Name: slice patch clamp technique for analyzing learning-induced plasticity
Uploaded: 2017-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity at JoVE.com

Wir möchten Dr. Paw-Min-Thein-Oo, Dr. Han-Thiri-Zin und Frau H. Tsurutani für ihre technische Unterstützung zu danken. Dieses Projekt wurde unterstützt von Grants-in-Aid für junge Wissenschaftler (h.k. und YS), wissenschaftliche Forschung B (d.m.), wissenschaftliche Forschung C (d.m.) und in innovativen Bereichen (d.m.), aus dem Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft, wissenschaftliche Forschung und Technologie von Japan.

alle Tierhaltung und chirurgische Eingriffe wurden entsprechend den Richtlinien für Tier Experimente von Yamaguchi University School of Medicine und wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der Yamaguchi genehmigt Universität.
 1. Tiere <ol><li>verwenden Sie 4 bis 5 Wochen alten männliche Sprague-Dawley Ratten (postnatale 28 bis 31 Tage alt).</li>
	<li>Haus unter einem 12-h-hell/dunkel-Zyklus die Ratten im einzelnen Kunststoffkäfige (40 cm × 25 cm × 25 cm) auf eine konstante Temperatur (23 ° C ± 1 ° C) gehalten. Ratten Ad Libitum Zugang zu Wasser und Nahrung zu geben.</li>
</ol> 2. Rotor-Stab-Test <ol><li>, motorische Fähigkeiten erlernen, die Rotor-Stab-Test unterziehen jede Ratte zu untersuchen (Stabdurchmesser 7 cm; Spurbreite 8,9 cm; Fallhöhe 26,7 cm) für 1 oder 2 aufeinander folgenden Tagen ( Abbildung 1A in Kida Et Al., 2016 7). Führen Sie die Aufgabe, in einem ruhigen, klimatisierten Raum (23 ± 1 ° C). Nicht stören oder Ratten vor dem Test zu behandeln</li>
	<li>Festlegen den Rotor Stab Beschleunigungsmodus, die linear von 4 Umdrehungen/min bis 40 Umdrehungen/min (8 π/min bis 80 π/min) in 5 min. erhöht</li>
	<li>Setzen die Ratte auf dem ruhenden rotierenden Stab. Bestätigen, dass alle Glieder auf dem Stab sind.</li>
	<li>Messen die Latenz vom rotierenden Stab auszuwertende Motorleistung fallen.</li>
	<li>Erlauben jede Ratte 10 Versuche (Studien) mit 30-s-Takt.</li>
	<li>Wenn die Ratte vom rotierenden Stab fällt, setzen Sie ihn auf den Stab wieder nach 10-20 s Pause.</li>
	<li>Opfern die Ratte mit einer Überdosis von Pentobarbital (400 mg/kg) 30 min nach dem letzten Versuch. Injizieren ungeschulten Kontrolle Ratten mit der gleichen Dosis der Anästhesie in ihrer Heimat Käfigen.</li>
</ol> 3. Hemmenden Vermeidung Test <ol><li>, kontextbezogenen Lernens untersuchen Thema Ratten zu einem hemmenden Vermeidung (IA)-Test ( Abbildung 1 in Mitsushima Et Al., 2011, 2013 10 , 11) vermeiden Sie Kontakt mit anderen, Käfig Änderungen oder Reinigung keine episodischen Erfahrungen am Tag des Experiments wie. Führen Sie die Aufgabe in einem ruhigen, klimatisierten Raum (23 ± 1 ° C). 
	Hinweis: Der IA-Training-Apparat ist ein zwei-Kammern-Acryl-Box (Länge 33 cm; breite 58 cm; Höhe 33 cm). Es verfügt über einen beleuchteten sicheren Seite und eine dunkle Schock-Seite, die durch eine Falltür ( Abbildung 1) voneinander getrennt sind.</li>
	<li>Legen Sie die Ratte in der sicheren (beleuchteten) Seite der beleuchteten Box. Die Ratte sanft ohne Stress zu behandeln.</li>
	<li>Warten Sie kurze Zeit (10 bis 20 s), die Ratte an die Umgebung gewöhnen.</li>
	<li>Öffnen Sie die Schiebetür um die Ratte, die dunkle Box nach Belieben zu ermöglichen.</li>
	<li>Messen die Latenz (s), bevor die Ratte die neuartige dunkle Seite der Box betritt. Die Latenz des ersten Versuchs stellt die Ratte &#39; s Leistung vor dem Training.</li>
	<li>Nach Eintritt in die dunkle Seite, schließen Sie die Tür und wenden Sie einen verschlüsselte elektrische Fuß Schock (2 s, 1,6 mA) über elektrische Stahlstangen, die in den Boden des Kastens gesetzt. Lassen Sie begehbare Ratten, die TrainergerГ für 1 min ohne schockiert zu erkunden. Haus ungepaarte Ratten in einem beleuchteten Schock-Käfig für mehrere geben Tage und plötzlich die Schock ohne episodische Erlebnisse. Handhaben Sie vorsichtig ohne Stress in allen Gruppen.</li>
	<li>Halten Sie jede Ratte in den dunklen Kasten für 10 s vor der Rückgabe an die Heimat Käfig.</li>
	<li>Bei 30 min nach dem Fuß Schock wieder Platz die Ratte in die beleuchtete Seite des Feldes. Messen Sie die Wartezeit um die dunkle Seite zu gelangen.</li>
	<li>Die Ratte zu Hause Käfig zurück.</li>
	<li>Bei 60 min nach dem Schock, Opfern die Ratte mit einer Überdosis von Pentobarbital (400 mg/kg). Die Ratte schonend zu behandeln und die Narkose intraperitoneale Injektion. Bei ungeübten Kontrolle Ratten, injizieren die Narkose in ihrer Heimat Käfigen ohne die oben beschriebene Erfahrung.</li>
</ol> 4. Dissektion Puffer <ol><li>Kristalle von 0,195 g NaH 2 PO 4-2 H 2 O, 0,188 g KCl 0,074 g CaCl 2, 1,423 g MgCl 2-6 H 2 O und 12,579 g Cholinchlorid Reinstwasser (900 mL, 950 mL) auflösen . Siehe Tabelle 1.</li>
	<li>Lösen sich die Kristalle von 4,500 g Glukose, 2,340 g Ascorbinsäure, 0,342 g Brenztraubensäure Säure Natriumsalz und 2,100 g Nahco3 3.</li>
	<li>Add Wasser bis 1000 mL. Das Spektrum der Osmolalität werden zwischen 290 mOsm/L und 300 mOsm/L. Adjust Osmolalität durch Zugabe von hochreinem Wasser, wenn es über den Bereich ist.</li>
	<li>Bubble-die Lösung mit 5 % CO 2 / 95 % O 2 Gasgemisch bei eiskalten Temperaturen für 5 min vor Gebrauch.</li>
</ol> 5. Künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) <ol><li>lösen sich Kristalle von 0,186 g KCl, 6,700 g NaCl, und 0,156 g NaH 2 PO 4-2 H 2 O Reinstwasser (900 mL, 950 mL). Siehe Tabelle 2.</li>
	<li>Blase mit dem Gasgemisch für 5 min.</li>
	<li>Lösen sich die Kristalle von 1,800 g Glukose und 2,184 g Nahco3 3 und fügen Sie dann 4 mL MgCl 2 und 4 mL CaCl 2 von 1 M auf Lager Lösungen.</li>
	<li>Add Wasser bis 1000 mL. Das Spektrum der Osmolalität werden zwischen 290 mOsm/L und 295 mOsm/L. Adjust Osmolalität durch Zugabe von hochreinem Wasser, wenn es über den Bereich ist.</li>
	<li>Blase mit Gas Mischung vor dem Gebrauch.</li>
</ol> 6. Intrazelluläre Lösungen <ol><li>für Strom-Clamp Aufnahmen (Tabelle 3), lösen Sie 0,0746 g KCl, 6,089 g K-Gluconat, 0,476 g HEPES, 0,0456 g EGTA und 500 µL MgCl 2 von 1 M auf Lager in Reinstwasser 180 mL Lösung (pH-Wert auf 7.2 mit KOH anpassen).
	<ol><li>0,4408 g Na 2 - ATP, 0,0418 g Na 3 - GTP und 0,510 g Na-Phosphokreatin hinzufügen. 200 mL Wasser hinzu und passen Sie den pH-Wert auf 7,35 mit KOH.</li>
		<li>Einstellen Die Osmolalität auf rund 290 mOsm/L durch Zugabe von Reinstwasser.</li>
		<li>Store als 1-mL-aliquoten in den Gefrierschrank (-30 ° C).</li>
	</ol></li> <li>Für Voltage-Clamp-Aufnahmen (Tabelle 4), lösen Sie 5,244 g CsMeSO 3, 0,672 g CsCl, 0,476 g HEPES, 0,0456 g EGTA und 500 µL MgCl 2 von 1 M auf Lager Lösungen in 180 mL Reinstwasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 7.2 mit CsOH. Verwenden Sie für mEPSP und mIPSP-Aufnahmen veränderte Konzentration von 5,814 g CsMeSO 3 und 0,252 g CsCl um die Umkehrung Potenzial der GABA-A Rezeptor Antwort 11 anzupassen.
	<ol><li>0,4408 g Na 2 - ATP, 0,0418 g Na 3 - GTP und 0,510 g Na-Phosphokreatin hinzufügen. 200 mL Wasser hinzu und passen Sie den pH-Wert auf 7,35 mit CsOH.</li>
		<li>Einstellen Die Osmolalität auf rund 290 mOsm/L durch Zugabe von Reinstwasser.</li>
		<li>Store als 1-mL-aliquoten in den Gefrierschrank (-30 ° C).</li>
	</ol></li></ol> 7. Vorbereitung in Scheiben schneiden <ol><li>Prior zu opfern, Cool-Down alle Dissektion Werkzeuge mit crushed Ice ( Abbildung 2A). Fügen Sie ca. 500 mL kaltem Wasser in den crushed-Ice-Container um die Kontaktfläche zu erhöhen. Dieses Vorgehen war zuvor 10 , 11 , 12. 
	Hinweis: Die Werkzeuge sind: große Schere, Iris-Schere, Spatel, ein Mikro Spatel, Zange, Pinzette, ein Edelstahl-200-mL-Becherglas, eine Klinge für Gehirn trimmen, eine kardiale Perfusion 120-mL-Spritze mit Dissektion Puffer behandelt das Gasgemisch gefüllt ein Silikonschlauch (20 cm) verbunden mit einer abgeflachten 18-Gauge-Nadel, eine rostfreie Gehirn Dissektion Bühne (Dicke = 3 mm, ϕ = 12 cm), und eine Montage-Bühne für die Vibratome (ϕ = 5 cm).</li>
	<li>Opfern die Ratte 30 min nach Abschluss der behavioralen Paradigmas durch betäuben sie mit einer Überdosis von Pentobarbital (400 mg/kg Körpergewicht). Führen Sie die Slice-Vorbereitung schnell um sicherzustellen, dass die Scheiben so gesund wie möglich 10 , 11 , 12 sind. Die Gehirn-extrAktion-Protokoll erfüllt alle tierärztlichen Standards für unsere Universität.</li>
	<li>Füllen Sie eine 120-mL-Spritze mit eiskalten Dissektion Puffer (Tabelle 1) sprudelte mit 5 % CO 2 / 95 % O 2 Gasgemisch. Entfernen Sie eventuell vorhandene Luftbläschen vor Perfusion.</li>
	<li>Nach Freilegung der Herzen, stechen Sie die Nadel in den hinteren Teil des linken Ventrikels.</li>
	<li>Perform Transcardial Durchblutung des Gehirns manuell mit der Spritze. Größere Ratten erfordern mehr Dissektion Puffer für Perfusion. Tauchen Sie das Gehirn mit eiskalten Dissektion Puffer für 5 min. Blase den Puffer kontinuierlich während der Überflutung.</li>
