beobachtet, der langsam abnahm, als KCl diffundierte. Roter Fluoreszenzfarbstoff wurde der KCl-Lösung zugesetzt, um die räumliche Verteilung der Arzneimittelabgabe anzuzeigen, und wurde unter Verwendung von kombinierter DIC und epifluoreszierender Bildgebung abgebildet. Dieses Experiment verdeutlichte die Leichtigkeit und Flexibilität unseres Systems, um Manipulator / Mikroskop-Bewegung und externe Hardware durch TTL-Signale zu steuern. <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig1.jpg" /> Abbildung 1. Druckregelgerät. A: Leiterplatte (Leiterplatte) zum Anschluss der Ventile, DruckSensor und Luftpumpe. Die linke zeigt Details auf der Leiterplatte, Etikettierung von Ausgängen, die im Protokoll erwähnt werden. Das Recht zeigt die Verbindung zwischen der Platine und der Luftpumpe, dem USB-Port und dem Schlauch. B: Schaltplan für die Leiterplatte. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56010/56010fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig2.jpg" /> Abbildung 2. Autopatcher-GUI. Die im Protokoll erwähnten Tasten sind in roten Quadraten dargestellt und nummeriert. 1: Kalibrierung starten, 2: Kalibrierung speichern, 3: Kalibrierung laden, 4: Sekundäre Kalibrierung, 5: Erkennung der Zelle, 6: Patch-Steuerung, 7: Gehen Sie zu (Zielzellenkoordinate) und 8: Patch. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56010/56010fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen</a>. <img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ein Beispiel für die gepatchte ChR2-YFP-positive Zelle. A: 40fache Vergrößerung unter DIC-Optik. B: Epifluoreszenzbild der gleichen Zelle im Panel A (LED-Beleuchtung bei 488 nm). C: Strom-Clamp-Aufnahmen aus der gepatchten Zelle während einer Reihe von hyperpolarisierenden und depolarisierenden Stufenstrom-Injektionen. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56010/56010fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig4.jpg" /> Abbildung 4. Durchführung eines automatisierten Drug Delivery Experiments. A: Ausgewählte Orte, die in die GUI &quot;Command Sequence&quot; geladen wurden. Die linke Spalte zeigtDie Liste der Koordinaten und die rechte Spalte zeigt die Liste der Befehle in Form von TTL-Signalen für jeden Standort an. B: Screenshots während des Medikamentenanwendungsexperiments entsprechend den drei ausgewählten Orten. Einheit 1 war die KCl-haltige Pipette und Einheit 2 war die Patchpipette. KCl-Lösung wurde zum Zwecke der Visualisierung mit rotem Fluoreszenzfarbstoff gemischt. Bilder wurden durch Kombination von DIC und Fluoreszenzbildgebung erhalten. C: Schrittstrom-Injektionen, die ein regelmäßiges Spiking-Neuron zeigen. D: Spannungsklemmenaufzeichnungsspuren aus der lokalen Applikation von 500 mM KCl-Lösung an drei Standorten. Die rote Spur mit nach innen gerichtetem Strom wurde aus dem Versuch aufgezeichnet, als die KCl-Anwendung nahe der gepatchten Zelle war. Der rote Pfeil zeigt den Zeitpunkt der KCl-Anwendung an. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56010/56010fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1"Fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-with-next.within-page = &quot;immer&quot;&gt; <tbody><tr><td> Steckdose auf der Leiterplatte </td><td> Portname auf dem DAQ-Board </td><td> Port # auf DAQ-Board </td><td> Anmerkung </td></tr><tr><td> DOUT V1 </td><td> Port A Kanal 1 </td><td> 22 </td><td> Steuerventil 1 </td></tr><tr><td> DOUT V2 </td><td> Port A Kanal 2 </td><td> 23 </td><td> Steuerventil 2 </td></tr><tr><td> DOUT P </td><td> Port A Kanal 3 </td><td> 24 </td><td> Luftpumpe einstellen </td></tr><tr><td> GR </td><td> Boden </td><td> 29 </td><td> Boden </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Leiterplatte (Leiterplatte) zur sekundären Datenerfassung (DAQ) -Konfiguration. Verwenden Sie diese Tabelle, um PCB-Ausgänge (erste Spalte von links) mit Ports auf der DAQ-Platine zu verbinden (zweite Spalte von links). Der Portname und die Nummer des sekundären DAQ beziehen sich auf den Single-Ended-Modus. <img alt="Tabelle 2" src="/files/ftp_upload/56010/56010table2.jpg" /> Tabelle 2. Schlauchverbindungen vom Druckregelgerät zum Pipettenhalter (n). Für jede Verbindung verbinden Sie die entsprechenden Ports, die mit einem grauen Kasten markiert sind, mit weichen Schläuchen (siehe Tabelle der Materialien ).