	<li>Trimmen die hintere Seite des Gehirns auf einen Winkel Parallel zu der dendritischen Ausrichtung der kortikalen Zielregion mit einer Klinge. Da das Gehirn ist auf der Dissektion Bühne mit abgeschnittenen Ende unten stehen, bestimmt der Anfangswinkel den Winkel des alle nachfolgenden Gehirnscheiben. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung ( Abb. 2 b). Ein falscher Winkel kann das Ziel pyramidale Neuronen durchschneiden. 
	Hinweis: Die Werkzeuge sind: eine Klinge zum Gehirn trimmen, ein Filterpapier (ϕ = 10 cm), Edelstahl Gehirn Dissektion Bühne (Dicke = 3 mm, ϕ = 12 cm), ein Spatel, ein Sekundenkleber, eine Pipette und eine Montage-Bühne für die Vibratome (ϕ = 5 cm).</li>
	<li>Schnitt 350 µm dicken koronalen Gehirnscheiben mit einem Vibratome. Füllung die Dissektion Kammer mit eiskalten Puffer mit 5 % CO 2 sprudelte / 95 % O 2 Gasgemisch ( Abbildung 2). Blase den Puffer ständig während der Gehirn-Scheibe.</li>
	<li>Die Peripherie des Zielbereichs mit Iris-Schere trimmen.</li>
	<li>Waschen die getrimmten Scheiben schonend bei Raumtemperatur ACFS mit 5 % CO 2 / 95 sprudelte % O 2 (Tabelle 2).</li>
	<li>Pflegen die getrimmte Scheiben in einer Schnittstelle-Kammer, bis die Aufzeichnung durchgeführt ( Abb. 2D und E). Inkubation für 1 h in der Kammer verbessert den Zustand der Zellen, sondern die Phänotypen ändern, wenn die Scheiben für mehr als 10 Stunden inkubiert werden. Schließen Sie den Deckel der Kammer zu umschließen die Gase und die kleine Flüssigkeit sinkt der ACFS.</li>
</ol> 8. Ganze Zelle Patch Clamp Hinweis: Whole-Cell Aufnahmen benötigen einen Verstärker und einen Tiefpass-Filter, die auf einem cutoff-Frequenz von 5 kHz eingestellt ist. Die Signale werden digitalisiert und auf einem PC gespeichert. Die gespeicherten Daten werden analysiert, offline ( Abb. 3A).
<ol><li>Erstellen Glaselektroden mit einem horizontalen Abzieher. Füllen Sie die Elektroden mit einer geeigneten Lösung (Tabellen 3 und 4) mit einer regelmäßigen Polyethylen 1-mL-Spritze an einer feinen Glasröhre und 0,22 µm Filter befestigt.</li>
	<li>Vor dem Kontakt mit der Zelle, positive Druck aufrechterhalten und die Pipette aktuelle auf Null einstellen.</li>
	<li>Nach der Bildung einer Gigaohm Dichtung, gelten Unterdruck zum Bruch der Zellmembran (ganz-Zell Konfiguration in Abbildung 3F).</li>
</ol> 9. Strom-Clamp Analyse <ol><li>Eigenschaften der Zellmembran <ol><li>füllen den Patch Aufnahme Pipetten mit der intrazellulären Lösung für Strom-Clamp Aufnahmen (Tabelle 3). Der Widerstand der Pipette ist zwischen 4 MΩ und 7 MΩ in der ACFS.</li>
		<li>Nachdem die Membran Brüche, halten Sie die Spannung der Membran bei-60 mV im V-CLAMP-Modus. Schalten von &#34; Bad &#34; Modus zu &#34; Zelle &#34; Modus in den Membran-Test mit Software zur Messung der intrinsischen Zelleneigenschaften wie Membran Kapazität, Widerstand und Zeitkonstante.</li>
	</ol></li> <li>Aktuelle Injektion Studie <ol><li>nach der Aufnahme der intrinsischen Zelleigenschaften, schalten Sie den Modus von V-CLAMP, TRACK (ich = 0) /I-CLAMP NORMAL für die Stromeinspeisung. Beachten Sie, dass das flüssige Verzweigung Potenzial sollte nicht korrigierten 10.</li>
		<li>Spritzen in die Zelle für 300 Ms. aktuelle ändern die Intensität des Stromes schrittweise aus &#8722; 100 pA PA +550 mit 50 pA erhöht. Die Anzahl der Spitzen (Aktionspotentiale) hervorgerufen durch die aktuelle Injektionen.</li>
		<li>Messen die minimale Spannung benötigt, um ein Aktionspotential auslösen (Dies ist die Schwellenspannung).</li>
		<li>Berechnen die Afterhyperpolarization Amplitude als die Differenz zwischen der Spannung bei der Initiierung von Spike und die niedrigste Spannung erreicht während Afterhyperpolarization 7.</li>
	</ol></li></ol> 10. Voltage-Clamp-Analyse <ol><li>The AMPA/NMDA-Verhältnis Hinweis: der AMPA/NMDA-Verhältnis ist konventionell auszuwertende postsynaptischen Plastizität bei glutamatergen exzitatorischen Synapsen 7 , 8 , 9 , 10 , 11. beachten Sie jedoch, dass damit einhergehende Anstieg der beiden Komponenten nicht das Verhältnis 13 ändern können.
	<ol><li>Perfuse die Aufnahme Kammer mit physiologischer Lösung mit dem Gasgemisch sprudelte und behalten Sie die Temperatur bei 22 ° C bis 25 ° c hinzufügen 0,1 mM Picrotoxin zur Lösung der GABA-A - vermittelte Reaktion und fügen Sie 4 µM 2 - block Chloroadenosine zur Stabilisierung der evozierten neuronale Antwort 14.</li>
		<li>Füllen den Patch Pipetten mit der intrazellulären Lösung für Spannung-Zange Aufnahme Aufnahmen (Tabelle 4). Überprüfen Sie den Widerstand der Aufnahme Pipette in der ACFS. Der Widerstand ist zwischen 4 MΩ und 7 MΩ.</li>
		<li>Für die Aufnahme in Layer II/III pyramidale Neuronen in der M1, legen Sie eine bipolare Wolfram Elektrode 200 µm bis 300 µm seitlich in die Zellen aufgenommen werden, unter der pial Oberfläche im Bereich der Vordergliedmaße Darstellung anregend (2 mm seitlich an der Mittellinie) 15 , 16 , 17.</li>
		<li>Für die Aufnahme in einem pyramidenförmigen CA1-Neuron, legen Sie die anregende Elektrode 200 µm bis 300 µm Lateral (Schaffer Sicherheiten Faser) oder Medial (Temporoammonic Weg) auf die Zellen, die aufgezeichnet ( Abb. 3 b).</li>
		<li>Erhöhen die Reizintensität bis die synaptischen Antwort &#62; 10 PA</li>
		<li>Berechnung der AMPA/NMDA-Verhältnis gemessen das Verhältnis von den Spitzenstrom in &#8722; 60 mV bis der Strom gemessen bei + 40 mV bei 150 ms nach dem Stimulus einsetzen. Beachten Sie, dass 50 bis 100 Spuren gemittelt werden sollte, um das Verhältnis zu berechnen.</li>
	</ol></li> <li>Miniatur postsynaptischen aktuelle Aufnahmen Hinweis: Miniatur exzitatorischen postsynaptischen Ströme (mEPSCs) werden gedacht, um die Reaktionen hervorgerufen durch die präsynaptischen Freisetzung eines einzigen Vesikels von Glutamat entsprechen 18 . Im Gegensatz dazu sind Miniatur inhibitorischen postsynaptischen Ströme (mIPSCs) gedacht, um die Reaktionen hervorgerufen durch die präsynaptischen Freisetzung eines einzigen Vesikels GABA 18 entsprechen. Anstieg der Amplituden der mEPSCs und mIPSCs reflektiert postsynaptischen Übertragung Stärkung während erhöht bei Frequenz steigt die Zahl der funktionalen Synapsen oder die präsynaptischen Freisetzung Wahrscheinlichkeit reflektieren 11 .
	<ol><li>Füllen Sie die Patch-Aufnahme-Pipette mit modifizierten intrazellulären Lösung (Tabelle 4) um die Umkehrung Potenzial der GABA-A Rezeptor-vermittelte aktuellen anzupassen,-60 mV.</li>
		<li>Add 0,5 µM Tetrodotoxin zum Bad, spontan Aktionspotentiale blockieren.</li>
		<li>Halten die Spannung bei-60 mV bis rECORD mEPSC Veranstaltungen für 5 min.</li>
		<li>Änderung im Betrieb möglichen auf 0 mV bis Rekord mIPSC Veranstaltungen für 5 Minuten. Da M1 Neuronen etwas höheren Umkehrung Potenzial für AMPA-Rezeptor-vermittelten Strömungen zeigen, die mIPSCs von M1 Neuronen werden aufgezeichnet, bei + 15 mV mit 0,1 mM APV.</li>
		<li>Warten Sie einige Minuten, bis der Strom zu stabilisieren.</li>
		<li>Protokollieren Sie die mIPSC-Ereignisse für 5 min.</li>
		<li>Die Miniatur-Ereignisse mit Hilfe der Software zu erkennen und Ereignisse über 10 pA für die Analyse verwenden. Die Anzahl der mEPSCs oder mIPSCs Veranstaltungen für 5 min um die Frequenz zu bestimmen. Durchschnitt der Amplituden der Ereignisse um die durchschnittliche Amplitude zu erhalten.</li>
		<li>Bestätigen, ob Bad Behandlung mit 10 µM CNQX oder 10 µM Bicuculline Methiodide der Ereignisse mEPSCs und mIPSCs bzw. blockiert.</li>
	</ol></li> <li>Paired-Pulse Analyse Hinweis: präsynaptischen Plastizität gepaart-Puls-Analyse analysiert werden kann. Eine Erhöhung der gepaart Puls schlägt einen Rückgang der präsynaptischen Glutamat oder GABA release Wahrscheinlichkeit 7 , 10 , 11.
	<ol><li>Exzitatorische Synapsen zu analysieren, 0,1 mM Picrotoxin hinzufügen und notieren die Antwort bei-60 mV. Obwohl wir das Bad 4 µM 2-Chloroadenosine hinzugefügt haben, müssen wir daran denken, dass das Medikament wirkt sich auf die präsynaptischen Freisetzung Wahrscheinlichkeit 14.</li>
		<li>Hemmende Synapsen, analysieren das Bad 0,1 mM APV und 4 µM 2-Chloroadenosine hinzu und notieren Sie die Antwort bei 0 mV. In M1 Neuronen aufnehmen die Antwort bei + 15 mV.</li>
		<li>Anwenden von gekoppelten Impulse mit einem inter-Stimulus-Intervall von 100 ms oder 200 ms.</li>
		<li>50-100 sequentielle Spuren im jeweils möglichen aufzeichnen und die Durchschnittswerte.</li>
		<li>Berechnen die gepaarten Puls-Verhältnis als das Verhältnis des zweiten Gipfels zum ersten Gipfel des postsynaptischen Stroms.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres.">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).</li><li>Edwards, F. 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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte. Wir bestätigen, dass wir die Zeitschrift Position bezüglich der ethischen Veröffentlichung beteiligt habe, und wir bekräftigen, dass dieser Bericht in Übereinstimmung mit diesen Leitlinien steht. Die Geldgeber hatten keine Rolle in das Studiendesign, Datenerfassung oder Analyse, die Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.

Die größte Beschränkung der Slice-Patch-Clamp-Technik ist die Aufnahme im Slice-Vorbereitung, die nicht wiedergeben kann, was passiert, in Vivo. Obwohl in Vivo Strom-Clamp Analyse zuverlässiger ist, ist es technisch schwierig zu bewussten Tiere genügend Daten einholen. Da jedes pyramidale Neuron verschiedenen zelluläre Eigenschaften hat, braucht man eine ausreichende Anzahl von Zellen, Unterschiede in den Neuronen nach dem Training richtig zu analysieren. Darüber hinaus erfordert eine Analyse der Spannung-Clamp kontinuierliche medikamentöse Behandlung mit CNQX, APV oder Bicuculline zur Bestimmung der Art der postsynaptischen Antworten. Um die Miniatur-Reaktionen induziert durch eine einzelne Vesikel von Glutamat oder GABA zu analysieren, ist kontinuierlicher Behandlung mit Tetrodotoxin musste spontan Aktionspotentiale zu blockieren. Obwohl die neu entwickelte Multi-Photonen bildgebende Verfahren zur Analyse von morphologischer Veränderungen bei erregenden Synapsen19mächtig ist, wird eine kombinierte Patch-Clamp-Technik benötigt, um die Funktion der Synapsen in Vivozu analysieren. Derzeit ist es ziemlich schwierig, morphologische Veränderungen an den hemmenden Synapsen zu analysieren, da die meisten hemmende Synapsen keine Stacheln bilden. Zu diesem Zeitpunkt wäre die Scheibe Patch Clamp die am besten geeignete Technik zu Zelleigenschaften oder die Funktionen des exzitatorischen/hemmenden Synapsen bei trainierten Tieren zu analysieren.
Mit Strom-Clamp Analyse (Abbildung 4), haben wir vor kurzem berichtet motor Learning-induzierte intrinsischer Plastizität in Layer II/III Neuronen. Insbesondere die 1-Tages ausgebildete Ratten zeigten eine signifikante Abnahme der Membranpotential und einem Anstieg in der Spike-Schwelle ruhen. Die 2-Tages ausgebildete Ratten zeigte einen signifikanten Anstieg im ruhenden Membran-Potenzial, die zu erhöhter Erregbarkeit geführt. Diese Ergebnisse vorgeschlagen, dass es dynamische Veränderungen in der intrinsischen Plastizität des M1 Layer II/III Neuronen bei ausgebildeten Ratten waren. Zusätzliche Spannung-Clamp-Analyse ergab eine Zunahme des gepaart-Puls-Verhältnisses in 1-Tages ausgebildete Ratten, was darauf hindeutet, dass gab es ein vorübergehender Rückgang in der präsynaptischen GABA-Freisetzung Wahrscheinlichkeit7. Es ist daher möglich, dass Enthemmung von GABA in der Schicht II/III Synapsen die resultierende lernen-induzierte Plastizität im M1 auslösen könnte. Zur Unterstützung erfordert Slice Vorbereitung der M1 Bad Behandlung mit einem GABA-A Rezeptor Blocker, LTP20zu induzieren.
Analyse der Miniatur postsynaptischen Potenziale ist eine leistungsstarke Möglichkeit, synaptische Plastizität in IA ausgebildete Tiere zu erkennen. Sequentielle Erfassung von mEPSCs und mIPSCs in einem einzigen CA1 Neuron ermöglicht die Analyse der synaptischen exzitatorischen/hemmende Stärke jedes einzelnen Neuron. Seit einer einzigen mir (I) PSC Antwort ist zurückzuführen auf eine einzelne Vesikel von Glutamat oder GABA, eine Steigerung im mE (I) PSC Amplitude schlägt postsynaptischen Stärkung. Mit mir (I) PSC Analyse, fanden wir individuelle Unterschiede in der Stärke von exzitatorischen/inhibitorischen Eingang in jedes CA1-Neuron (Abbildung 5). IA-Training fördert die Vielfalt in der synaptischen Stärke eindeutig, aber dies wurde nicht beobachtet, in anderen Gruppen (Tabelle 5).
Lernen-induzierte synaptischen Vielfalt kann mathematisch analysiert werden. Durch die Erscheinung Wahrscheinlichkeit jedes Punktes berechnen, können Daten von jedem Neuron selbst-Entropie (bit) mit der Informationstheorie von Claude21umgewandelt werden. Ein Punkt mit hoher aussehen Wahrscheinlichkeit (rund um die mittlere Ebene) zeigt niedrigen Self-Entropie, während ein Punkt mit sehr seltenen Wahrscheinlichkeit (einem abgelenkten Punkt) hohen selbst-Entropie anzeigt. Verglichen mit ungeschulten Ratten, die selbst-Entropie pro Neuron war deutlich erhöht bei IA ausgebildete Ratten aber nicht im ungepaarten oder begehbare Ratten22. Dieser Analyse zufolge gab es eine Zunahme der Intra-CA1 Informationen nach dem kontextuellen lernen.
Die Slice-Patch-Clamp-Technik kann auch für abrufbereite Angst Konditionierung Studien in der lateralen Amygdala9 und Sinneserfahrung Studien in der Barrel Cortex8verwendet werden. Darüber hinaus kann diese Technik mit verschiedenen anderen Techniken für weitere Untersuchungen verwendet werden. Zum Beispiel das Virus-vermittelten grün fluoreszierende Protein (GFP)-tagged gen Lieferung Technik ist kombinierbar mit der Patch-Clamp-Technik, die Funktion von bestimmten Molekülen zu analysieren. Darüber hinaus kann fokale Mikroinjektion eine retrograde Tracer verwendet werden, um spezifischen Neuronen das Projekt auf einen bestimmten Bereich zu visualisieren. Dann können mit der Strom-Clamp-Technik, Zelle-spezifische Eigenschaften in der visualisierten Neuronen23analysiert werden. Weiter, hat kombiniert zwei-Photon Laserscanning-Mikroskopie mit zwei-Photonen-Laser uncaging Glutamat verwendet worden, zu zeigen, dass die Wirbelsäule-spezifische Wachstum und der EPSC Reaktion in Maus kortikalen Schicht II/III pyramidale Neuronen19. So wird der Slice-Patch-Clamp-Technik durch die Kombination mit neuartiger Chemikalien, gen Lieferung und Foto-Manipulation-Techniken verbessert.