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Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von automatischen bildgeführten Patch-Clamp-Experimenten mit einem System, das kürzlich für Standard- In-vitro- Elektrophysiologie-Geräte entwickelt wurde.

Anwendung von automatisierten Bild-geführten Patch-Clamp für die Studie von Neuronen in Gehirn-Scheiben

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Serie: Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent neuropsychiatric disorder that stems from the biophysical and cellular actions of nicotine on nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) throughout the central nervous system. Understanding the various nAChR subtypes that exist in brain areas relevant to nicotine addiction is a major priority.
Experiments that employ electrophysiology techniques such as whole-cell patch clamp or two-electrode voltage clamp recordings are useful for pharmacological characterization of nAChRs of interest. Cells expressing nAChRs, such as mammalian tissue culture cells or Xenopus laevis oocytes, are physically isolated and are therefore easily studied using the tools of modern pharmacology. Much progress has been made using these techniques, particularly when the target receptor was already known and ectopic expression was easily achieved. Often, however, it is necessary to study nAChRs in their native environment: in neurons within brain slices acutely harvested from laboratory mice or rats. For example, mice expressing "hypersensitive" nAChR subunits such as &alpha;4 L9&prime;A mice 1 and &alpha;6 L9&prime;S mice 2, allow for unambiguous identification of neurons based on their functional expression of a specific nAChR subunit. Although whole-cell patch clamp recordings from neurons in brain slices is routinely done by the skilled electrophysiologist, it is challenging to locally apply drugs such as acetylcholine or nicotine to the recorded cell within a brain slice. Dilution of drugs into the superfusate (bath application) is not rapidly reversible, and U-tube systems are not easily adapted to work with brain slices.
In this paper, we describe a method for rapidly applying nAChR-activating drugs to neurons recorded in adult mouse brain slices. Standard whole-cell recordings are made from neurons in slices, and a second micropipette filled with a drug of interest is maneuvered into position near the recorded cell. An injection of pressurized air or inert nitrogen into the drug-filled pipette causes a small amount of drug solution to be ejected from the pipette onto the recorded cell. Using this method, nAChR-mediated currents are able to be resolved with millisecond accuracy. Drug application times can easily be varied, and the drug-filled pipette can be retracted and replaced with a new pipette, allowing for concentration-response curves to be created for a single neuron. Although described in the context of nAChR neurobiology, this technique should be useful for studying many types of ligand-gated ion channels or receptors in neurons from brain slices.

In this paper, we describe a useful method to study ligand-gated ion channel function in neurons of acutely isolated brain slices. This method involves the use of a drug-filled micropipette for local application of drugs to neurons recorded using standard patch clamp techniques.

Lokale Anwendung von Medikamenten zur nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Hirnschnitten Studie

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Forschung

Neurowissenschaften

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze motor-learning induced plasticity, we trained rats using an accelerated rotor rod task. Rats performed the task 10 times at 30-s intervals for 1 or 2 days. Performance was significantly improved on the training days compared to the first trial. We then prepared acute brain slices of the primary motor cortex (M1) in untrained and trained rats. Current-clamp analysis showed dynamic changes in resting membrane potential, spike threshold, afterhyperpolarization, and membrane resistance in layer II/III pyramidal neurons. Current injection induced many more spikes in 2-day trained rats than in untrained controls.
To analyze contextual-learning induced plasticity, we trained rats using an inhibitory avoidance (IA) task. After experiencing foot-shock in the dark side of a box, the rats learned to avoid it, staying in the lighted side. We prepared acute hippocampal slices from untrained, IA-trained, unpaired, and walk-through rats. Voltage-clamp analysis was used to sequentially record miniature excitatory and inhibitory postsynaptic currents (mEPSCs and mIPSCs) from the same CA1 neuron. We found different mean mEPSC and mIPSC amplitudes in each CA1 neuron, suggesting that each neuron had different postsynaptic strengths at its excitatory and inhibitory synapses. Moreover, compared with untrained controls, IA-trained rats had higher mEPSC and mIPSC amplitudes, with broad diversity. These results suggested that contextual learning creates postsynaptic diversity in both excitatory and inhibitory synapses at each CA1 neuron.
AMPA or GABAA receptors seemed to mediate the postsynaptic currents, since bath treatment with CNQX or bicuculline blocked the mEPSC or mIPSC events, respectively. This technique can be used to study different types of learning in other regions, such as the sensory cortex and amygdala.

The slice patch clamp technique is an effective method for analyzing learning-induced changes in the intrinsic properties and plasticity of excitatory or inhibitory synapses.