Die Patch-Clamp-Technik, entwickelt von Neher und Sakmann, hat seit Elektrophysiologische Experimente1verbreitet. Die ganze Zelle Patch Clamp Technik2 kann zur intrazellulären Strom oder Spannung mit Gigaohm Siegel der Zellmembran aufnehmen. Die Strom-Clamp-Technik ermöglicht es uns, Unterschiede in den Eigenschaften der Membran wie ruhen Potential, Widerstand und Kapazität3zu analysieren. Die Voltage-Clamp-Technik ermöglicht es uns, lernen-induzierte synaptische Plastizität an erregenden und hemmenden Synapsen zu analysieren.
Der primäre motorische Kortex (M1) ist eine zentrale Region, die für qualifizierte Freiwillige Bewegungen von entscheidender Bedeutung ist. Elektrophysiologische Studien zeigte die Entwicklung der Langzeitpotenzierung (LTP)-wie Plastizität in Layer II/III exzitatorischen nach qualifizierten motor Training4 Synapsen. Darüber hinaus demonstriert in Vivo Bildgebungsstudien weiter der Umbau des M1 dendritischen Dornen nach einem qualifizierten reichende Aufgabe5,6. Lernen-induzierte synaptischen und intrinsischer Plastizität hat sich jedoch nicht in M1 Neuronen gezeigt.
Wir berichteten kürzlich, dass eine Rotor Stab Aufgabe dynamische Veränderungen der glutamatergen gefördert und GABAergen Synapsen und verändert die intrinsische Plastizität in M1 Layer II/III-Neuronen-7. Hier haben wir die Slice-Patch-Clamp-Technik um zu lernen-induzierte Plastizität zu untersuchen. Diese Technik kann auch verwendet werden, um andere Arten von Erfahrung-abhängigen Plastizität in anderen Gehirnregionen zu untersuchen. Z. B. sensorischer Input in die Fass-Rinde kann AMPA-Rezeptor-vermittelten exzitatorischen Input in Layer II/III Neuronen8stärken und wartenden Angst Klimaanlage stärkt die erregenden Eingänge auf der lateralen Amygdala Neuronen, die ist erforderlich für fürchten Sie Speicher9. Darüber hinaus schafft kontextuellen Lernens Vielfalt in Bezug auf die erregenden und hemmenden Synapsen Eingang in hippocampalen CA1 Neuronen10,11.

<table><tbody><tr><td>Rota-Rod Treadmills</td><td>Med Associates Inc.</td><td>ENV577</td><td></td></tr><tr><td>inhibitory avoidance box</td><td>Shinano Seisakusho</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Nisshin EM Co., Ltd</td><td>LC05Z</td><td></td></tr><tr><td>Cardiac perfusion syringe</td><td>JMS Co., Ltd</td><td>JS-S00S</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>&amp;nbsp;Leica Microsystems</td><td>VT-1200</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>Model P97</td><td></td></tr><tr><td>Microfilm 34 gauge</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch&amp;ndash;1D amplifier&amp;nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440 AD board</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10 software</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upright Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Olympus</td><td>U-CMAD3</td><td></td></tr><tr><td>Camera controller</td><td>Hamamatsu Photonics K.K.</td><td>C2741</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>Nihon Kohden</td><td>SEN-3301</td><td></td></tr><tr><td>Isolator</td><td>Nihon Kohden</td><td>SS-104J</td><td></td></tr><tr><td>Motorized manipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>NMN-21</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump&amp;nbsp;</td><td>Gilson, Inc</td><td>MINIPULS&amp;reg; 3</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl electrode&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>EP4</td><td></td></tr><tr><td>Slice Anchor</td><td>Warner instruments</td><td>64-0252</td><td></td></tr><tr><td>Stimulus electrode</td><td>Unique Medical Co., Ltd</td><td>KU201-025B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection buffer/&lt;br/&gt; artificial CSF&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;bull; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;bull; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Choline chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>190-01255</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid Na</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>199-03062</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>28-1850-5</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>07-0680-5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Intracellular solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K-Gluconate</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>346-01373</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>348-01311</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ATP</td><td>Nacalai Tesque</td><td>01072-24</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; GTP</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>G-8877</td><td></td></tr><tr><td>Na phosphocreatine</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>P-7936</td><td></td></tr><tr><td>CsMeSO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>033-01953</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Drugs in aCSF&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Chloroadenosine</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C5134</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>P-1675</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>207-15901</td><td></td></tr><tr><td>CNQX&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C239</td><td></td></tr><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>A5282</td><td></td></tr></tbody></table>

slice patch clamp technique for analyzing learning-induced plasticity

Die Slice-Patch-Clamp-Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von lernen-induzierte neuronale Plastizität in bestimmten Gehirnregionen. Um Motor-Learning induzierte Plastizität zu analysieren, haben wir Ratten mit Hilfe einer beschleunigten Rotor Stab Aufgabe geschult. Ratten durchgeführt die Aufgabe 10 Mal im Abstand von 30-s für 1 oder 2 Tage. Leistung wurde an den Trainingstagen im Vergleich zu der ersten Studie deutlich verbessert. Dann haben wir akuten Hirnschnitten von den primären motorischen Kortex (M1) in ungeschulten und ausgebildete Ratten vorbereitet. Strom-Clamp-Analyse zeigten dynamischen Veränderungen im ruhenden Membranpotential, Spike Threshold, Afterhyperpolarization und Membran Widerstand in Layer II/III pyramidale Neuronen. Stromeinspeisung induzierte viele weitere Spitzen in der 2-Tages ausgebildete Ratten als ungeübte Kontrollen.
Um kontextbezogene-Learning induzierte Plastizität zu analysieren, haben wir Ratten mit Hilfe einer hemmenden Vermeidung (IA) Aufgabe geschult. Nach der Erfahrung Fuß-Schock in die dunkle Seite der Schachtel, lernte die Ratten zu vermeiden, bleiben in der beleuchteten Seite. Wir bereiteten akute hippocampal Scheiben von ungeschulten, IA trainiert, ungepaarte und begehbare Ratten. Voltage-Clamp-Analyse wurde verwendet, um nacheinander Miniatur exzitatorischen und inhibitorischen postsynaptischen Ströme (mEPSCs und mIPSCs) von der gleichen CA1-Neuron aufzuzeichnen. Wir fanden verschiedene mittlere mEPSC und mIPSC Amplituden in jedes Neuron CA1 darauf hindeutet, dass jedes Neuron unterschiedliche postsynaptischen stärken an seinen erregenden und hemmenden Synapsen hatten. Darüber hinaus hatte IA ausgebildete Ratten verglichen mit ungeschulten Kontrollen, höhere mEPSC und mIPSC Amplituden mit Vielfalt. Diese Ergebnisse vorgeschlagen, dass kontextuellen Lernens in erregenden und hemmenden Synapsen auf jedes Neuron CA1 postsynaptischen Vielfalt schafft.
AMPA oder GABA-A -Rezeptoren schien die postsynaptischen Ströme seit Bad Behandlung mit CNQX zu vermitteln oder Bicuculline blockiert bzw. die mEPSC oder mIPSC Ereignisse. Diese Technik kann verwendet werden, um verschiedene Arten des Lernens in anderen Regionen, wie dem sensorischen Cortex und die Amygdala zu studieren.