Slice-Patch-Clamp-Technik für die Analyse von Learning-induzierte Plastizität

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in the anteroventral periventricular nucleus and rostral periventricular nucleus, as well as the arcuate nucleus of the hypothalamus, project to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) neurons, among other cells. Previous studies have demonstrated that kisspeptin signaling occurs through the Kiss1 receptor (Kiss1r), ultimately exciting GnRH neuron activity. In humans and experimental animal models, kisspeptins are sufficient for inducing GnRH secretion and, consequently, luteinizing hormone (LH) and follicle stimulant hormone (FSH) release. Since kisspeptins play an essential role in reproductive functions, researchers are working to assess how the intrinsic activity of hypothalamic kisspeptin neurons contributes to reproduction-related actions and identify the primary neurotransmitters/neuromodulators capable of changing these properties. The whole-cell patch-clamp technique has become a valuable tool for investigating kisspeptin neuron activity in rodent cells. This experimental technique allows researchers to record and measure spontaneous excitatory and inhibitory ionic currents, resting membrane potential, action potential firing, and other electrophysiological properties of cell membranes. In the present study, crucial aspects of the whole-cell patch-clamp technique, known as electrophysiological measurements that define hypothalamic kisspeptin neurons, and a discussion of relevant issues about the technique, are reviewed.

Here, we present a protocol to perform a whole-cell patch-clamp on brain slices containing kisspeptin neurons, the primary modulator of gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) cells. By adding knowledge about kisspeptin neuron activity, this electrophysiological tool has served as the basis for significant advancements in the neuroendocrinology field over the last 20 years.

Hypothalamische Kisspeptin-Neurone als Ziel für Ganzzell-Patch-Clamp-Ableitungen

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...

Establishing a Whole-Cell Voltage-Clamp Configuration for Electrophysiological Recordings in Brain Slices

Source: Sunstrum, J. K., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/59461">Evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates positioning a fine-pointed pipette near brain slices, forming a seal with a neuronal cell. Suction breaks the cell membrane, thereby creating a whole-cell patch clamp that enables current measurements for electrophysiology experiments.

Etablierung einer Ganzzell-Voltage-Clamp-Konfiguration für elektrophysiologische Aufzeichnungen in Hirnschnitten

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Automated Image-Guided Patch Clamp Technique for Studying Neurons in Brain Slices

Source: Wu, Q., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56010">Application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices.</a> J. Vis. Exp. (2017).
In this video, brain slices are immobilized in a recording chamber, and cells of interest are located and focused on using a computer-controlled microscope. The automated image processing system then precisely positions a patch pipette to seal the cell membrane and monitor electrical signals.

Automatisierte bildgeführte Patch-Clamp-Technik zur Untersuchung von Neuronen in Hirnschnitten

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. System Setup

	Construct ...

Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices

Source: Qi, G., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52358">Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the procedure to map synaptic connections by securing a brain slice, positioning pipettes to achieve whole-cell configurations, and stimulating presynaptic neurons to record postsynaptic responses, thereby elucidating neuronal connectivity.

Gepaarte Patch-Clamp-Aufzeichnung der neuronalen Verbindungen in akuten Hirnschnitten

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Paired Patch-Clamp ...

Simultaneous Optical and Electrophysiological Monitoring of Neuronal Cells in Brain Slices

To place the multi-channel probe in the ex vivo brain tissue slide, perfuse bubbled experimental ACSF at three to six milliliters per minute, and transfer the brain slice containing the area of interest onto the mesh grid in the microscope perfusion chamber. Anchor the brain slice with a platinum harp. Rotate the mesh grid so that the line of electrode contacts on the distal end of the multichannel probe is approximately perpendicular to the PL surface.
Under broad-field illumination and fine control of the micromanipulator, lower the multichannel probe toward the surface of the slice. Engage the appropriate filter cube for visualization of the fluorescent reporter protein expressed in axon terminals of cortical afferents.
If necessary, rotate the slice to more precisely align the probe with the PL surface. Position the probe just above the plane of the slice, 200 micrometers short of the final target position along the x-axis, leaving at least one channel outside of the area of tissue being recorded. Slowly, insert the probe into the slice along its longitudinal axis.
To minimize damage to the tissue, only advance the probe to the extent that the sharp tips are just visible below the tissue surface. Switch experimental ACSF source to bagged control solution, and identify the fluorescently labeled cell for targeted patch-clamp recording. Restrict the aperture to the smallest diameter, and engage the high-power water-immersion objective, taking care to avoid contact between the multichannel probe and objective lens. Bring the tissue into focus.
Center the light over an area of tissue adjacent to, but not overlapping the multi-channel probe. Engage the appropriate filter set to allow imaging of cells expressing the Cre-dependent fluorescent marker. Raise the objective lens to create ample space for lowering a patch pipette.
Load a patch pipette with internal solution and mounted on the electrode holder. Use a one-milliliter syringe to apply positive pressure corresponding to approximately 0.1 milliliter air. Lower the patch pipette into the solution, bringing the tip into focus under visual guidance, and obtain whole-cell recording from the targeted cell.