Wie wir vor kurzem7beschrieben, induziert Rotor Stab Ausbildung (Abbildung 1A) dynamische Veränderungen in der intrinsischen Plastizität der M1 Layer II/III pyramidalen Neuronen. Die Latenz zu messen, bis die Ratten aus den rotierenden Stab fallen ermöglicht es uns, die qualifizierte Lernleistung der Ratte zu schätzen. Längere Wartezeit bedeutet bessere Motorleistung. Am Tag 1 Training verbessert die Ratten Rotor Stab bis der Prozess beendet. Am 2. Tag, die Ratten erreicht fast asymptotische Ebenen in der gemittelten Sitzung punktet (Abbildung 1 b). Im Vergleich mit der Wartezeit bei der ersten Verhandlung, Post-hoc- Analyse zeigten signifikante Verbesserungen bei den abschließenden Prüfungen an den Trainingstagen (Abbildung 1).
Abbildung 4A zeigt ein Beispiel für Strom-Clamp-Analyse in der neuronalen Eigenschaften nach dem motorischen lernen geändert. Injektionen von 400 pA und 500 pA Strömungen waren nötig, um Aktionspotentiale in der ungeübte Gruppe und bei den 1-Tages ausgebildete Ratten, bzw. zu induzieren. Im Gegensatz dazu genügte Injektion nur eines 150 Pa aktuellen Aktionspotentiale in der 2-Tages ausgebildete Ratten zu entlocken. Abbildung 4 bzeigt die Beziehung zwischen der Stromstärke und der Anzahl der Aktionspotentiale. So wenig wie 50 pA aktuellen genügte, um Spitzen in der 2-Tages ausgebildete Ratten zu entlocken; im Gegensatz dazu reagiert 1 Tag ausgebildete Ratten mit weniger Aktionspotentiale als untrainierte Ratten auf 350 pA und höhere Ströme. Darüber hinaus Abbildung 4 zeigt, dass 1 Tag ausgebildete Ratten zeigten geringere ruht potential, höher spike Schwelle und tieferen Afterhyperpolarization, während 2-tägigen ausgebildete Ratten zeigte höhere Ruhepotential (Abbildung 4) und Widerstand () Membran Abbildung 4).
Wie wir bereits11beschrieben, induzierte IA Training (Abbildung 1) postsynaptischen Plastizität an erregenden und hemmenden Synapsen der hippocampalen CA1 Neuronen. Durch die Messung der Latenz im Lichtkasten, könnten wir die kontextbezogene Lernleistung der Ratte schätzen. Abbildung 1E zeigt die Ergebnisse der Aufgabe IA. Nach den gekoppelten elektrischen Schlag lernen die Ratten zu vermeiden die dunkle Seite des Kastens und bleiben in der beleuchteten Seite, die in der Regel nicht vorziehen würden. Die Tendenz, die dunkle Seite zu vermeiden zeigt daher die Übernahme von kontextuellen Erinnerungen.
Abbildung 5 zeigt ein Beispiel für Voltage-Clamp-Analyse in der Miniatur postsynaptischen Ströme nach kontextuellen Lernens drastisch geändert wurden. Zu untersuchen, lernen-induzierte Plastizität, spontane AMPA-vermittelten mEPSCs und GABA-A-vermittelten mIPSCs wurden nacheinander in Gegenwart von 0,5 µM Tetrodotoxin (Abb. 5A und B) aufgenommen. Wie gezeigt auf zweidimensionalen Flächen (Abbildung 5), hatte jedes Neuron CA1 unterschiedliche mittleren Amplituden für mEPSCs und mIPSCs. Obwohl die Amplituden niedrig waren und einen schmalen Verbreitungsgebiet in zeigte ungeübt, ungepaarten, und begehbare Ratten waren vielfältig in IA ausgebildete Ratten (Tabelle 5). ANOVA, gefolgt von Post-hoc- Analyse zeigte eine signifikante Zunahme der mittleren Amplituden der mEPSC und mIPSC in IA ausgebildete Ratten (Abb. 5E), was lernen-induzierte postsynaptischen Plastizität in den CA1-Neuronen.
Darüber hinaus stellte jedes Neuron CA1 verschiedene Frequenzen von mEPSC und mIPSC (Abbildung 5). Obwohl die Frequenzen niedrig waren und einen schmalen Verbreitungsgebiet in zeigte ungeübt, ungepaarten, und begehbare Ratten waren vielfältig in IA ausgebildete Ratten (Tabelle 6). ANOVA, gefolgt von Post-hoc- Analyse zeigte einen signifikanten Anstieg in den Frequenzen der mEPSC und mIPSC Ereignisse in IA ausgebildete Ratten (Abbildung 5F). Es gibt zwei mögliche Interpretationen dieser Ergebnisse. Die erste ist, dass kontextuellen Lernens die Anzahl der funktionellen Synapsen der Nervenzellen erhöht. Die andere ist, dass kontextuellen Lernens die Wahrscheinlichkeit der präsynaptischen Freisetzung von Glutamat und GABA erhöht.
Um präsynaptischen Plastizität weiter zu untersuchen, führten wir auch gepaart-Puls Stimulationen, wie bereits berichtet,10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig1v2.jpg"> 
Abbildung 1 : Lernleistung nach dem Training. 
A: das experimentelle Design zeigt den Rotor Stab Ausbildung und koronalen Gehirn-Scheibe. B: die mittlere Latenz von der Beschleunigung Rotor Stab Lauf fallen. C: die mittlere Wartezeit aus dem Stab auf den ersten und den letzten Studien zur Ausbildung Tage 1 und 27fallen. P&#60; 0,01 vs. erster Versuch. D: Schema der hemmenden Vermeidung (IA) Aufgabe und koronalen Gehirn Scheibe. E: die mittlere Wartezeit der dunklen Kasten vor und nach IA Training11eingeben. P&#60; 0,01 vs. vor IA Training. Die Zahlen von der koronalen Abschnitte zeigen den Abstand anterior Bregma in mm. Die Anzahl der Tiere ist an der Unterseite der Balken angezeigt. Fehlerbalken zeigen SEM <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55876/55876fig1v2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig2.jpg"> 
Abbildung 2 : Slice Verfahren. 
A: Fotografien zeigen die Vorbereitung der akuten Hirnschnitten. Die Dissektion Werkzeuge wurden in zerstoßenem Eis vor dem Gebrauch gekühlt. B: Gehirn-Dissektion und trimmen. Beachten Sie, dass der Winkel des Ausschnitts auf der hinteren Seite parallel mit der dendritischen Orientierung ausgerichtet werden muss. C: das Gehirn in einer Vibratome Kammer schneiden. Das Gehirn ist in Dissektion Puffer gebadet und sprudelte kontinuierlich mit einem 5 % CO295 % O2 Gasgemisch. D: eine Schnittstelle Kammer machte zwei Kunststoff Essen-Container und ein Silikonschlauch. Die Kammer war gefüllt mit künstlichen CSF und blubberte kontinuierlich mit dem Gasgemisch. E: Gehirnscheiben wurden auf nassen Filterpapier in die Kammer gelegt.Bar = 5 mm. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55876/55876fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig3.jpg"> 
Abbildung 3 : Patch-Clamp-Verfahren. 
A: der Patch-Clamp-System verwendet, um elektrische Signale von einer Nervenzelle zu erfassen. Die Lage der die anregende und Aufnahme von Elektroden in den Layer II/III-Neuronen sind im motorischen Kortex Ratte gezeigt. B: um die Schaffer Synapsen eines CA1 pyramidenförmigen Neurons zu analysieren, wurde eine anregende Elektrode an das Stratum Radiatum platziert. Um Temporoammonic Synapsen zu analysieren, wurde eine anregende Elektrode an das Stratum Moleculare gelegt. Vertreter der evozierten AMPA Spuren und NMDA-Rezeptor-vermittelten exzitatorischen postsynaptischen Ströme in der gleichen CA1 Nervenzelle dargestellt. C: ein Stück Anker wurde verwendet, um die Scheibe in der Aufnahme-Kammer zu stabilisieren. D: eine Darstellung Karte im motorischen Kortex, basierend auf den veröffentlichten Papiere15,16,17. ML = Mittellinie. E: IR-DIC Mikrographen M1 Schicht II/III-Neuronen vor (obere) und während der Aufnahme (niedriger). Bar = 10 µm. F: Änderungen in der Pipette aktuelle vor Touch (oben) und beim Membran Bruch (unten). <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55876/55876fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig4.jpg"> 
Abbildung 4 : Repräsentative Ergebnisse von Strom-Clamp Analyse7 . 
A: repräsentative Spuren von Aktionspotentialen aufgezeichnet nach Induktion mit aktuellen Injektionen. B: Beziehungen zwischen der mittlere Stromeingang (pA) vs. Aktionspotential Ausgabe (Anzahl der Spikes) in Hirnschnitten von ungeschulten (offene Balken), 1-Tages ausgebildete (graue Balken) und 2-Tages ausgebildete Ratten (gefüllte Balken). C: Resting Potential, Schwelle und Afterhyperpolarization der Schicht II/III-Neuronen. D: Membran und Serie Beständigkeit der Neuronen. Wir haben 9-10 Ratten in jeder Gruppe. Die Anzahl der Zellen wird innerhalb jeder Balken angezeigt. Fehlerbalken zeigen SEM *P&#60; 0,05, **P&#60; 0,01 vs. ungeschult. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55876/55876fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig5.jpg"> 
Abbildung 5 : Repräsentative Ergebnisse der Spannung-Clamp Analyse11 . Repräsentative Spuren der Miniatur exzitatorischen und inhibitorischen postsynaptischen Ströme (mEPSCs und mIPSCs) in ungeschulten (A) und hemmenden Vermeidung (IA)-Ratten (B) ausgebildet. mEPSCs bei-60 mV und mIPSCs bei 0 mV wurden nacheinander in der gleichen CA1 pyramidale Nervenzelle im Beisein von Tetrodotoxin (0,5 µM) gemessen. Vertikaler Balken = 20 pA, Reck = 200 msec. C: zweidimensionale Grundstücke des Mittelwerts mir (I) PSC Amplituden in ungeübt, IA ausgebildet, ungepaarten, und begehbare Ratten. D: zweidimensionale Darstellungen von mir (I) PSC Frequenzen in 4 Gruppen. Beachten Sie, dass jedes Neuron CA1 verschiedene ausgestellt bedeuten mir (I) PSC Amplituden und Frequenzen. IA Training verstärkt nicht nur die mittleren Amplituden (E), sondern auch die Frequenzen von mir (I) PSC Veranstaltungen (F). Wir haben 4-6 Ratten in jeder Gruppe. Die Anzahl der Zellen ist an der Unterseite der Balken angezeigt. Roten Pluszeichen (C, D) und Bars mit vertikalen Linien (E, F) zeigen den Mittelwert ± SEM. **P&#60; 0,01 vs. ungeschult Ratten. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55876/55876fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissektion Puffer (insgesamt 1L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 • 2 H2O</td>
			<td>0,195 g</td>
			<td>1,25 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0,188 g</td>
			<td>2,5 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>0,074 g</td>
			<td>0,5 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 • 6 H2O</td>
			<td>1,423 g</td>
			<td>7.0 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholinchlorid</td>
			<td>12,579 g</td>
			<td>90 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbinsäure</td>
			<td>2,340 g</td>
			<td>11.6 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brenztraubensäure Säure</td>
			<td>0,342 g</td>
			<td>3.1 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nahco33</td>
			<td>2,100 g</td>
			<td>25 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukose</td>
			<td>4,500 g</td>
			<td>25 Mmol/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Ein Rezept für eine Dissektion Puffer
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Künstliche CSF (insgesamt 1L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0,186 g</td>
			<td>2,5 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>6,700 g</td>
			<td>114.6 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 •2H2O</td>
			<td>0,156 g</td>
			<td>1 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukose</td>
			<td>1,800 g</td>
			<td>10 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nahco33</td>
			<td>2,184 g</td>
			<td>26 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>4 mL</td>
			<td>4 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>4 mL</td>
			<td>4 Mmol/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: Ein Rezept für künstliche Liquor cerebrospinalis (CSF)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">Intrazelluläre Lösung für Stromzange (insgesamt 200 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0,0746 g</td>
			<td>5 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Gluconat</td>
			<td>6,089 g</td>
			<td>130 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>0,476 g</td>
			<td>10 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>0,0456 g</td>
			<td>0,6 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>500 ΜL</td>
			<td>2,5 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2 ATP</td>
			<td>0,4408 g</td>
			<td>4 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3 GTP</td>
			<td>0,0418 g</td>
			<td>0,4 Mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Phosphokreatin</td>
			<td>0,510 g</td>
			<td>10 Mmol/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 3: Eine Rezept für eine intrazelluläre Lösung für Stromzange Aufnahme
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Intrazelluläre Lösung für Spannung Klemme (insgesamt 200 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsMeSO3</td>
			<td>5</td></tr></tbody></table>.244 g
			<td>(5.814) *</td>
			<td>115 Mmol/L</td>
			<td>(127,5) *</td>
		
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>0,672 g</td>
			<td>(0.252) *</td>
			<td>20 Mmol/L</td>
			<td>(7,5) *</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>0,476 g</td>
			<td></td>
			<td>10 Mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>0,0456 g</td>
			<td></td>
			<td>0,6 Mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>500 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>2,5 Mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2 ATP</td>
			<td>0,4408 g</td>
			<td></td>
			<td>4 Mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3 GTP</td>
			<td>0,0418 g</td>
			<td></td>
			<td>0,4 Mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Phosphokreatin</td>
			<td>0,510 g</td>
			<td></td>
			<td>10 Mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">* niedrige Konzentration der Cl– für Miniatur-Aufnahmen</td>
		</tr>
	

Tabelle 4: Eine Rezept für eine intrazelluläre Lösung für Spannung Klemme Aufnahme
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parameter</td>
			<td></td>
			<td>ungeübte</td>
			<td>IA ausgebildet</td>
			<td>ungepaarte</td>
			<td>Spaziergang durch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEPSC amplitude</td>
			<td>Varianz</td>
			<td>5.8</td>
			<td>32.1</td>
			<td>4.7</td>
			<td>5.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Standardabweichung</td>
			<td>2.4</td>
			<td>5.7</td>
			<td>2.2</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Variationskoeffizient</td>
			<td>0.189</td>
			<td>0.326</td>
			<td>0,177</td>
			<td>0.190</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIPSC amplitude</td>
			<td>Varianz</td>
			<td>17.1</td>
			<td>56,7</td>
			<td>31,8</td>
			<td>20,7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Standardabweichung</td>
			<td>4.1</td>
			<td>7.5</td>
			<td>5.6</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Variationskoeffizient</td>
			<td>0.279</td>
			<td>0.387</td>
			<td>0,367</td>
			<td>0.286</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 5: Die Vielfalt der Miniatur exzitatorischen und inhibitorischen postsynaptischen aktuelle (mEPSC und mIPSC) Amplituden in hemmenden Vermeidung (IA)-Ratten ausgebildet
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parameter</td>
			<td></td>
			<td>ungeübte</td>
			<td>IA ausgebildet</td>
			<td>ungepaarte</td>
			<td>Spaziergang durch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEPSC Frequenz</td>
			<td>Varianz</td>
			<td>278</td>
			<td>2195</td>
			<td>188</td>
			<td>195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Standardabweichung</td>
			<td>17</td>
			<td>47</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Variationskoeffizient</td>
			<td>0.902</td>
			<td>1.198</td>
			<td>0.893</td>
			<td>0.874</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIPSC Frequenz</td>
			<td>Varianz</td>
			<td>3282</td>
			<td>27212</td>
			<td>1385</td>
			<td>5135</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Standardabweichung</td>
			<td>57</td>
			<td>165</td>
			<td>37</td>
			<td>72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Variationskoeffizient</td>
			<td>1,195</td>
			<td>1,006</td>
			<td>0.955</td>
			<td>0.836</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 6: Die Vielfalt der Miniatur exzitatorischen und inhibitorischen postsynaptischen aktuelle (mEPSC und mIPSC) Frequenzen in hemmenden Vermeidung (IA)-Ratten ausgebildet

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Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Die Slice-Patch-Clamp-Technik ist eine wirksame Methode zur Analyse von lernen-induzierte Veränderungen der inhärenten Eigenschaften und Plastizität der erregenden oder hemmenden Synapsen.

Slice-Patch-Clamp-Technik für die Analyse von Learning-induzierte Plastizität

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

slice-patch-clamp-technique-for-analyzing-learning-induced-plasticity

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K Aufrufe.  Yamaguchi University Graduate School of Medicine. Die Slice-Patch-Clamp-Technik ist eine wirksame Methode zur Analyse von lernen-induzierte Veränderungen der inhärenten Eigenschaften und Plastizität der erregenden oder hemmenden Synapsen.

Serie: Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Forschung

Neurowissenschaften

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

Anwendung von automatisierten Bild-geführten Patch-Clamp für die Studie von Neuronen in Gehirn-Scheiben

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Biologie

Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of closed-head mTBI in the preclinical setting to increase translatability to the clinical population. The awake closed-headed injury (ACHI) model uses a modified controlled cortical impactor to deliver closed-headed injury, inducing clinically relevant behavioral deficits without the need for a craniotomy or the use of an anesthetic.
This technique does not normally induce fatalities, skull fractures, or brain bleeds, and is more consistent with being a mild injury. Indeed, the mild nature of the ACHI procedure makes it ideal for studies investigating repetitive mTBI (r-mTBI). Growing evidence indicates that r-mTBI can result in a cumulative injury that produces behavioral symptoms, neuropathological changes, and neurodegeneration. r-mTBI is common in youths playing sports, and these injuries occur during a period of robust synaptic reorganization and myelination, making the younger population particularly vulnerable to the long-term influences of r-mTBI.
Further, r-mTBI occurs in cases of intimate partner violence, a condition for which there are few objective screening measures. In these experiments, synaptic function was assessed in the hippocampus in juvenile rats that had experienced r-mTBI using the ACHI model. Following the injuries, a tissue slicer was utilized to make hippocampal slices to evaluate bidirectional synaptic plasticity in the hippocampus at either 1 or 7 days following the r-mTBI. Overall, the ACHI model provides researchers with an ecologically valid model to study changes in synaptic plasticity following mTBI and r-mTBI.

Here, it is demonstrated how an awake closed-head injury model can be used for examining the effects of repeated mild traumatic brain injury (r-mTBI) on synaptic plasticity in the hippocampus. The model replicates important features of r-mTBI in patients and is used in conjunction with in vitro electrophysiology.

Beurteilung von Veränderungen in der synaptischen Plastizität unter Verwendung eines wachen geschlossenen Kopfverletzungsmodells für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of ...

Patch Clamp Electrophysiology

Neuron cell membranes are populated with ion channels that control the movement of charge into and out of the cell, thereby regulating neuron firing. One extremely useful technique for investigating the biophysical properties of these channels is called patch clamp recording. In this method, neuroscientists place a polished glass micropipette against a cell and apply suction to form a high resistance seal. This process isolates a small &#8220;patch&#8221; of membrane that contains one or more ion channels. Using an electrode within the micropipette, researchers can &#8220;clamp&#8221; or control the electrical properties of the membrane, which is important for analysis of channel activity. The electrode also allows for changes in the voltage across the membrane, or the flow of ions through the membrane, to be recorded. This video begins with an overview of the principles behind patch clamp electrophysiology, an introduction to the necessary equipment, and descriptions of the various patch configurations, including whole cell, cell-attached, perforated, inside-out, and outside-out patches. Next, the key steps of a typical whole-cell patch clamp experiment are outlined, in which a current-voltage (IV) curve is generated. Finally, applications of patch clamp recording are provided to demonstrate how the biophysical properties of ion channels, cell excitability, and neuroactive compounds are evaluated in neurophysiology labs today.

Patch Clamp Electrophysiology: Principle &amp; Applications

Patch-Clamp-Elektrophysiologie

Neuron cell membranes are populated with ion channels that control the movement of charge into and out of the cell, thereby regulating neuron firing. One ...

Lehre

JoVE Science Education

Fortgeschrittene Biologie

Grundlagen der Neurowissenschaften

Patch Clamp

Many fundamental cell functions such as muscle contraction and nerve transmission rely on the electrical signals produced by the movement of positively and negatively charged ions across the cell membrane. One competent method to record current flowing across the whole cell or single ion channel is the patch-clamp technique.
In this method, a glass micropipette containing electrolyte solution is tightly sealed against a small portion of the cell membrane. As a result, a patch of the cell membrane is electrically isolated, ensuring that the ions moving across the channels flow only into the micropipette. Further, this tight sealing of the cell membrane prevents ions from escaping into the bath solution in which the cell is suspended.
Different Patch-clamp Methods:
Depending upon the research interest, several variations of the patch-clamp method can be used for measuring the cell&#39;s biophysical properties. For example, researchers can clamp or control the membrane voltage and measure the current passing through it. Alternatively, they can clamp the current and measure any variation in the membrane voltage.
In cell-attached mode, the membrane patch containing a single or a few ion channels remains intact. As a result, the current flowing through the membrane patch alone can be measured. In contrast, the whole-cell method involves disruption of the membrane patch by briefly applying strong suction. Consequently, the interior of the pipette becomes continuous with the cytoplasm. This mode enables the measurement of electrical current and voltage from the entire cell.
Another patch-clamp method requires gentle retraction of the attached pipette. As a result, the membrane patch is excised without affecting the tight seal. In this inside-out configuration, the intracellular portion of the membrane is exposed to the bath solution, allowing the study of intracellular factors affecting the channel functions.

Many fundamental cell functions such as muscle contraction and nerve transmission rely on the electrical signals produced by the movement of positively ...

JoVE Core

Zellbiologie

Unit 1

Kanäle und die elektrischen Eigenschaften von Membranen

SCHLÜSSELBEGRIFFE UND KONZEPTE

Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices

After preparing slices of the target region, allow them to incubate. During this time, pull the patch pipettes, which should have a long and slender shank. After securing a brain slice with a platinum harp in an experimental chamber, fill a recording pipette with internal solution.
Place the pipette in the preamplifier and patch a putative postsynaptic neuron in whole-cell mode. Using a searching patch pipette of 8 to 10 megaohm resistance filled with an internal solution in which potassium salts is replaced by sodium salts, apply gentle suction to the searching pipette to patch a potential presynaptic neuron in a loose-cell attached configuration.
Hold the membrane potential under the loose seal to between negative 30 and negative 60 millivolts in current clamp mode. Then, apply large current pulses of 0.2 to 2 nanoamps to elicit an action potential in the potential presynaptic cell.
Observe this action potential as a small spike lit on the voltage response. Set the stimulation frequency to 0.1 Hertz to prevent rundown of the postsynaptic response. If the postsynaptic neuron does not respond to stimulation of the tested potentially presynaptic neuron, patch a new potential presynaptic neuron in loose-seal mode.
Test up to 30 potentially presynaptic neurons in this way, continuing to use the same searching patch electrode as long as a seal with a resistance of greater than 30 megaohm can be established.
If stimulation in the loose-seal mode results in an EPSP or IPSP with a latency less than five milliseconds in the postsynaptic neuron, remove the searching pipette from the presynaptic neuron.
Using a recording patch electrode filled with biocytin containing regular internal solution with a resistance of four to eight megaohm, patch the presynaptic neuron and record in whole-cell current clamp mode. Elicit action potentials by current injection in the presynaptic neurons and record the postsynaptic response.

Gepaarte Patch-Clamp-Aufzeichnung der neuronalen Verbindungen in akuten Hirnschnitten

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

EoE Sub Articles

Automated Image-Guided Patch Clamp Technique for Studying Neurons in Brain Slices

In this step, place one brain slice in the center of the recording chamber. Stabilize the brain slice with a slice holdown or a harp. To detect the fluorescent cell, find the area of interest under the four times magnification. Then, move the microscope stage by turning on &#34;click-to-move&#34; mode, and click the center of the area of interest. Next, switch to the high magnification lens and adjust the focus by moving the microscope in the z-axis using RF on the keypad.
The software directs the microscope in the camera to take a series of images at different depths. Then, these images are subjected to computer vision processing to find fluorescently labeled cells. Click the Detect Cell button on the main column, unit zero. A list of cell coordinates will appear in the memory position&#39;s GUI. Remove undesired cells from the list by clicking the X button next to the coordinates.
Then, click on the cell of interest. A yellow dot with a number will appear on the cell, and the coordinates of the cell will appear in the memory position&#39;s GUI. To perform secondary calibration in order to detect pipette offset coordinates, fill one-third of a glass pipette with internal solution. Then, load the pipette onto the pipette holder attached to the head stage.
At low magnification, use one and two on the keypad to switch between unit one and unit two. Then, bring the pipette into the visual field and adjust the focus using the keypad.
Next, load the primary calibration by clicking on Load Calibration. Switch the microscope lens to high magnification, and click 40 times on the main GUI. Bring the pipette tip to the center. Then, click the secondary calibration button on the main GUI under the unit that is in use. To patch a target cell, click on the Patch Control button to open the patch control GUI. Click the Go To button next to the cell of interest on the coordinate list in the memory position GUI.
Subsequently, click on the CTM button of the unit in the main GUI to enable movement. Click on the cell of interest to move the pipette tip to the cell.
Next, use the Unit 1 Selected button to switch the input signal between the two units. Click on the Patch button on the patch control GUI. Automatic patching will begin, and the pressure and resistance can be monitored on the patch control GUI.
The automatic patching algorithm monitors resistance and controls pressure through a series of logic loops to form a gigaseal. A pop-up window notifies the formation of a gigaseal.
The system utilizes resistance change to recognize cell surface contact. In a situation that the cell surface contact is not detected in time, use the Next button to advance patching stage while remaining in the same automatic patching trial.
Manipulate the automatic process at any point by clicking on the respective buttons on the patch control GUI. Then, select Yes to break in with combined zap and suction. Then, save the experiment patch log.